蒙華琳　曹　濤

摘 要：目的：探討附子對甲狀腺素大鼠主動脈血管細胞外基質(zhì)的影響。方法：按Woessn方法測定大鼠心肌和主動脈組織中羥脯氨酸含量，用酶譜分析半定量法分析MMP2活性。結(jié)果：①模型組大鼠心肌和主動脈膠原含量與正常對照組比較均明顯升高（P<0.05）；附子給藥組和粉防己堿給藥組與模型組相比明顯降低（P<0.05），與正常對照組比較沒有顯著差異（P>0.05）；②模型組主動脈MMP₂活性與正常對照組相比明顯下降（P<0.05）；附子給藥組、粉防己堿給藥組與模型組比較MMP₂活性略有上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），仍然不能恢復(fù)到正常水平；而心肌中MMP₂條帶較弱以至于不能分析。結(jié)論：附子抑制膠原合成但不能改變該模型大鼠主動脈血管MMP₂活性，說明附子預(yù)防心血管肥厚的機制與抑制其膠原合成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：L-甲狀腺素；L-羥脯氨酸；基質(zhì)金屬蛋白酶；心血管功能；附子

中圖分類號：R-332文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）02-0032-02

通常認為心血管肥厚是心肌細胞的肥大和主動脈血管中層平滑肌細胞的增生，同時伴有組分的重排和細胞外基質(zhì)的聚集和纖維化［1］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)在心血管肥厚的形成中起著重要的作用。對臨床高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠的研究表明，主動脈血管壁膠原（細胞外基質(zhì)的主要成分）生成和沉積增多是主動脈血管壁肥厚的重要原因之一［2］。在正常情況下，心血管組織中膠原合成水平和分解水平保持平衡，當合成大于分解水平時細胞外基質(zhì)含量增多。附子作為傳統(tǒng)的溫陽圣藥，在許多治療心血管肥厚的方劑中作為主藥使用。本研究通過測定膠原L-羥脯氨酸含量及細胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP₂）的活性（體內(nèi)降解膠原的主要蛋白酶）來分析膠原的分解水平，探討附子對細胞外基質(zhì)的影響機制。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

取適量L-甲狀腺素（L-Thy，Sigma公司），加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），配成質(zhì)量濃度為1g/L的混懸液備用。自制附子水煎液，濃度為含生藥2.7g/mL；粉防己堿（南寧植物原料藥廠，純度98.5%）；其它試劑均為市售，分析純。

1.2 動物模型及分組

雄性SD大鼠（由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），80只，體重220~240g。除對正常對照組頸背部皮下注射0.5%CMC-Na外，其余動物頸背部皮下注射L-Thy 4mg/（kg?d-1），造成心肌肥厚模型。造模后1周測尾血壓，根據(jù)血壓值將造模動物隨機分為4組（每組大鼠20只）：模型組、附子給藥組、粉防己堿給藥組和正常對照組。1周后開始灌胃給藥，按附子1mL/100g給藥，粉防己堿50mg/kg，其余兩組用雙蒸水灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。

1.3 組織膠原含量測定

按Woessn的方法［3］，將主動脈血管、心臟稱重，剪碎，加丙酮-乙醚（1∶1體積）混合液放置過夜，吸去上清液，晾干，110℃烤至恒重。心臟取樣5～10mg、主動脈血管取樣3～4mg，加6M HCI 1 mL，105℃水解24h，調(diào)至pH6.0，準確調(diào)整體積至5mL。3500rpm離心10min。取上清液0.5mL用UV754分光光度計γ560nm測定羥脯氨酸含量。

1.4 MMP2活性測定

采用酶譜法［3］測定心肌和主動脈血管MMP2活性。將蛋白溶液混合在5×樣品緩沖液中，SDS-PAGE電泳，37℃孵育過夜，考馬斯亮蘭G25O染色，脫色。陰性對照的孵育液中加入EDTA10mmol?L-1，作為基質(zhì)蛋白酶的抑制劑，結(jié)果未見相應(yīng)的降解條帶。數(shù)據(jù)用Bandscan4.0軟件分析處理：條帶酶解量=條帶面積/（條帶灰度-背景灰度）；MMP2比活=酶解量/樣品蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有參數(shù)均采用均數(shù)±標準差表示（±s），兩組比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 附子對甲狀腺素模型大鼠心肌和主動脈血管膠原含量的影響

