徐德順　沈月華　程平慶

（浙江省湖州市疾病預(yù)防控制中心， 浙江 湖州313000）

摘要 [目的] 利用特異性熒光探針為特點(diǎn)的TaqMan熒光定量PCR技術(shù)，建立大腸桿菌O157:H7污染的快速敏感特異的檢測(cè)方法。[方法] 以大腸桿菌O157H7的rfbE基因作為靶序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，以大腸桿菌O157H7菌株提取核酸DNA作為模板，優(yōu)化引物和探針的濃度比和Mg2+濃度，以大腸桿菌O157:H7和10種相7關(guān)細(xì)菌考核檢測(cè)體系的靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。[結(jié)果] 本研究建立的反應(yīng)體系在引物和探針的濃度為0.6μmoL/L、0.8μmoL/L；Mg2+濃度為4 mmoL/L時(shí)，具有良好的特異性和敏感性。在10株相關(guān)菌株的檢測(cè)中，除大腸桿菌O157:H7出現(xiàn)很好的陽(yáng)性外，其余菌株均為陰性。在純菌條件下，定量檢測(cè)低限17cfu/mL。穩(wěn)定性分析表明：同一樣品重復(fù)檢測(cè)3次Ct值的變異系數(shù)均小于5％。檢測(cè)樣品結(jié)果顯示Real-time PCR方法較傳統(tǒng)方法敏感、快捷、簡(jiǎn)便。[結(jié)論] 該方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，操作簡(jiǎn)便快捷，適應(yīng)食品微生物檢驗(yàn)發(fā)展需要，具有較大的推廣及應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 熒光定量PCR；TaqMan探針；大腸桿菌O157:H7

Construction and primary application of a TAQMAN PCR detection method for detection of escherichia coli O157H7

DE Shun-XuYUE Hua-Shen CHENG Ping-Qing (Huzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention，Huzhou 313000, China)

Abstract[Objective] To establish a rapid sensitive and specific detection method of Escherichia coli O157:H7 with TaqMan PCR. [Methods] To design a pair of primers and probe depending on rfbE gene by way of target sequence of Escherichia coli O157:H7, and apply Escherichia coli O157:H7 of standard bacterium strain for template to appraise Escherichia coli O157:H7. The best Mg2+ concentration. primer and probe ratio were optimized. Specificity，sensitivity and stability analysis test were performed by Escherichia coli O157:H7 and 10 other associated bacteria strains. [Results] The best Mg2+ concentration was 4mmoL/L. Concentretion of primer s and probe was 0.6μmoL/L, 0.8μmoL/L.Test showed that the probe were highly conservative and specific. The results of all 10 bacteria strains were negative except of strains of Escherichia coli O157:H7.The quantitative detection Limit of the method was 17cfu/mL in pure cultured broth . Stability test show that Co-efficient Variables were all less than 5% in 4 different concentrations. The results show that real-time PCR method is more sensitive, more easier and more faster than conventional culture method for detection of Escherichia coli O157:H7.[Conclusion] Real-time PCR method has high sensitivity and specialty . The real-time PCR is a handy and rapid method. That can be used in food microorganism examination and has great value in practical work.

