陳　薇　段小群　盧　曦等

[摘要] 目的 研究五種青錢(qián)柳提取物(CPS)清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用。方法 采用組織勻漿MDA比色法測(cè)定不同濃度的CPS對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。利用Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生?OH,研究CPS對(duì)羥自由基的清除作用,計(jì)算半清除率(IC50)。結(jié)果 五種提取物均明顯的具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用,在濃度為1.0 mg?ml-1時(shí),對(duì)小鼠肝組織自發(fā)性MDA的抑制率大小為:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。CPS對(duì)?OH自由基IC50大小為:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。結(jié)論 五種青錢(qián)柳提取物均有較強(qiáng)的體外抗氧化活性,且活性與濃度呈明顯的量效關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 青錢(qián)柳;提取物;脂質(zhì)過(guò)氧化;自由基

文章編號(hào):1003-1383(2009)04-0381-03

中圖分類(lèi)號(hào):R 963

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

青錢(qián)柳[Cyclocarya paliurus(Batal) Iljinskaya](CPS)又名青錢(qián)李(江西),系雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青錢(qián)柳屬植物,它是我國(guó)獨(dú)有珍稀樹(shù)種資源[1],分布于廣西、江西、浙江等地的山區(qū)、溪谷或石灰?guī)r山地,為廣西特色植物。據(jù)《中國(guó)中藥志要》記載,其樹(shù)皮、樹(shù)葉具有清熱解毒,止痛功能,可用于治療頑癬。長(zhǎng)期以來(lái)民間用其葉片做茶,因其味甜有清熱解暑、降糖、降壓的功效,又稱(chēng)為甜茶,神茶等琜2]。青錢(qián)柳干葉的主要成分有糖、氨基酸、有機(jī)酸、黃酮、酸性物質(zhì)、內(nèi)酯、香豆精、三萜及皂甙、甾醇等[2]。我國(guó)從1970年開(kāi)始對(duì)青錢(qián)柳進(jìn)行藥用開(kāi)發(fā)研究,發(fā)現(xiàn)青錢(qián)柳具有明顯的降血糖、降血壓、減肥、抗腫瘤、抗衰老、抗過(guò)敏、清熱解暑、提高人體免疫力、促進(jìn)新陳代謝等多種功效,尤其對(duì)治療糖尿病有顯著療效[3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)青錢(qián)柳不同提取物的體外抗氧化性進(jìn)行了研究,為更進(jìn)一步開(kāi)發(fā)青錢(qián)柳保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.動(dòng)物 昆明種小鼠,雌雄各半,體重(20±2)g,由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.實(shí)驗(yàn)材料與儀器 青錢(qián)柳采自廣西陽(yáng)朔縣白沙鎮(zhèn)青錢(qián)柳基地,752睪W型紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、FA2004電子天平(上海精科天平)、小型三用水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)、XH睟型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)、LD0.8離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52型,上海亞榮儀器廠生產(chǎn))。

3.試劑 丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水乙醇、蒸餾水、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫均為分析純,PBS液為自制。

4.實(shí)驗(yàn)方法

(1)青錢(qián)柳不同溶劑提取物的制備 取烘干過(guò)篩的青錢(qián)柳粉末,分別按固液比1∶20加入去離子水,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器提取2 h,過(guò)濾,去殘?jiān)?。濾液分兩部分,一部分加入80%乙醇提取后再用水提取,利用水提醇沉淀法[4]用三氯醋酸去蛋白質(zhì)后得到青錢(qián)柳多糖合物,另一部分加入80%乙醇,提取1.5 h,分別用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取,得正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物,最后剩余的為水提物。各提取物均用真空濃縮至膏狀,并于40℃真空干燥,冷藏備用。

(2)CPS對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 小鼠禁食12 h后摘除眼球放血處死,取肝,在0~4℃下用生理鹽水制成5%肝勻漿。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(10%肝勻漿)、陽(yáng)性組(VitC)和高、中、低3個(gè)劑量的青錢(qián)柳提取物組(10%肝勻漿和青錢(qián)柳不同溶劑提取物配液)。以硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量,并計(jì)算抑制率:

抑制率(IR)=(對(duì)照組MDA-提取物組MDA)/對(duì)照組MDA。

(3)CPS對(duì)羥自由基的清除作用

采用亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生(?OH)的方法。在樣品管中加0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1 ml,PBS 2 ml和1 ml樣品,旋渦混合器混勻后,加0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 ml,旋渦混合器混勻后,加0.01%過(guò)氧化氫溶液1 ml,置恒溫水浴中37℃保溫1 h。反應(yīng)液置比色皿中,于分光光度計(jì)中在536 nm測(cè)定吸光度As。用1 ml蒸餾水代替1 ml樣品,測(cè)定吸光度為Ap。吸光度為Ab的管不加過(guò)氧化氫和樣品,都以蒸餾水代替。按以下公式計(jì)算羥自由基的清除率(d%):d%=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-潯廓s)表示,采用EXCEL統(tǒng)計(jì)軟件以tЪ煅榻行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.CPS對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 青錢(qián)柳各提取物對(duì)MDA的生成均有抑制作用,隨著各提取物濃度增加,部分提取物的抑制率也會(huì)相應(yīng)增高。五種提取物中對(duì)MDA抑制最強(qiáng)的為正丁醇提取物,在濃度為1.0 mg?ml-1時(shí),對(duì)小鼠肝組織自發(fā)性MDA的抑制率大小為:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。見(jiàn)表1。

