劉天強(qiáng)　肖　丹

摘要：在中藥滴眼液的研發(fā)中，尋找一種簡(jiǎn)單、快速的刺激性評(píng)價(jià)方法體系非常必要。兔眼刺激試驗(yàn)(TheDraize test)作為眼部安全評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已逾幾十載，缺點(diǎn)較多：評(píng)分系統(tǒng)主觀性強(qiáng)、動(dòng)物外推至人種屬差異大、實(shí)驗(yàn)室間變異性大等。許多實(shí)驗(yàn)室在近20年間相繼提出了新的體外試驗(yàn)方法，對(duì)體外眼刺激性試驗(yàn)方法進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞：Draize眼刺激試驗(yàn)；刺激性；體外試驗(yàn)；綜述

中圖分類號(hào)：R246.82文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197(2009)05-0130-03

毒理學(xué)一直致力于保證人類免受各種物質(zhì)的傷害，如藥品、化工產(chǎn)品、化妝品及家庭用品等。最易導(dǎo)致偶然接觸傷害的部位一般是眼睛和皮膚。這種由化合物刺激導(dǎo)致的生理反應(yīng)一般稱為刺激性，包括客觀的生理變化(局部紅腫、水腫)和主觀感受(瘙癢、疼痛)。在生產(chǎn)、使用這些物品時(shí)，都需要對(duì)其刺激性進(jìn)行評(píng)價(jià)。時(shí)至今日，最可靠的安全性評(píng)價(jià)方法還依賴于動(dòng)物試驗(yàn)。但是當(dāng)今社會(huì)，動(dòng)物福利日益受到重視，兔眼刺激性試驗(yàn)在倫理、科學(xué)上均受到質(zhì)疑，因此尋找節(jié)約高效的試驗(yàn)方法推動(dòng)了眼刺激性試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的進(jìn)展。

1Draize兔眼刺激性試驗(yàn)簡(jiǎn)介

隨著制藥工業(yè)的發(fā)展，特別是一些對(duì)眼睛有副作用的藥物的發(fā)現(xiàn)，在20世紀(jì)初形成了眼毒理學(xué)。其主要研究目標(biāo)之一是建立一種能用于評(píng)價(jià)新物質(zhì)潛在刺激性的方法。

Jonas Friedenwald(1897-1955)提出了采用對(duì)眼睛各部位毒性分別進(jìn)行等級(jí)評(píng)分的方法評(píng)價(jià)刺激性的方法體系。在Friedenwald的基礎(chǔ)上，John H.Draize(1900-1992)和他的同事在1944年提出了一種新的評(píng)價(jià)方法，該方法采用皮膚和兔眼作為試驗(yàn)對(duì)象，描述了如何進(jìn)行劇烈的、溫和的和長(zhǎng)期刺激性的評(píng)價(jià)。這些方法相繼被其它實(shí)驗(yàn)室用以篩選化合物刺激性，被稱為“Draize試驗(yàn)”。此后，Draize的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)被FDA采用并用以評(píng)價(jià)某些物質(zhì)的安全性，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里被FDA視為當(dāng)時(shí)最有價(jià)值和最可靠的方法，有金標(biāo)準(zhǔn)(Golden standard)之稱。由于該方法每個(gè)步驟都要認(rèn)真審查和觀察，其重復(fù)性、關(guān)聯(lián)性、經(jīng)費(fèi)及倫理等諸多方面均遭到了科學(xué)界的質(zhì)疑與批評(píng)，20世紀(jì)60年代，這種試驗(yàn)方法更是遭到廣泛的批評(píng)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化較大導(dǎo)致試驗(yàn)重復(fù)性較差，特別是輕微刺激性更為明顯。Draize test結(jié)果重復(fù)性較差主要源于兩個(gè)方面。其一，受試動(dòng)物兔的種屬個(gè)體差異難以控制；其二，試驗(yàn)員在對(duì)兔眼的觀察和評(píng)分上存在的諸多差異難以控制。雖然可以通過(guò)擴(kuò)大樣本容量和培訓(xùn)試驗(yàn)員來(lái)減少這些誤差，但是重復(fù)性較差的缺點(diǎn)還是難以克服。

