趙連梅 張春青

摘要由于DNA容易變性,為了獲得和天然DNA結(jié)構(gòu)相似的大分子DNA,必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,同時(shí)還要抑制脫氧核糖核酸酶的作用。在提取液中加入整合劑檸檬酸鈉和EDTA,使之與脫氧核糖核酸酶的輔因子Ca2+和Mg2+結(jié)合,使核酸酶喪失活性。十二烷基磺酸鈉(也稱SDS)為去污劑,可以破壞細(xì)胞膜,也可以使核酸酶喪失活性。

關(guān)鍵詞DNAEDTASDS

中圖分類號(hào):Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離,又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及鏈霉蛋白酶E的應(yīng)用使這兩個(gè)原則得到了保證。蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為廣譜蛋白質(zhì),其重要特性是能在SDS(十二烷基硫酸鈉)和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中,SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜,蛋白酶E可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分離出來(lái)。加入氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質(zhì),最后用無(wú)水乙醇沉淀DNA。在提取過(guò)程中,染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量采取溫和條件,以保證得到較長(zhǎng)的DNA。

1材料與儀器

1.1 材料

(1)雞肝。

(2)氯仿/異戊醇=24:1。

(3)75%乙醇、90%乙醇、無(wú)水乙醇。

(4)1譙SC溶液:0.15mol/L氯化鈉—0.015mol/L檸檬酸鈉溶液,pH7.0。

(5)0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液,pH8.0。

(6)5%SDS溶液:把5gSDS溶于100 mL45%的乙醇中。

(7)二苯胺試劑:將1g純的二苯胺溶于98 mL的冰乙酸中,再加入2 mL濃H2SO4,此溶液須新鮮配制。

(8)DNA溶液:把100mg脫氧核糖核酸溶解于100 mL蒸餾水中。

1.2 儀器

(1)組織搗碎勻漿機(jī)。

(2)離心機(jī)。

(3)天平。

2 方法

2.1 DNA的提取

(1)稱取80g新鮮的雞肝,剪成小塊,放入盛有大約150ml預(yù)冷的1譙SC溶液的燒杯中洗大約5分鐘,倒掉緩沖液,再加入大約150ml預(yù)冷的1譙SC溶液洗2～3次,使血量減少。

(2)把洗凈的雞肝放入組織搗碎勻漿機(jī)中,加入約2倍體積1譙SC溶液勻漿1～2分鐘。

(3)取勻漿液20ml,在3500r/min下離心10min,倒掉上清液(注:記錄上清液的體積)。

(4)將離心后所得的沉淀(20 ml減去上清液的體積即為沉淀量)均勻懸浮于5倍體積的0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液中,邊攪拌邊滴加5%SDS溶液,直到SDS的最終濃度達(dá)1%為止。

(5)在劇烈攪拌下加入已經(jīng)磨碎的固體氯化鈉使其最終濃度達(dá)到1mol/L,繼續(xù)攪拌30分鐘直到氯化鈉完全溶解為止。

(6)把上述混合液倒入一個(gè)試劑瓶?jī)?nèi),加入等體積氯仿/異戊醇混合液,在室溫下激烈振蕩20分鐘。

(7)在3000r/min轉(zhuǎn)速下,將上述懸濁液離心30min。

(8)離心后,小心吸取凝聚的蛋白質(zhì)上部的水層(DNA在水相),蛋白質(zhì)在水相和有機(jī)相之間,把吸出的上層水相倒入一個(gè)250ml的燒杯中。

(9)用一支干凈的玻璃棒慢慢攪動(dòng)下緩緩加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇。乙醇加入后,沿一個(gè)方向連續(xù)的攪拌,使其充分混合,以便使絲狀DNA纏繞于玻璃棒上。

(10)將繞出的DNA放入75%的乙醇中洗一次,然后放入95%的乙醇中洗一次,最后再放入無(wú)水乙醇中洗一次。

(11)將提取的DNA樣品轉(zhuǎn)入試管中,加入適量的水溶解備用(記下總體積)。

2.2DNA的鑒定

取兩支試管,分別加入5毫升的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液和2毫升雞肝DNA溶液,再各加入2毫升二苯胺試劑,混合均勻,在沸水浴中加熱10分鐘,將試管冷卻。冷卻后加入二苯胺的試管溶液均變藍(lán)(深藍(lán)),說(shuō)明含大量DNA。溶液顏色的深淺與DNA的含量有關(guān)。

