吳恒梅　李秀霞　張麗萍

【摘要】對松木層孔菌發(fā)酵菌絲體多糖的提取工藝進行了研究,通過單因素試驗和正交試驗L9(33),研究了提取次數(shù)、浸液比和提取時間對多糖提取率的影響,結(jié)果顯示提取次數(shù)、浸液比和提取時間是影響多糖提取率的主要因素,最佳工藝為提取溫度常溫,提取3次,每次浸液比(質(zhì)量比)1:30,時間是1 h。各因素影響大小的次序是:提取次數(shù)>浸液比>提取時間。

【關(guān)鍵詞】松木層孔菌 可溶性多糖 提取工藝

Study on the Extraction Technology of Polysaccharide

from Phellinus linteus

Wu Heng-mei1,Li Xiu-xia1,Zhang Li-ping2

(1 College of Life Science;Jiamusi University;China; Jiamusi 154007;2 School of Life Sciences,Northeast Normal University, Changchun130024, China)

【Abstract】 The extraction of polysaccharides from the fermentative mycelium of Phellinus pini was studied. Single factor test and orthogonal experiment design method L9(33) were applied to analyze the influence of factors such as the concentration of alkali, extract times,solid-liquid ratio,and time on the extraction percent of the polysaccharides. Experimental results indicated that extract times, solid-liquid ratio and time significantly affect the extraction percent of the soluble polysaccharides.The optimum condition was the normal temperature, extraction three times and the diffusion ratio 1:30 and the extraction time was one hour.The sequence of each influence factors is: extraction times>extraction ration> time.

【Key words 】Phellinus pini;soluble polysaccharide; extraction technology

引言

多糖(Polysaccharide)是由許多相同或不同的單糖通過糖苷鍵連接而成的化合物,其分子量一般為數(shù)萬甚至數(shù)百萬[1]。多糖具有免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、降血糖血脂、利尿和抗?jié)兊壬锘钚宰饔?。松木層孔菌又名為松針層孔菌、松白腐?Phellinus pini),隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科 、層孔菌屬。

王穩(wěn)航[2]首次從松木層孔菌子實體提取多糖進行了抗氧化性研究。結(jié)果表明,多糖抗氧化效果較好,對超氧陰離子自由基的清除率均達到90 %以上,丙二醛生成抑制率均達到65%左右。目前從松木層孔菌中提取粗多糖工藝的研究還鮮見報道,近年來對多糖提取工藝的研究方法較多[3,4-6],如熱水提取法、稀堿液提取法、稀酸液提取法,本文采用稀堿液提取法。通過對發(fā)酵菌絲體水溶性多糖堿提工藝的研究,以其獲得一種松木層孔菌發(fā)酵菌絲體多糖提取率較高的工藝,獲得最優(yōu)化的工藝參數(shù),希望為工業(yè)化生產(chǎn)研究有所幫助。

1. 材料和方法

1.1 材料

松木針層孔菌 (Phellinus pini.) 菌絲體的獲得:松木層孔菌子實體采自長白山,從松木層孔菌子實體中分離菌種,取活化后的斜面母種接入500 ml錐形瓶中,28℃,140 r·min-1培養(yǎng)7 d,發(fā)酵結(jié)束后,4000 rpm 離心收集新鮮菌絲體,烘干備用。

1.2 方法

1.2.1 粗多糖的提取與分離(以去除水提水溶多糖[8]的菌絲體殘渣為材料)

經(jīng)水提的菌絲體殘渣,烘箱干燥,稱取5克干燥的松木層孔菌菌絲體,然后加入0.5 mol/LNaOH 溶液,在一定溫度下進行一定時間的提取,反復(fù)提取3次,合并提取液經(jīng)過過濾,加 Hcl 中和,在水浴鍋中濃縮至小體積,得濃縮液,透析,用3倍體積97%(質(zhì)量分數(shù))乙醇醇析得水溶性粗多糖沉淀,低速離心機離心,轉(zhuǎn)速3500轉(zhuǎn),離心10分鐘,棄去上清液,沉淀用無水乙醚洗滌2次,真空干燥后,得堿提水溶性粗多糖的產(chǎn)品。