表1 CPS對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響(-潯廓s,n=6)

組別濃度(mg?ml-1)MDA(nmol?mgprot-1)抑制率(%)

對(duì)照組 11.388 ±0.306

VitC1.06.831±0.221※40.0

正丁醇提取物0.18.826 ±0.405※22.5

0.56.522 ±0.385※42.7

1.05.646 ±0.363※50.4

水提物0.19.742 ±0.164※14.5

0.58.715 ±0.325※23.5

1.07.844 ±0.386※31.1

多糖合物0.18.652 ±0.368※24.0

0.56.788 ±0.386※40.4

1.07.257±0.383※36.3

乙酸乙酯提取物0.18.531 ±0.459※25.1

0.58.848 ±0.317※22.3

1.08.528 ±0.388※25.1

石油醚提取物0.19.284 ±0.315※18.5

0.57.488 ±0.243※34.2

1.07.081 ±0.571※37.8

注:與正常對(duì)照組比: ※P<0.01

2.CPS對(duì)羥自由基的清除作用 CPS對(duì)?OH有清除作用,且作用較強(qiáng)。特別是正丁醇提取物、水提物和多糖合物,最高清除率可高達(dá)80%以上。隨著各提取物濃度的增加,對(duì)?OH自由基的清除率不斷增大。但到了一定濃度,再增加其濃度,反而清除率有所降低。

半清除率(IC50)指清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度,根據(jù)不同濃度樣品的清除率作曲線求出。所需濃度越低,表明半清除率越高,清除效果越好。通過(guò)計(jì)算所得IC50值,可比較各青錢(qián)柳提取物對(duì)羥自由基的清除率:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。見(jiàn)表2。

表2 CPS對(duì)?OH自由基的清除作用(-潯廓s,n=6)

觀察項(xiàng)目水提物

石油醚提取物

正丁醇提取濃度(mg?ml-1)0.020.050.100.150.300.250.300.400.050.100.15

0.300.50

清除率(%)33.7±1.243.1±1.552.5±0.961.0±1.294.5±1.741.3±0.753.9±1.675.7±1.2

3.0±0.99.2±1.719.0±01.641.7±1.290.4±1.2

IC50(mg?ml-1)0.09

0.29

0.31

(續(xù))表2

觀察項(xiàng)目多糖合物

乙酸乙酯提取物

濃度(mg?ml-1)0.300.400.500.600.700.800.900.250.300.350.40

清除率(%)44.3±0.955.0±00.762.4±1.171.0±60.780.0±0.987.8±0.983.9±1.218.6±0.9

40.1±1.247.7±0.721.6±1.2

IC50(mg?ml-1)0.33

0.35

討論

青錢(qián)柳為廣西特有珍稀植物,對(duì)它的開(kāi)發(fā)利用還十分有限,青錢(qián)柳既有明顯的藥理價(jià)值又具備一定的食品保健功能,進(jìn)行工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用前景十分廣闊。針對(duì)青錢(qián)柳葉中含有黃酮、多糖、內(nèi)酯等多種有效成分,本實(shí)驗(yàn)提取了五種青錢(qián)柳提取物,考察青錢(qián)柳的體外抗氧化活性,為其藥理作用提供科學(xué)依據(jù)。

脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛等可導(dǎo)致人體細(xì)胞氧化損害、老化、致癌和動(dòng)脈硬化等多種疾病。過(guò)氧化脂質(zhì)大部分由肝細(xì)胞產(chǎn)生,其分解也主要在肝臟。MDA是過(guò)氧化脂質(zhì)的主要降解產(chǎn)物,其含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。故MDA的水平測(cè)定可用作檢測(cè)抗過(guò)氧化作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CPS可明顯降低小鼠自發(fā)性MDA的生成,且活性與濃度有明顯的量效關(guān)系。

羥自由基是反應(yīng)藥物抗氧化活性的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基:H2O2+Fe2+=?OH+OH+Fe3+。Fe2+與鄰二氮菲生成紅色配合物,加入CPS后,減弱了?OH對(duì)Fe2+/鄰二氮菲的氧化作用,引起自由基的變化,通過(guò)測(cè)定其吸光度值的變化,推斷CPS對(duì)?OH的作用。結(jié)果表明CPS對(duì)羥自由基有較好清除作用,是天然高效的自由基清除劑。

CPS較高的體外抗氧化活性可能與其中含有黃酮類(lèi)化合物有關(guān)。黃酮類(lèi)化合物具有的多酚結(jié)構(gòu),能提供活潑質(zhì)子,與自由基結(jié)合成穩(wěn)定的產(chǎn)物,因而有較強(qiáng)的抗氧化作用[5]。黃酮類(lèi)成分具有保肝、擴(kuò)冠、抗炎、降低血管脆性,解除痙攣,增強(qiáng)心臟收縮,還有一定程度的抗菌及抑制腫瘤細(xì)胞等作用。同茶葉相比,青錢(qián)柳黃酮類(lèi)化合物含量相對(duì)較高,可作為這些物質(zhì)的補(bǔ)充源[6]。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期:2009-05-18 修回日期:2009-07-15)

(編輯:梁明佩 英文審校:唐雄林)