盧嘉麗，王冬梅，苗愛清，楊得坡，陳建萍

(1. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510080；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東 英德 513000；3. 香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港)

嘌呤生物堿和茶多酚是茶Camelliasinensis葉中的主要活性成分，嘌呤生物堿主要是咖啡堿，一般占茶葉干質(zhì)量的2%～4%；茶多酚則包括兒茶素類(黃烷醇類)、黃酮及黃酮醇類、花青素類及酚酸化合物等幾大類，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)茶葉干質(zhì)量的18%～36%[1]，其中兒茶素類約為茶多酚總量的70%～80%。高效液相色譜法(HPLC)是茶多酚分離分析最常用的方法之一，但由于兒茶素類化合物結(jié)構(gòu)相似，使用二級(jí)管陣列檢測(cè)器(DAD)并不能準(zhǔn)確有效地鑒定出各個(gè)成分，若連接質(zhì)譜(MS)則能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。英紅1號(hào)、英紅9號(hào)是廣東省農(nóng)科院茶葉研究所培育的適制紅茶的大葉種優(yōu)良茶樹品種，祁門紅茶為小葉種紅茶品種，以其高香形秀享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。本文選取這3個(gè)紅茶品種作為研究對(duì)象，采用HPLC-DAD-MS/MS技術(shù)對(duì)其芽葉中的嘌呤生物堿和茶多酚進(jìn)行了定性和定量分析，從而比較這3個(gè)茶樹品種在相同生長(zhǎng)環(huán)境下芽葉中化學(xué)成分的組成特征。

1 材料與方法

1.1 材料

英紅1號(hào)、英紅9號(hào)和祁門紅茶的芽葉均采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園，按一芽三葉采摘后隔水蒸青5 min，80 ℃烘干，粉碎過40目篩，置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2種嘌呤生物堿對(duì)照品咖啡堿(CAF)和可可堿(TB)購自Sigma公司；8種兒茶素對(duì)照品(-)-沒食子兒茶素(GC)、(-)-表沒食子兒茶素(EGC)、(+)-兒茶素(C)、(-)-表兒茶素(EC)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、(-)-兒茶素沒食子酸酯(CG)購自Nacalai Tesque Inc.(Kyoto, Japan)，純度均大于98%。超純水(Millipore，USA)，乙腈為色譜純?nèi)軇?TEDIA，USA)，甲酸為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 HPLC-DAD-MS/MS分析條件

Waters 600E高效液相色譜儀，配備Waters 600E四元梯度輸送泵系統(tǒng)，Waters 717plus 自動(dòng)進(jìn)樣器，Waters 2996光電二極管陣列檢測(cè)器。Thermo Finnigan TSQ Quantum液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Surveyor光電二極管陣列檢測(cè)器，Surveyor自動(dòng)進(jìn)樣器，ESI/APCI離子源。

液相色譜條件：色譜柱Phenomenex Gemini C18(250 × 4.6 mm i.d., 5 μm)，保護(hù)柱Phenomenex C18(4 × 3.0 mm i.d., 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)和φ=1%甲酸水溶液(B)，A∶B的組成比從4∶96(0 min)線形上升為25∶75(60 min)；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；DAD掃描波長(zhǎng)范圍：200～700 nm。

質(zhì)譜條件：ESI離子化，正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)；離子化電壓：4 kV；噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣壓力：35 Arb；輔助氣壓力：11 Arb；毛細(xì)管溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：35 V；m/z掃描范圍：150～1 500 amu；MS2碰撞能量：35 eV。

1.3 供試品溶液、對(duì)照品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

取0.5 g茶樣，精密加入50 mL乙腈-水(1∶1，體積比)，室溫下超聲提取20 min，0.2 μm微孔濾膜過濾后備用。

精密稱取對(duì)照品適量，用水溶解后定容，得到對(duì)照品混合溶液中TB、GC、EGC、CAF、C、EC、EGCG、GCG、ECG的質(zhì)量濃度分別為0.04、0.04、1.02、0.53、0.05、0.48、3.05、0.04、0.46 mg/mL；將上述混合溶液繼續(xù)稀釋1.25、2.5、5、10、20倍，得到6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度分別進(jìn)樣3次，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1，結(jié)果表明各化合物在測(cè)定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。對(duì)此測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考察，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均在合格范圍，各成分的平均加樣回收率在97.11%～105.36%之間，RSD不大于3.11%。

表1 嘌呤生物堿和兒茶素類化合物定量分析的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2 結(jié) 果

2.1 英紅9號(hào)芽葉中嘌呤生物堿和茶多酚的定性分析

以英紅9號(hào)為例，HPLC色譜圖(275 nm)和正、負(fù)離子總離子流色譜圖，兒茶素混合對(duì)照品的HPLC色譜圖(275 nm)如圖1所示。通過與對(duì)照品的保留時(shí)間、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜信息進(jìn)行比較，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，鑒定出11個(gè)化合物，列于表2中，包括2種嘌呤生物堿可可堿和咖啡堿，7種兒茶素類化合物GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG。此外，還鑒定出5-沒食子酰奎寧酸酯(5-galloylquinic acid)和山柰酚-3-蕓香糖苷(kaempferol-3-rutinoside)2種非兒茶素類茶多酚。