本實驗以甲狀腺素大鼠為模型，測量心肌和主動脈血管膠原L-羥脯氨酸含量以反映該組織膠原含量。結(jié)果顯示：模型組大鼠心肌和主動脈血管膠原含量與正常對照組相比，均有明顯升高（P<0.05）。附子給藥組和粉防己堿給藥組與模型組相比，心肌和主動脈血管膠原含量有明顯降低（P<0.05），與正常對照組比較沒有顯著性差異（P>0.05），說明附子和粉防己堿具有抑制心血管組織膠原含量的作用。見表1。

2.2 附子對甲狀腺素模型大鼠心肌和主動脈血管MMP2活性影響

本實驗以測定甲狀腺素大鼠心肌和主動脈血管組織MMP2活性，反映組織膠原蛋白的分解水平。結(jié)果顯示：模型組主動脈MMP2活性與正常對照組相比明顯下降（P<0.05）；附子給藥組、粉防己堿給藥組分別與模型組比較，MMP2活性略有上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），仍然不能恢復(fù)到正常水平；而心肌中MMP2條帶較弱以至于不能分析。見表2。

3 討論

心肌和主動脈血管間質(zhì)主要由膠原纖維和糖蛋白組成。而膠原纖維主要由心肌間質(zhì)的成纖維細胞和主動脈血管平滑肌細胞產(chǎn)生和分泌的I和Ⅲ型膠原組成，I型膠原占總數(shù)的80%～85%，Ⅲ型占11%。前者聚合成粗纖維，后者聚合成細纖維，編織成纖維網(wǎng)絡(luò)，維持心肌和主動脈血管的結(jié)構(gòu)和功能的完整。膠原除了作為支撐材料外，還可以影響組織形態(tài)。膠原的沉積既是高血壓心血管重構(gòu)的結(jié)果，又是促進其進一步重構(gòu)的誘因。正常心血管間質(zhì)膠原處于不斷地分泌和降解的平衡狀態(tài)，一旦平衡失調(diào)，便造成病理狀態(tài)。間質(zhì)膠原生成過多或者分解過少都將引起膠原堆積以致細胞外基質(zhì)含量增多，這是導(dǎo)致心血管重構(gòu)的重要原因［1］。

本研究以甲狀腺素大鼠為模型，測量心肌和主動脈血管L-羥脯氛酸含量以反映該組織膠原含量。因為L-羥脯氨酸是膠原中特有的氨基酸，其含量約占膠原中所有氨基酸的13.4%，由于其在其他蛋白質(zhì)中的含量極低，組織中L-羥脯氨酸量的高低可反映該組織膠原含量的大小。本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素造模后4周心肌和主動脈壁膠原含量明顯增高，說明膠原含量的增高是導(dǎo)致心血管肥厚的重要原因之一。

除了膠原的合成外，膠原的分解主要依靠膠原降解酶-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）來完成［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），是體內(nèi)降解膠原的主要蛋白酶，血管主要有MMP₂（72KU）、MMP₉（92KU）等。MMPs在機體內(nèi)主要以非活性的酶原形式存在。非活性狀態(tài)MMPs可被胰蛋白酶、中性蛋白酶和汞劑等激活為62Ku MMPs。本研究采用酶譜半定量測定法［4］分析MMP₂活性。此方法可以分離不同的MMPs以及將組織中與MMPs緊密結(jié)合的組織抑制劑MMPs分離，又可直接顯示其活性條帶。從研究結(jié)果看出，造模4周主動脈中MMP₂活性降低，可能與組織血管緊張素Ⅱ含量上升，抑制MMP₂有關(guān)［5］。作為鈣通道阻斷劑，粉防己堿可升高MMP₂活性，加快對膠原的降解，是其抑制血管重構(gòu)的機制之一。而附子對MMP₂活性無明顯影響，推測一方面由于AP-1是許多MMPs基因啟動子結(jié)合位點［6］，作為AP-1抑制劑的附子，參與調(diào)節(jié)該酶的活性過程，可阻斷MMP₂的基因表達，并抑制MMP₂的活性［4］；另一方面，附子抑制溶酶體酶的釋放，而后者激活MMPs，所以附子可部分降低合成好的膠原的降解速度［7］。也可能是用藥時間尚未到達逆轉(zhuǎn)的程度。其確切的機制有待進一步研究。心肌中MMP₁是主要降解膠原的酶，一般以酶原形式存在且活性極低。該酶激活后使三股旋轉(zhuǎn)的膠原肽鏈展開，從而促使其它膠原酶如MMP₂，MMP₉進一步分解膠原纖維［8］。使心肌中的MMP₂活性極低以至于無法分析。因此，附子抑制膠原合成但不能改變該模型大鼠主動脈血管MM₂活性，說明附子預(yù)防心血管肥厚的機制與抑制其膠原合成有關(guān)。

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（責任編輯：陳涌濤）