Key words: Real-time PCR; TaqMan-based probe; Escherichia coli O157:H7；

腸出血性大腸桿菌(Entero Hemorrhagic E，coli) O157:H7是近10年來(lái)認(rèn)識(shí)的一種引起人類(lèi)出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis HC)和溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremie syndrom HUS)的腸道致病菌[1]。O157:H7 感染劑量極低，食入不足5個(gè)細(xì)菌就可引起疾病，病情發(fā)展快，死亡率高，近年在歐美、日本等國(guó)已多次爆發(fā)流行，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成了重大的威脅[2]。我國(guó)1986年已發(fā)現(xiàn) O157:H7感染病人，并在安徽、江蘇等地爆發(fā)了該菌引起的食物中毒[3]。1999年和2001年先后在浙江省杭州和寧波地區(qū)從腸道門(mén)診腹瀉患者糞便中分離到O157:H7菌株。我國(guó)目前對(duì)O157:H7等病原體大多數(shù)是傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，不僅耗時(shí)耗材，而且檢出率很低，要快速檢測(cè)出O157:H7 等病原體引起的爆發(fā)有不足之處[4]。 因此建立特異、靈敏及快速的O157:H7檢測(cè)方法顯得尤為重要。實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time PCR）是近幾年興起的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。其檢測(cè)靈敏性高，特異性好且操作簡(jiǎn)便，出結(jié)果快。在眾多現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)中脫穎而出，成為檢測(cè)領(lǐng)域中重要的一種快速檢測(cè)手段。我們針對(duì)大腸桿菌O157:H7的重要屬特異性基因rfbE基因設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化該菌的TaqMan PCR反應(yīng)條件，建立了大腸桿菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 儀器與試劑實(shí)驗(yàn)所需儀器有7300型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司產(chǎn)品）、No:11175674型高速冷凍離心機(jī)[Thermo公司(上海)產(chǎn)品]、220/224型臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品）。實(shí)驗(yàn)所需試劑有Real-time PCR反應(yīng)試劑盒（大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的TaKaRa Ex Taq產(chǎn)品）、細(xì)菌培養(yǎng)用顯色培養(yǎng)基[法國(guó)科瑪嘉（鄭州博賽生物技術(shù)研究所）產(chǎn)品]、增菌培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2 菌種大腸桿菌O157:H7由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。鴨沙門(mén)氏菌、副傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌EIEC、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌、福氏志賀氏菌等菌株由湖州是疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2方法

1.2.1 引物與TaqMan探針設(shè)計(jì)合成從GenBank中獲取各種不同來(lái)源地大腸桿菌O157:H7的rfbE基因序列，應(yīng)用Primer Express軟件分析基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)[5]提供的TaqMan引物和探針設(shè)計(jì)原則，在這些序列的保守區(qū)域篩選一對(duì)引物，并在該引物的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)1條熒光探針（表1）。探針5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3，端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù)將低溫保存的菌種置于室溫下解凍，接種到增菌培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)復(fù)蘇，對(duì)于常溫保存的菌種，直接接種到各自的增菌肉湯種培養(yǎng)復(fù)蘇，復(fù)蘇后的菌種分別劃線到各自適宜的培養(yǎng)平板上增殖，取增菌分純后的菌種，用生理鹽水制備成菌懸液備用。菌落計(jì)數(shù)以無(wú)菌操作將充分混勻的大腸桿菌O157:H7菌株過(guò)夜培養(yǎng)液1 mL按10倍遞增稀釋至10-1～10-5濃度，并選擇10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度各0.2 mL 涂布于做好的培養(yǎng)皿上，同一稀釋度做3個(gè)平行，均勻鋪板后放入37℃恒溫箱中48 h后取出可計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)其可見(jiàn)菌落數(shù)，即可推算出原液中含的細(xì)菌數(shù)。

1.2.3 膜板DNA制備采用熱煮沸法，吸取搖勻的培養(yǎng)液或生理鹽水菌懸液1000μL 于1.5 mL微量離心管中，置于恒溫金屬浴中100℃ 15 min，于4℃冰箱過(guò)夜，常溫下13000r/min離心3 min，取上清液備用。