表2 英紅9號(hào)芽葉中多酚類化合物和嘌呤生物堿的保留時(shí)間、紫外吸收及質(zhì)譜特征

圖1 英紅9號(hào)芽葉(A-1～A-3)和兒茶素混合對(duì)照品(B)的HPLC-UV-MS色譜圖

2.2 英紅1號(hào)、英紅9號(hào)和祁門茶樹芽葉中嘌呤生物堿和兒茶素類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

英紅1號(hào)、英紅9號(hào)和祁門茶樹芽葉的HPLC色譜圖(275 nm)見圖2，2個(gè)嘌呤生物堿和7個(gè)兒茶素類化合物的定量結(jié)果列于表3。英紅1號(hào)、英紅9號(hào)和祁門茶樹芽葉中的嘌呤生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本相近，可可堿約為0.2%，咖啡堿約為3%。這3個(gè)茶樹品種的兒茶素類總量均大于20%，但相同兒茶素類化合物在不同品種之間的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻有較大差異，其中英紅1號(hào)和祁門比較接近，EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為14.53%、10.64%。英紅9號(hào)的兒茶素類成分組成比例較特殊，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的不是EGCG(4.68%)，而是ECG(8.65%)；而且C(1.55%)、EC(3.4%)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于英紅1號(hào)和祁門。

圖2 英紅1號(hào)(A)、英紅9號(hào)(B)和祁門茶樹(C)芽葉的HPLC色譜圖(275 nm)

表3 英紅1號(hào)、英紅9號(hào)和祁門茶樹芽葉中嘌呤生物堿和兒茶素類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3)

3 討 論

通過HPLC-DAD-MS/MS分析，在英紅1號(hào)、英紅9號(hào)和祁門茶樹芽葉中準(zhǔn)確有效地鑒定出了2種嘌呤生物堿，7種兒茶素類化合物以及2種非兒茶素類茶多酚。英紅1號(hào)是由阿薩姆種子經(jīng)單株選育而成的無性系品種，英紅9號(hào)是在云南大葉種有性后代中經(jīng)單株選育而成的無性系品種，兩者均是廣東省農(nóng)科院茶葉研究所選育而成的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大葉紅茶品種；祁門紅茶品種原產(chǎn)地為安徽省祁門縣。這3個(gè)紅茶茶樹品種雖然在同一個(gè)茶園環(huán)境下種植生長(zhǎng)，但是芽葉中兒茶素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組成仍然反映出這3個(gè)品種的生化特性差異。英紅1號(hào)和英紅9號(hào)是大葉種C.sinensisvar.assamica，由于葉面積大，接受光照多，利于糖代謝，轉(zhuǎn)化成多酚類也豐富[1]，因此兒茶素類總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比小葉種C.sinensisvar.sinensis的祁門紅茶品種較高。一般來說，茶葉中兒茶素類化合物的組成中以EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，遠(yuǎn)高于其它兒茶素類化合物，其次是ECG和EGC，但在云南大葉種中ECG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻高于EGCG，而且EC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也高于EGC[6-7]。茶葉中兒茶素的生物合成首先形成的是EC和C等非酯型兒茶素，再經(jīng)過羥基化或沒食子?；?，才形成了沒食子兒茶素和兒茶素沒食子酸酯[1]。被認(rèn)為保持了原始特性的云南大葉種因此含有較多的EC、C和ECG。本研究中英紅9號(hào)的兒茶素類成分的組成也充分反映了云南大葉種的這一特性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊賢強(qiáng), 王岳飛, 陳留記, 等. 茶多酚化學(xué)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2003.

YANG Xianqiang, WANG Yuefei, CHEN Liuji, et al. Chemistry of tea polyphenols[M]. Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers, 2003.

[2] ZHU Xiaolan, CHEN Bo, MA Ming, et al. Simultaneous analysis of theanine, chlorogenic acid, purine alkaloids and catechins in tea samples with the help of multi-dimension information of on-line high performance liquid chromatography/electrospray-mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 34: 695-704.

[3] MIKETOVA P, SCHRAM K H, WHITNEY J, et al. Tandem mass spectrometry studies of green tea catechins. Identification of three minor components in the polyphenolic extract of green tea[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2000, 35: 860-869.

[4] RIO D D, STEWART A J, MULLEN W, et al. HPLC-MSn analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52: 2807-2815.

[5] PELILLO M, BONOLI M, BIGUZZI B, et al. An investigation in the use of HPLC with UV and MS-electrospray detection for the quantification of tea catechins[J]. Food Chemistry, 2004, 87: 465-470.

[6] SAIJO R, KATO M, TAKETA Y. Compositions and contents of catechins in various kinds of fresh tea leaves—comparisons between Assam variety and China variety[M]. In Food Flavors and Chemistry, 274; The Royal Society of Chemistry, 2001: 183-196.

[7] 徐仲溪, 劉仲華, 王坤波, 等. 綠茶多酚和兒茶素提取與原料品質(zhì)關(guān)系的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2004, 3(3): 257-260.

XU Zhongxi, LIU Zhonghua, WANG Kunbo, et al. On relationship between green tea polyphenols and catechins and green tea raw materials [J]. Journal of Hunan Agricultural University:Natural Sciences , 2004, 3(3): 257-260.