朱露莎　畢明剛　季宇彬

摘 要：目的：觀察銀翹散（YQS）對(duì)流感病毒感染胸腺缺陷小鼠細(xì)胞因子的影響。方法：以流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1）感染小鼠為模型，采用銀翹散灌胃治療。用ELISA法分別檢測(cè)感染后第1、3、5、7天小鼠血清中IFN-γ、IgG的含量。結(jié)果：銀翹散各給藥組IFN-γ的含量明顯降低，與病毒感染模型組比較差異有顯著性意義（P<0.01），銀翹散各治療組與感染模型組的IgG含量，差異不是十分顯著（P>0.05）。結(jié)論：銀翹散可以降低血清中IFN-γ，說(shuō)明銀翹散可以降低炎性因子的表達(dá)，從而減少炎性損傷。IgG含量與感染模型組差異不是十分顯著，有可能因?yàn)樵诓《靖腥驹缙?，機(jī)體只能產(chǎn)生低水平低親和力的抗體。

關(guān)鍵詞：銀翹散；流感病毒；細(xì)胞因子

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）02-0013-03

銀翹散(YQS)由連翹、銀花、苦桔梗、薄荷、竹葉、生甘草、芥穗、淡豆豉、牛蒡子9味中藥組成，為治療溫病之首方，是辛涼清解的代表方劑，以其治療風(fēng)溫、溫?zé)岵∫约澳承╇s病（屬于邪在衛(wèi)分、上焦）而聞名，并一直沿用至今?，F(xiàn)代臨床上用于治療流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、皰疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾?。?］。本實(shí)驗(yàn)觀察了該藥對(duì)流感病毒感染胸腺缺陷小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、TGF-β1及IgG含量的影響，從分子水平探討該藥治療病毒性呼吸道感染的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及毒株

銀翹解毒口服液：批號(hào)070301，河北華威制藥有限公司。病毒唑：批號(hào)070609，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司。病毒：流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1），由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，雞胚傳代后，血凝滴度為1:512，-70℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ颐?、生理鹽水：由北京化學(xué)試劑公司提供。小鼠IFN-γ、TNF-αELISA試劑盒購(gòu)自晶美生物工程（北京）有限公司，小鼠TGF-β1及IgG試劑盒購(gòu)自Biotechnology Systems公司。

1.1.2 動(dòng)物及分組

BALB/c nu/nu免疫缺陷裸小鼠，雌雄各半，共72只，體重18~20g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司。按體重隨機(jī)分組原則，將BALB/c nu/nu裸鼠分為正常對(duì)照組，模型組，病毒唑陽(yáng)性藥組，銀翹散高、中、低劑量治療組，各組按感染后1天、3天、5天、7天不同時(shí)相各分為4小組，每小組3只，分別標(biāo)記，分籠飼養(yǎng)，所有動(dòng)物自由攝食和飲水，控制溫度濕度（18～25℃和55％±2%）。

1.1.3 儀器

微孔板掃描酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)，微量加樣器，CO2恒溫培養(yǎng)箱，Labofuge 400R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)，DEM-Ⅲ型自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

以乙醚輕度麻醉小鼠后，BALB/c nu/nu裸鼠正常對(duì)照組以生理鹽水30μL/只滴鼻，其余各組以FM1株病毒液30μL/只滴鼻。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)給藥

感染1小時(shí)后給藥，給藥體積為0.2mL/10g，病毒唑組每次腹腔注射0.07g/kg/d，銀翹散高中低劑量組分別為40g/kg/d、20g/kg/d、10g/kg/d。正常空白組、感染模型組灌服生理鹽水。

1.2.4 取材

分別于感染24、72、120、168h后，各組小鼠摘眼球取血，離心分離血清，放入-20℃冰箱中保存待測(cè)，脫頸椎處死小鼠，無(wú)菌取胸腺、脾臟、雙側(cè)后肢股骨骨髓，以備它用。

1.2.5 觀察指標(biāo)及方法

小鼠血清IFN-γ、IgG含量的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法，檢測(cè)程序按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。在進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)時(shí)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 YQS對(duì)流感病毒FM1感染小鼠血清IFN-γ含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，流感病毒感染小鼠后，感染模型組各時(shí)相IFN-γ的含量較正?？瞻捉M均有所增加，且各時(shí)間點(diǎn)二者比較，差異顯著（P<0.01）。其中第1、3天呈逐日上升趨勢(shì)，第3天達(dá)峰值，第5天開(kāi)始下降。銀翹散各劑量組以及病毒唑組IFN-γ在各時(shí)間點(diǎn)的走勢(shì)與感染模型組相同，但I(xiàn)FN-γ的含量較感染模型組均有所下降，差異顯著（P<0.01）。說(shuō)明銀翹散可以抑制病毒感染后IFN-γ的表達(dá)。

