周明芹

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州，434025)

SDS法和CTAB法提取蠟梅DNA質(zhì)量的比較

周明芹

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州，434025)

采集6個(gè)蠟梅(Chimonanthuspraecox(L.) Link.)單株的新鮮嫩葉，分別采用SDS和CTAB的微量法提取基因組DNA，取適量的該DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取的DNA在260 nm和280 nm的光密度值及比值，以及利用EcoR I和MseI雙酶切后進(jìn)行AFLP標(biāo)記。結(jié)果表明，2種方法均能從蠟梅中提取出一定量的比較完整且純度比較高的基因組DNA，但用CTAB法提取的蠟梅基因組DNA的純度更高、質(zhì)量更好。

蠟梅(Chimonanthuspraecox(L.) Link.)；DNA的提??；SDS；CTAB

蠟梅(Chimonanthuspraecox(L.) Link.)為蠟梅科蠟梅屬，是我國(guó)特有的名貴花木之一。冬令開花、黃冠晶瑩、清麗淡雅、花香沁人、色香形俱佳，為人們所鐘愛(ài)，是園林與庭院綠化、美化、香化以及室內(nèi)裝飾的名貴花木和特用經(jīng)濟(jì)樹種之一。同時(shí)，蠟梅品種頗多，適應(yīng)性強(qiáng)，分布和栽培廣泛。然而，關(guān)于蠟梅的研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的不多，特別是在分子領(lǐng)域的研究更少。本研究采用十二烷基磺酸鈉(SDS)和十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法分別提取了蠟梅的DNA，并對(duì)提取的DNA的質(zhì)量進(jìn)行比較分析，旨在為后續(xù)分子水平的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所采用的6個(gè)樣品的新鮮嫩葉均來(lái)源于長(zhǎng)江大學(xué)校園內(nèi)的蠟梅植株。

1.2 DNA的提取方法

(1)CTAB微量法 參照Loh等[1]的方法并加以改良來(lái)提取蠟梅葉片基因組DNA。具體步驟如下：①稱取0.2 g新鮮的嫩葉片，于液氮中研磨至粉末，迅速轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中；②加入800 μL 65 ℃預(yù)熱的2× CTAB提取液〔含有2%(w/v)CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、50 mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4 mol/L NaCl〕，65 ℃水浴45 min；③10 000 r/min離心12 min后，取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，冰上靜置10 min；④重復(fù)步驟②；⑤10 000 r/min離心12 min，取上清液，加入等體積的異丙醇于-20 ℃沉淀DNA 20 min；⑥10 000 r/min離心10 min，取沉淀，用75%的乙醇清洗沉淀3次，每次30 min；⑦用適量的TE溶解DNA，并加入5 μL RNaseA于37 ℃水浴30 min消化RNA；⑧加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次；⑨用2倍體積95%乙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉沉淀DNA；⑩用75%的乙醇清洗DNA 3次；自然干燥后，加100 μL的TE溶解DNA。

(2)SDS微量法 步驟同上述CTAB法，只是改用SDS的提取緩沖液(0.1 mol/L NaAc(pH5.2)、0.05 mol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl、2% PVP、1.4% SDS、0.5% β-巰基乙醇)，抽提時(shí)加入2/3體積2.5 mol/L KAc(pH4.8)，冰浴30 min。

1.3 DNA的質(zhì)量檢測(cè)

(1)取適量的DNA進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA是否降解，并以λDNAHindIII/EcoR I為參照，估計(jì)DNA的分子量大小。

(2)用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定適量稀釋的DNA樣品在波長(zhǎng)260、280 nm的光密度值D260、D280。利用D260計(jì)算DNA樣品的濃度、D260/D280評(píng)價(jià)DNA樣品的純度。

(3)取500 ng CTAB法提取的總DNA，用EcoR I和MseI進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA樣品的純度分析

表1 SDS和CTAB法提取蠟梅DNA的D260、D280值及D260/D280Table 1 The values of D260,D280 and D260/D280 of the genomicDNA from Chimonanthus praecox extracted by SDS and CTAB respectively

注：表中列出的光密度值為所得DNA總量的光密度值

采用6個(gè)品種(A～F號(hào)樣品)，用SDS和CTAB法分別提取其DNA，并且設(shè)置3個(gè)重復(fù)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得DNA的D260、D280值，并計(jì)算其D260/D280值。由表1可知，用CTAB法提取DNA的產(chǎn)率比采用SDS法要高許多，是SDS法的2～3倍；并且采用CTAB法提取DNA的D260/D280值相對(duì)較大，且多數(shù)在1.7與1.8之間，說(shuō)明CTAB法更適合蠟梅DNA的提取，不僅提取的DNA產(chǎn)率較高，而且純度也較高。

2.2 DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖1是采用CTAB法和SDS法提取的部分樣品DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜。從圖1可以看出，各個(gè)樣品均有一條單一的信號(hào)強(qiáng)的均勻一致的主帶，且?guī)缀鯖](méi)有彌散現(xiàn)象，這表明2種提取方法均能得到一定量的比較完整總DNA。

1～3、7～9道均為樣品A的DNA；4～6、10～12道均為樣品B的DNA；1～6道為CTAB法提取的DNA；7～12道為SDS法提取的DNA圖1 部分樣品DNA的瓊脂糖電泳圖譜Figure 1 The agarose gel electrophoresis for some DNA samples