3結(jié)論與分析

(1)幾乎所有的細(xì)胞中都含有DNA。但是有些組織細(xì)胞中DNA的含量很少,不適合作為制備DNA的材料。此外,在有些組織中,脫氧核糖核酸酶的活性很高,所以在這些組織細(xì)胞中的大分子DNA都已經(jīng)斷裂為小的碎片。因此,從組織細(xì)胞中制備DNA選擇DNA含量多而脫氧核糖核酸酶活性低的組織。具備這些最好的組織是胸腺、淋巴組織,脾臟、肝也是理想的材料。本實(shí)驗(yàn)選用的組織是新鮮的雞肝。實(shí)驗(yàn)證明,新鮮的雞肝提取的DNA量多、鏈長(zhǎng)且不易斷裂;將剛?cè)〕龅男迈r雞肝急速冷凍后再提取的DNA的效果也可以,但不如新鮮的雞肝提取出的DNA的量多;不新鮮的冷凍過(guò)的雞肝提取的DNA量少、鏈短且易斷裂。

(2)細(xì)胞內(nèi)核酸都是與蛋白質(zhì)結(jié)合而呈核蛋白的形式,所以在制備核酸時(shí),先設(shè)法破碎細(xì)胞,然后再將蛋白質(zhì)與核算相分離。在提取液中加入整合劑檸檬酸鈉和EDTA(乙二胺四乙酸),使之與脫氧核糖核酸酶的輔因子Ca2+和Mg2+結(jié)合,使核酸酶喪失活性。十二烷基磺酸鈉(也稱SDS)為去污劑,可以破壞細(xì)胞膜,也可以使核酸酶喪失活性,本實(shí)驗(yàn)采用較高濃度的SDS,與蛋白酶K處理細(xì)胞以促使細(xì)胞及細(xì)胞核破裂。

(3)乙醇對(duì)酶的活性有抑制作用,所以在提取DNA時(shí)要盡量去除乙醇,以免影響蛋白酶K的活性。因此在提取DNA時(shí),首先要進(jìn)行離心,將含有較多乙醇的上清液除去。將離心后所得的沉淀均勻懸浮于5倍體積的0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液中,在劇烈攪拌下加入已經(jīng)磨碎的固體氯化鈉使其最終濃度達(dá)到1mol/L,繼續(xù)攪拌30分鐘直到氯化鈉完全溶解為止。一方面溶解稀釋殘余的乙醇,另一方面為肝細(xì)胞提供近似的生理溶液環(huán)境,取得了較理想的效果。

(4)脫氧核糖核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物成為脫氧核糖核蛋白(簡(jiǎn)稱DNP),DNP溶于高離子強(qiáng)度的溶液中,但不溶于低離子強(qiáng)度(0.05～0.25mol/L)的溶液中。利用這一性質(zhì),在提取的最初階段,首先把組織細(xì)胞放于檸檬酸鈉的等滲鹽溶液中勻漿(pH為7.0),此時(shí),大多數(shù)其他的大分子物質(zhì)如核糖核蛋白(RNP)處于溶解狀態(tài),而脫氧核糖核蛋白(DNP)不溶,分離沉淀物,將其溶解于1 mol/L的鹽中。加入氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質(zhì),向抽提液中加入乙醇可沉淀出DNA。

(5)DNA的鑒定采用二苯胺鑒定法。DNA分子中2-脫氧核糖殘基在酸性溶液中加熱降解,產(chǎn)生2-脫氧核糖并形成%r-羥基-%-酮基戊酸,后者與二苯胺試劑反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色化合物,其反應(yīng)如下圖。

藍(lán)色化合物在595nm處有最大吸收,且DNA在40%eg ~400%eg范圍內(nèi)時(shí),吸光度與DNA濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛,可以提高反應(yīng)靈敏度。