各組比較見(jiàn)圖1。

2.2 YQS對(duì)流感病毒FM1感染小鼠血清IgG含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，流感病毒感染后，病毒感染組與銀翹散高、中、低劑量組各時(shí)間點(diǎn)的IgG的走勢(shì)大致相同，呈逐漸上升趨勢(shì)，但各組的IgG含量都很低。治療組的IgG含量略低于感染模型組，差異不是十分顯著（P>0.05）。有可能因?yàn)樵诓《靖腥驹缙?，機(jī)體只能產(chǎn)生低水平低親和力的抗體，通常在感染后最初2周達(dá)高峰。

各組比較見(jiàn)圖2。

3 討論

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，起病急驟，以全身中毒癥狀為主，亦可引起病毒性肺炎。流感病毒侵襲機(jī)體，病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并可入血，從而形成病毒血癥。病毒作用于機(jī)體后，機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)于病毒可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生一些超過(guò)生理濃度的細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子釋放入血后，其中具有致熱作用的因子即可引起發(fā)熱等全身中毒癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，病理濃度的TNF-α、IL-1、IFN等都具有致熱作用。IFN-γ的致熱性作用方式可能是通過(guò)促進(jìn)LPS而誘生IL-1。中醫(yī)復(fù)方治療病毒感染性疾病的優(yōu)勢(shì)并非單純抗病毒本身，雖與促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)，卻不能單純用促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答來(lái)解釋?zhuān)浏熜C(jī)制可能與其抑制或調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥免疫病理反應(yīng)有關(guān)。IFN-γ主要由活化的Th1和NK細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體抗病毒感染中最重要的細(xì)胞因子之一。它不僅可以阻止病毒在體內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散，而且能對(duì)許多免疫細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ及TNF-α可調(diào)節(jié)單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子，如在短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生TNF-α，IFN-γ將全身大量單核巨噬細(xì)胞激活，產(chǎn)生大量超氧陰離子導(dǎo)致組織器官的嚴(yán)重?fù)p傷［2］；同時(shí)，IFN-γ可促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化，激活單核-巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎性因子如TNF-α，IL-6，IL-1的產(chǎn)生，從而造成炎性損傷。因此內(nèi)源性IFN-γ雖是維持機(jī)體抗感染所必不可少，但大量產(chǎn)生則又“走向問(wèn)題的反面”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染模型組的IFN-γ含量與正?？瞻捉M比較，有所提高，二者比較，有顯著性差異，銀翹散組IFN-γ含量較之模型組有所減少，而且二者比較，亦有顯著性差異。說(shuō)明銀翹散可以抑制病毒感染后IFN-γ的表達(dá)，降低炎性因子的表達(dá)，從而減少炎性損傷。。關(guān)于流感病毒感染小鼠后，血清中IFN-γ的表達(dá)，有些資料［3］顯示IFN-γ升高，而有些資料［4］顯示降低。究竟流感病毒感染對(duì)IFN-γ的產(chǎn)生是抑制還是促進(jìn)，有待于進(jìn)一步探討。

病毒感染可誘導(dǎo)3種抗體：IgG、IgM、IgA。其中IgG是最重要的一類(lèi)抗體，能直接中和體液中的病毒。盡管體液免疫在病毒感染后被激活，但在病毒感染早期，機(jī)體只能產(chǎn)生低水平低親和力的抗體，通常在感染后最初2周達(dá)高峰，以后開(kāi)始下降。本實(shí)驗(yàn)中各組的IgG含量都很低。治療組的IgG含量略低于感染模型組，差異不是十分顯著（P>0.05），有可能因?yàn)樵诟腥境跗?，IgG水平比較低，也有可能因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選用的老鼠是胸腺缺陷小鼠，有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞及吞噬細(xì)胞功能障礙均可使自身完好的B細(xì)胞發(fā)生障礙而產(chǎn)生Ig或抗體缺乏癥。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，還可以發(fā)現(xiàn)，流感病毒所致機(jī)體的免疫狀態(tài)是一個(gè)龐雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，各種細(xì)胞因子相互促進(jìn)又相互制約，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生成的分子機(jī)制是復(fù)雜的，值得進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 吳幸周.銀翹散現(xiàn)代臨床運(yùn)行的文獻(xiàn)研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文，2006:6-8.

［2］ 周炳榮.IFN-γ及TNF-α調(diào)節(jié)單核吞噬細(xì)胞超氧陰離子及在抗感染中的作用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)?免疫學(xué)分冊(cè)，1994(2):65.

［3］ Robert NJ JL. The limited role of the human interferon systerm response to respiratory syneytial virus challenge， Analysis and comparison to influenza virus challenge［J］.Microb Pathog， 1992， 12:49.

［4］ 王飛，胥方元， 馬萍，等. 感冒清口崩片對(duì)流感病毒FM1感染小鼠細(xì)胞因子水平的影響［J］. 中藥藥理與臨床，2007，23(5):169-170.

（責(zé)任編輯：陳涌濤）