圖2 引物組合E-AAA/M-CAC對(duì)蠟梅種質(zhì)的AFLP擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 The amplified bands of somesamples of Chimonanthus praecoxusing AFLP primer pairs E-AAA/M-CAC

2.3 酶切和AFLP標(biāo)記結(jié)果分析

將酶切后的DNA樣品連接接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后取適量的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，每個(gè)樣品均呈現(xiàn)出彌散的帶型，這表明用CTAB法提取的總DNA能被EcoR I和MseI兩種限制性內(nèi)切酶完全切割，并且AFLP標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜條帶清晰、帶數(shù)多，大小主要集中在50～700 bp之間(圖2)。

3 討論

3.1 獲得高純度的DNA

在DNA水平的研究中，保證DNA的純度很重要，也是最基本的，它直接影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)是否能順利進(jìn)行，影響到是否能獲得最佳的可信的結(jié)果。多次使用氯仿抽提，能夠有效地除去樣品中的蛋白質(zhì)，還能加速有機(jī)相與液相的分層，去除植物色素和蔗糖，在提取過(guò)程中能清楚地看到，采用CTAB法比SDS法能更有效地除去色素，液相由深綠色到綠色到無(wú)色。易干軍等[2]在利用AFLP技術(shù)分析香蕉的種質(zhì)資源時(shí)發(fā)現(xiàn)用SDS提取的DNA的純度不CTAB法提取的高。王彩虹等[3]在利用AFLP技術(shù)研究蘋果基因組時(shí)也報(bào)道用CTAB法提取的DNA的質(zhì)量比SDS法好，產(chǎn)量也高些。于曉英[4]在研究大花萱草時(shí)也發(fā)現(xiàn)用SDS提取的DNA的純度不如CTAB法提取的高。張潞生等[5]曾經(jīng)報(bào)道彌猴桃葉片含多糖很多的植物，采用SDS法提取的DNA往往不能達(dá)到AFLP所要求的純度，不僅內(nèi)含雜質(zhì)多，而且有部分發(fā)生降解，而采用較高濃度的CTAB(2%)和較高濃度的巰基乙醇(2%)，通過(guò)氯仿的抽提，可以得到符合AFLP要求的DNA樣品。在DNA沉淀過(guò)程中，沉淀的時(shí)間和溫度對(duì)DNA的產(chǎn)率和質(zhì)量也有很大的影響，沉淀的時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致沉淀不完全，使產(chǎn)率下降，而低溫與長(zhǎng)時(shí)間的沉淀，很容易導(dǎo)致鹽等雜質(zhì)與DNA共沉淀，使DNA的純度降低，從而影響以后的實(shí)驗(yàn)。本試驗(yàn)采用-20 ℃沉淀20 min，得到比較好的效果，既沉淀徹底又能保證質(zhì)量。由于DNA是多聚陰陽(yáng)離子的水溶性化合物，在沉淀時(shí)加入適量的NaAc有助于DNA析出，并且不會(huì)變性。

3.2 避免DNA的降解

在DNA的提取過(guò)程中，需要盡可能的保證DNA序列的完整性，主要從3個(gè)方面防止DNA的降解：(1)操作時(shí)動(dòng)作要輕柔、溫和，避免機(jī)械剪切，盡量在冰上操作，避免溫度高導(dǎo)致降解；(2)防止Dnase的降解，通常采用加EDTA來(lái)螯合溶液中的鎂離子、鈣離子等來(lái)消除Dnase的活性；(3)防止有機(jī)溶劑如酚、氯仿等的降解。本試驗(yàn)的整個(gè)提取過(guò)程都是在冰上進(jìn)行，不論是加入氯仿∶異物醇(24∶1)抽提還是加入異丙醇或95%的乙醇沉淀時(shí)，動(dòng)作盡量溫和，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)或上下顛倒離心管使之混勻。而且，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，最終將DNA溶解在TE中比溶解在雙蒸水中保存的時(shí)間長(zhǎng)，不易降解些。

[1]Loh J P, Kiew R, Kee A,etal. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) provides molecular markers for the identification ofCaladiumbicolorcultivars[J]. Ann Bot, 1999, 84: 155～161.

[2]易干軍，于曉英，霍合強(qiáng)，等.香蕉種質(zhì)資源的AFLP鑒別與分類中DNA模板的制備[J].果樹學(xué)報(bào)，2001，18(6)：345～348.

[3]王彩虹，王 倩，戴洪義，等.蘋果基因組AFLP分析的DNA模板的制備及技術(shù)體系的建立[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，32(2)：197～200.

[4]于曉英，吳鐵明，彭盡睬，等.營(yíng)草種質(zhì)資源擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性鑒別與分類的研究I．查草DNA模板的制備[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，27(1)：41～43.

[5]張潞生，李傳友，賈建航，等.獼猴桃雌雄性別的AFLP鑒別中DNA模板的制備[J].果樹科學(xué)，1999，16(3)：171～175.

2009-04-15

周明芹(1978-)，女，湖北荊州人，農(nóng)學(xué)博士，講師，主要從事園林植物種質(zhì)資源的利用及分子生物學(xué)研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.013

Q503;Q959.747.2

A

1673-1409(2009)03-S042-03