1.2.4 熒光定量PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化反應(yīng)條件的優(yōu)化主要包括引物探針濃度比和Mg2+濃度的選擇。為防止Real-time PCR反應(yīng)混合物中由于引物與探針之間的濃度不當(dāng)引起非特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制，選擇引物與探針的最佳濃度配比，獲得反應(yīng)的最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值（△Rn），提高反應(yīng)的擴(kuò)增效率與敏感度，試驗(yàn)在以相同濃度陽(yáng)性核酸為模板的反應(yīng)體系中，選用引物和探針的濃度分別為0.2μmoL/L、 0.4μmoL/L、0.6μmoL/L、0.8μmoL/L、 1.0μmoL/L，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針最佳濃度。另外，Mg2+會(huì)直接影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，同時(shí)還影響模板與Real-time PCR產(chǎn)物的變性溫度、產(chǎn)物的特異性，Mg2+濃度過(guò)低，Taq酶活力降低導(dǎo)致PCR產(chǎn)物量少，易造成假陰性，Mg2+ 的濃度過(guò)高，會(huì)增加引物二聚體的形成。合適的Mg2+ 的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的CT值，較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。在Real-time PCR反應(yīng)條件中調(diào)整Mg2+終濃度分別為2mM、2.5mM 、3mM 、3.5mM 、4mM、4.5mM、5mM，用相同濃度陽(yáng)性核酸為模板進(jìn)行檢測(cè)，以最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值（△Rn）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，確定Mg2+濃度。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)體系評(píng)價(jià)以無(wú)菌操作將上述10-1～10-5稀釋度菌液分別提取核酸DNA，用本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)靈敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)；選擇已知10株與O157:H7相關(guān)的腸道類(lèi)細(xì)菌分別提取核酸DNA進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)特異性；此外，對(duì)4個(gè)不同濃度O157:H7菌液作3次重復(fù)檢測(cè)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值的平均值和變異系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性或可重復(fù)性。

1.2.6反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)本研究所采用的Real-Time PCR反應(yīng)體系為25μL，體系組成：10xbuffer 2.5μL ,dNTP Mixture(各2.5mM) 2μl ,Ex Taq+酶（5U/μL）0.3μL ，Mg2+（25mM）4μL， 20μmoL/L 兩個(gè)引物各0.6μL，20μmoL/L探針0.8μl, 模板DNA 2μL，補(bǔ)DEPC水至25μL。然后用ABI7300 PCR儀按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)：94℃ 變性2min ，以 95℃5s、60℃ 40s 擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1菌落計(jì)數(shù)

將1 mL按10倍遞增稀釋至10-1～10-5濃度，選擇10-3、10-4、10-5 3個(gè)稀釋度各0.2 mL均勻鋪板48h培養(yǎng)后，可清晰觀察到培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌落。按同一稀釋度的3個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)相差不大且平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為標(biāo)準(zhǔn)，最終確定10-3鋪板的3個(gè)培養(yǎng)皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)34個(gè)來(lái)計(jì)算原菌液的細(xì)菌含量，按“平均菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)*5”計(jì)算得原菌液的細(xì)菌濃度為17x104cfu/ mL。

2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

在以相同濃度陽(yáng)性核酸為模板的反應(yīng)條件下，優(yōu)化的Ct值變化范圍在21.94～24.70之間。在引物濃度為0.6μmoL/L、 探針濃度為0.8μmoL/L時(shí)獲得的Ct值最低和熒光強(qiáng)度增加值（△Rn）最高，同時(shí)體系的穩(wěn)定性最好。在Mg2+的濃度優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)Mg2+的濃度變化對(duì)Ct值的影響不大，但當(dāng)Mg2+的終濃度為4mM時(shí)，熒光強(qiáng)度增加值（△Rn）最高，反應(yīng)的靈敏度最好（表2）。

2.3 方法的靈敏性

圖1顯示，O157:H7菌株純培養(yǎng)，TaqMan PCR法的最小檢出量為17cfu/ mL。

2.4 方法的特異性

采用以上最佳反應(yīng)條件TaqMan PCR方法對(duì)O157:H7及10種相關(guān)腸道細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：除O157:H7出現(xiàn)很好的陽(yáng)性結(jié)果外，其他細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。表明本文建立的TaqMan PCR檢測(cè)方法對(duì)大腸桿菌O157:H7有很好的特異性，與其它相關(guān)腸道細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 方法的重復(fù)性