1.2.2 多糖含量的測定(苯酚-硫酸法)

本實驗先用標準葡萄糖溶液在490nm處的吸光度處制標準曲線。精確稱取堿提水溶性多糖5 mg,定容至50 ml糖溶液,然后取干燥潔凈試管,將0.1mg/ml糖溶液,6%的酚溶液,濃H2SO4依次按1:0.5:2.5的比例加入、振蕩、搖勻、冷卻、靜止,每個樣品平行做三管,蒸餾水作對照,然后在490 nm波長下比色,所得數(shù)值取平均值,查標準曲線可得總糖含量。

2. 結(jié)果和討論

2.1 多糖含量的測定

在實驗條件下,以濃度(C)為橫坐標,以吸光度(A)為縱坐標作圖,得標準曲線。

2.2 提取次數(shù)、浸液比和提取時間單因素對松木層孔菌可溶性多糖提取率的影響[7]

堿提涉及三個關(guān)鍵條件:提取次數(shù)、浸液比和提取時間。提取次數(shù)采用1次、2次、3次、4次、5次五個水平;浸液比(干燥樣品的質(zhì)量與水的質(zhì)量之比)采用1:10、1:20,1:30、1:40和1:50五個水平,提取時間采用1h、2h、3h、4h和5h五個水平分別進行單因素試驗。

2.2.1 提取次數(shù)的影響

不同的提取次數(shù)對水溶性多糖提取率的影響,提取次數(shù)的上升會增加堿提水溶性多糖的含量,在提取3次后多糖含量增加的幅度不大,趨于平緩。

2.2.2 浸液比的影響

不同的浸液比對水溶性多糖提取率影響。試驗結(jié)果顯示:浸液比的增加會使水溶性多糖的含量增加,隨浸液比的增加,堿提水溶性多糖含量也逐漸增大,在浸液比1:30后,多糖含量增大幅度減小。

2.2.3 提取時間的影響

不同提取時間對水溶性多糖提取率的影響。試驗結(jié)果表明:提取時間在0-2 h內(nèi),提取液中的多糖含量上升幅度較大,而2-4 h以后含量稍有上升。所以最佳提取時間為3 h。

2.3 堿提松木層孔菌中水溶性多糖提取率的正交試驗

2.3.1 正交試驗設(shè)計和結(jié)果分析[8]

以堿提水溶性多糖的含量為標準,選擇影響提取菌絲體多糖產(chǎn)量的三個主要因素:提取時間、提取比(質(zhì)量比)、提取次數(shù),每個因素設(shè)3個水平,選用L9(33)正交試驗,因素水平見表1、試驗結(jié)果計算及分析見表2。

從表2可知,提取次數(shù)是影響水溶性多糖提取率的最關(guān)鍵因素,其次是提取時間,在實驗范圍內(nèi),浸液比的影響最小。

2.3.2 正交試驗的方差分析結(jié)果

正交試驗的方差分析結(jié)果如表3所示:提取次數(shù)的差異顯著對松木層孔菌可溶性多糖提取率的影響起最主要作用,浸液比和提取時間在此實驗范圍內(nèi)無顯著性差異,對測定結(jié)果的影響不大。這與直觀分析結(jié)果是相吻合的。

3.結(jié)論

在堿提松木層孔菌水溶性多糖過程中,提取次數(shù)為影響多糖率提取的最主要因素,各因素影響的大小次序是:提取次數(shù)>浸液比>提取時間。提取溫度在常溫下,確定菌絲體多糖的最佳提取工藝條件為:堿的濃度為0.5 mol/L,提取時間1 h,提取次數(shù)3次,浸液比(質(zhì)量比)1:30。

參考文獻

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作者簡介:吳恒梅,江蘇省睢寧人,佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授,主要從事糖類生物化學(xué)研究。