馬立安，趙雷鳴，陳啟武

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

降解麥秸木質(zhì)素菌種的篩選及發(fā)酵條件研究

馬立安，趙雷鳴，陳啟武

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

通過(guò)馴化、發(fā)酵篩選等方法，從供試的5株側(cè)耳菌(Pleurotus)中選育到1株具有較高降解木質(zhì)素的白腐類真菌P802，接種發(fā)酵10 d后，木質(zhì)素降解率為38%，對(duì)麥秸中纖維素降解率為8.10%。該菌株降解麥秸粉木質(zhì)素的最適pH為4.0～4.5，最適溫度30.4 ℃。

側(cè)耳菌(Pleurotus)；麥秸；木質(zhì)素；發(fā)酵；降解

麥秸等農(nóng)作物秸稈主要含有果膠、木質(zhì)素、半纖維素及纖維素，其中纖維素含量高達(dá)35.8%。可通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法處理使秸稈中的果膠、木質(zhì)素、半纖維素等降解，釋放纖維素用于草漿生產(chǎn)。我國(guó)的禾草類木材原料制漿歷史悠久，是世界非木材纖維造紙產(chǎn)量最多、經(jīng)驗(yàn)最豐富的國(guó)家。禾草類制漿造紙?jiān)谖覈?guó)造紙業(yè)發(fā)展史上發(fā)揮了極其重要的作用，曾經(jīng)達(dá)到紙漿產(chǎn)量的85%以上，構(gòu)成了具有中國(guó)特色的傳統(tǒng)造紙工業(yè)[1]。但傳統(tǒng)的草漿生產(chǎn)工藝主要是采用堿等化學(xué)處理方法，產(chǎn)生大量“黑色”廢液，嚴(yán)重污染環(huán)境，導(dǎo)致許多中小型造紙生產(chǎn)廠家被迫停產(chǎn)或關(guān)閉。因此，篩選高效降解秸稈木質(zhì)素等非纖維素物質(zhì)的菌種，應(yīng)用于草漿造紙行業(yè)，將具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)保意義。

在自然界中只有白腐菌能徹底地降解木質(zhì)素[2]。本研究以5株具有降解木質(zhì)素的白腐類真菌為出發(fā)菌種，經(jīng)過(guò)馴化、發(fā)酵麥秸粉，通過(guò)測(cè)定接種前后不同時(shí)間菌絲體降解麥秸中木質(zhì)素、纖維素的速率和數(shù)量，篩選出1株具有較高降解麥秸木質(zhì)素而較低降解纖維素的菌株，為生物造紙工業(yè)提供有效的木質(zhì)素降解菌及發(fā)酵技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

試驗(yàn)原料：麥秸，從枝江江口農(nóng)田獲得，經(jīng)曬干粉碎成麥秸粉備用；菌種：白腐真菌—側(cè)耳菌(Pleurotusosteatus)，編號(hào)為P側(cè)五、P金鳳2-5、PAX3、P8101和P802，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院王波先生饋贈(zèng)。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯小塊 200 g，蔗糖(或葡萄糖) 20 g，瓊脂 20 g，自來(lái)水1 000 mL，分裝于試管，0.1 MPa滅菌30 min，制成斜面。

馴化培養(yǎng)基：麥秸粉20 g、麥麩80 g，自來(lái)水130 g，pH6.0，分裝10個(gè)250 mL三角瓶中，0.1 MPa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：過(guò)40目的麥秸粉100 g，自來(lái)水130 g，pH6.0，分裝10個(gè)250 mL三角瓶中，0.1 MPa滅菌30 min。

1.2 方法

(1)斜面活化 將收集保藏的5個(gè)供試菌分別接種于PDA斜面上，在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～7 d，如此活化2～3代。

(2)菌種馴化 將已活化的5個(gè)供試菌分別接種于馴化培養(yǎng)基上，在30 ℃下馴化3～5 代，備用。

(3)發(fā)酵篩選 將已馴化的5個(gè)供試菌分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，每個(gè)菌種6個(gè)重復(fù)，未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基(0 d)作對(duì)照。在30 ℃下培養(yǎng)，于0、2、4、6、8、9、10 d各取樣1 g烘干處理，測(cè)定木質(zhì)素、纖維素含量，計(jì)算木質(zhì)素解率[(總木質(zhì)素含量-剩余木質(zhì)素含量)/總木質(zhì)素含量×100,%]。

(4) pH單因素試驗(yàn) 將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)成為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，接種篩選的具有高效降解木質(zhì)素而不降解或低降解纖維素的菌種，每個(gè)pH設(shè)3個(gè)重復(fù)， 30 ℃下培養(yǎng)8 d后，取樣測(cè)定木質(zhì)素剩余含量，計(jì)算木質(zhì)素解率(%)。

(5)溫度單因素試驗(yàn) 接種所篩選的具有高效降解木質(zhì)素而不降解或低降解纖維素的菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別放入28.0、29.3、30.4 ℃和31.2 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)8 d后，取樣，測(cè)定木質(zhì)素剩余量，計(jì)算木質(zhì)素解率(%)。

(6)測(cè)定方法 按照文獻(xiàn)[3～5]方法進(jìn)行。纖維素的含量測(cè)定：硝酸、乙醇混合液回流提取法。即使木質(zhì)素變?yōu)橄趸举|(zhì)素和氧化木質(zhì)素溶入乙醇，半纖維素被水解、氧化，剩下的則為硝酸乙醇纖維素的含量。木質(zhì)素的含量測(cè)定：用72%硫酸水解，經(jīng)苯-乙醇抽提原料或培養(yǎng)料，使其中的非木質(zhì)素成分經(jīng)與硫酸作用而溶解，剩下的殘?jiān)礊榇帜举|(zhì)素的含量。