對(duì)4種不同濃度的O157:H7菌液重復(fù)檢測(cè)3次，得到的Ct值進(jìn)行匯總（表2），4種濃度菌液檢測(cè)的結(jié)果均能判斷為陽(yáng)性，并且Ct值變異系數(shù)在合理范圍內(nèi)（最大為1.90 %，均小于5%）。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的O157:H7 TaqMan PCR檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性（表3）。

3 討 論

大腸桿菌O157:H7感染是一種食源性疾病，已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重影響食品安全。發(fā)展快速、特異、敏感的檢測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)、鑒定和流行病學(xué)調(diào)查是確保飲食安全、預(yù)防大腸桿菌O157:H7感染的重要手段。傳統(tǒng)的大腸桿菌O157:H7檢測(cè)主要靠分離培養(yǎng)和直接免疫熒光等方法，由于方法學(xué)本身的原因，其特異性和敏感性均受不同程度的限制。自1995年美國(guó)PE公司提出實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法后，實(shí)時(shí)PCR以其快速、定量、無(wú)需電泳、無(wú)交叉污染等突出優(yōu)點(diǎn)而被迅速推廣[6]。Real-Time PCR技術(shù)已應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)，使得食品中病原菌的檢測(cè)又提高了一個(gè)新的水平，無(wú)論從敏感性、特異性與速度上都具有優(yōu)勢(shì)，當(dāng)然它對(duì)引物和探針也提出了更高的要求[7]，因?yàn)橐锱c探針直接影響方法的特異性和靈敏性。為了保證方法的特異性，我們選取了與stxl／2、eaeA、hly等其它毒力基因相比，其特異性更強(qiáng)的編碼大腸桿菌O157:H7菌體抗原特異合成酶，并參與O抗原脂多糖的生物合成的基因rfbE作為檢測(cè)的特異性靶基因，最終確定了一對(duì)引物及一條特異性熒光探針,同時(shí)測(cè)定方法的靈敏度和擴(kuò)增效率，獲得檢測(cè)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度值(△Rn)。本研究對(duì)所建立的TaqMan PCR方法進(jìn)行了引物、探針濃度和Mg2+的濃度優(yōu)化，確定了反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，結(jié)果顯示當(dāng)引物和探針的濃度為0.6μmoL/L，0.8μmoL/L，Mg2+濃度為4 mmoL/L時(shí)，具有良好的特異性和敏感性。為了驗(yàn)證特異性，我們對(duì)大腸桿菌O157:H7菌株和金黃色葡萄球菌等10種相關(guān)腸道細(xì)菌菌株增菌分純，血清鑒定的菌種置于恒溫金屬浴中100℃ 15min，于4℃冰箱過(guò)夜，常溫下13000r/min離心3min，取上清液為模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它不僅特異性高，而且比傳統(tǒng)培養(yǎng)法和常規(guī)PCR更敏感、快速，也更簡(jiǎn)便。通常大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢出限為1×104cfu/ mL,全過(guò)程至少需要4～7天。而常規(guī)PCR檢測(cè)，一次反應(yīng)的敏感度在100cfu/ mL左右，從核酸DNA的提取， PCR擴(kuò)增與電泳整個(gè)過(guò)程大約需5～6小時(shí)左右，而采用本方法從核酸提取至完成檢測(cè)最快能在3小時(shí)內(nèi)完成，敏感度可達(dá)10cfu/ mL，而且該方法實(shí)行完全閉管式操作，避免了常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染和假陽(yáng)性的問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)建立的TaqMan PCR擴(kuò)增大腸桿菌O157:H7 -rfbE基因來(lái)檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的方法不僅靈敏性高、特異性好、檢測(cè)周期短、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，而且操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于食品微生物的快速檢驗(yàn)，而且成本低，具有較大的推廣及應(yīng)用價(jià)值。

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資助項(xiàng)目：湖州市科技局資助項(xiàng)目（2007YS15）

作者簡(jiǎn)介：徐德順（1967—），男，主管技師，學(xué)士。（收稿日期：2008-12-02）