(7)纖維素、木質(zhì)素含量計(jì)算 草類原料中纖維素含量W1、木質(zhì)素的含量W2，按下式計(jì)算：

W1(%)={(m1-m2)/[m0×(100-W0)/100]}×100。

式中,m0為試樣的質(zhì)量(g)；m1為玻璃濾器中烘干后殘?jiān)馁|(zhì)量(g)；m2為瓷坩堝中灰分的質(zhì)量(g)；W0為試樣中水分的含量(%)。

W2(%)={(m3-m4)/[m0×(100-W0)/100]}×100。

式中,m0為試樣的質(zhì)量(g)；m3為玻璃濾器中烘干后殘?jiān)馁|(zhì)量(g)；m4為瓷坩堝中灰分的質(zhì)量(g)；W0為試樣中水分的含量(%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥秸粉的基本成分

將麥秸粉原料經(jīng)處理后，測(cè)定水分、木質(zhì)素和纖維素的含量，結(jié)果為麥秸粉含水量12.10%，木質(zhì)素含量為22.64%，纖維素含量為39.60%。

表1 5個(gè)側(cè)耳菌株對(duì)麥秸粉木質(zhì)素的降解率Table 1 The degradation rate of the lignin in wheat strawby five Pleurotus strains %

表2 5個(gè)側(cè)耳菌株對(duì)麥秸粉纖維素的降解率Table 2 The degradation rate of the cellulose inwheat straw by five Pleurotus strains

2.2 優(yōu)良菌種的篩選

將經(jīng)活化、馴化的5個(gè)側(cè)耳菌株分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫箱培養(yǎng)，于2、4、6、8、9、10 d取樣測(cè)定木質(zhì)素的含量，計(jì)算木質(zhì)素的降解率，結(jié)果如表1。結(jié)果表明，發(fā)酵6～10 d，P802對(duì)麥秸粉木質(zhì)素的降解率一直是最高的，且生長(zhǎng)較快而壯；表2為發(fā)酵10 d纖維素的含量，結(jié)果顯示P802對(duì)麥秸粉纖維素的降解率最低(8.08%)，菌絲生長(zhǎng)快而密。結(jié)合菌絲的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和降解率，故P802為所篩選的具有較高的降解麥秸木質(zhì)素而低降解纖維素的優(yōu)良菌株。

2.3 pH對(duì)木質(zhì)素降解的影響

將P802菌株分別接種于pH為4.0～6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定木質(zhì)素的含量并計(jì)算其降解率，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，結(jié)果如表3。P802在pH為4.0～4.5的環(huán)境下降解木質(zhì)素剩余的含量最低，降解率最高，且菌絲生長(zhǎng)快、壯實(shí)。真菌適宜生長(zhǎng)在pH中性偏酸的條件，將pH降低于4.0以下，P802菌絲生長(zhǎng)受影響，生長(zhǎng)緩慢。故pH 4.0～4.5為P802解木質(zhì)素的適宜條件。

表3 P802菌株在不同pH環(huán)境下對(duì)木質(zhì)素的降解率Table 3 The degradation rate of the lignin in wheatstraw at different pH by the strain P802

表4 P802菌株在不同溫度下對(duì)木質(zhì)素的降解率Table 4 The degradation rate of the lignin in wheatstraw at different temperature by the strain P802

2.4 溫度對(duì)木質(zhì)素降解的影響

將P802菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別放在28、29、30 ℃和31 ℃恒溫箱培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定木質(zhì)素的含量并計(jì)算其降解率，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，結(jié)果如表4。在30 ℃下，P802菌株對(duì)麥秸粉木質(zhì)素的降解率最高。

3 討論

本試驗(yàn)利用白腐真菌降解麥秸木質(zhì)素，是在實(shí)驗(yàn)室三角瓶?jī)?nèi)進(jìn)行的，高壓滅菌對(duì)降解原料中的木質(zhì)素是有一定作用的，所以實(shí)際值還應(yīng)扣除這一因子的影響。試驗(yàn)中P802菌株發(fā)酵麥秸10 d后木質(zhì)素的剩余量仍有13.94 g，這一值大于等于我國(guó)對(duì)可漂漿(指木質(zhì)素在6%以下)的本色硬漿的硬度。所以，生物發(fā)酵法制草漿還是任重而道遠(yuǎn)的。

[1]李忠正．合理利用禾草類纖維造紙的理論與實(shí)踐[J]．江蘇造紙，2007，(1)：2～8.

[2]Kirk T K, Farrell R L.Enzymatic “combustion”：the microbial degradation of lignin[J].Annu Rev Microbiol, 1987, 41:465～505.

[3]李與文，王慧麗．制漿造紙分析檢驗(yàn)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.3.

[4]薛惠琴，杭怡瓊．稻草秸稈中木質(zhì)素、纖維素測(cè)定方法的研究[J]．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2001，(2)：15.

[5]熊素敏，左秀鳳，朱永義．稻殼中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測(cè)定[J]．糧食與飼料工業(yè)，2005，(8)：40～41.

2009-03-16

馬立安(1964-)，女，湖北洪湖人，工學(xué)博士，副教授，主要從微生物學(xué)及分子生物學(xué)教學(xué)與研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.017

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1673-1409(2009)03-S053-03