相同種屬的動(dòng)物可以以各種不同的方式對(duì)刺激性物質(zhì)進(jìn)行應(yīng)急，不同的試驗(yàn)者在相同的試驗(yàn)中可能得到不同的數(shù)據(jù)。加之兔眼的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)和人眼也不盡相同，如：兔眼眼淚產(chǎn)量相對(duì)較少，眨眼頻率與人眼不同，眼表面的敏感性較人眼差。Draize test只是從炎癥和毒性兩個(gè)方面的表現(xiàn)對(duì)刺激性進(jìn)行評(píng)價(jià)，難以全面反映刺激性作用。其外部的觀察只能將結(jié)果限制在某幾種特定的變化中，不能夠探知其內(nèi)在的機(jī)制。當(dāng)受試物質(zhì)直接接觸外眼時(shí)，不僅能造成毒性損傷與炎癥反應(yīng)，還能帶來(lái)煩躁、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、結(jié)構(gòu)變化、各種分子的改變以及全身效應(yīng)。而這種眼部刺激性試驗(yàn)卻難以全面體現(xiàn)這些變化。這種人眼與兔眼的關(guān)聯(lián)性遭到質(zhì)疑也就在所難免。

很多科學(xué)家對(duì)Draize test主要根據(jù)兩種思路進(jìn)行修訂，一種是用盡量少的動(dòng)物挖掘盡量多的信息，同時(shí)保證其與人眼反應(yīng)的較好相關(guān)性。另外一種是避免直接將化合物作用于眼，而是先進(jìn)行皮膚刺激性試驗(yàn)?？茖W(xué)家在Draize test的基礎(chǔ)上研究形成了一種新的可被用作替代Draize test的體內(nèi)研究方法，稱作低容量眼部試驗(yàn)法(10wvolume eyetest：LVET)，該方法相比Draizetest與人眼具有更好的相關(guān)性，優(yōu)于Draize試驗(yàn)，被證明是一種可以接受的替代方法。但LVET與Drame test都過(guò)高估計(jì)了人眼對(duì)刺激物的反應(yīng)。

2Draize eye test體外試驗(yàn)方法概述

為了將試驗(yàn)給動(dòng)物帶來(lái)的痛苦降到最低程度，人道主義者提出了3R(Replacement，Reduction，Refinement)的理念，提出了多種多樣的體外試驗(yàn)方法，這些方法運(yùn)用的技術(shù)越來(lái)越先進(jìn)，檢測(cè)的范圍與部位也越來(lái)越豐富，現(xiàn)將這些常用的體外試驗(yàn)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)簡(jiǎn)述如下。

2.1紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)(Red Blood Cells Test)

用多因素分析方法發(fā)現(xiàn)Draize test的檢測(cè)原理大部分可以用蛋白變性和細(xì)胞膜破壞來(lái)解釋。由此發(fā)展了基于測(cè)定從紅細(xì)胞中漏出的血紅蛋白的量來(lái)評(píng)價(jià)膜損傷的試驗(yàn)方法——溶血試驗(yàn)(Hemolysis test)。RBCs試驗(yàn)用來(lái)評(píng)價(jià)某些受試物引起的細(xì)胞初始反應(yīng)(例如接觸化合物后的角膜渾濁度改變)，這些受試物主要損傷細(xì)胞胞漿膜以及使某些蛋白質(zhì)變性；而非刺激性物質(zhì)則不會(huì)造成這樣的反應(yīng)。該方法的假說(shuō)認(rèn)為這種反應(yīng)與眼部組織的刺激反應(yīng)所產(chǎn)生的初始事件具有一定的相關(guān)性。該方法通過(guò)分光光度法測(cè)定化學(xué)物作用后的紅細(xì)胞懸液吸光度，計(jì)算出溶血率和HC50值(即使50％紅細(xì)胞溶血的受試物的濃度值)用作評(píng)價(jià)受試物的刺激性指標(biāo)。

RBCs試驗(yàn)是一種作用機(jī)制明確、不需用特殊的儀器和設(shè)備、操作快速簡(jiǎn)便、不需無(wú)菌處理、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。但該法檢測(cè)終端過(guò)于單一，難以替代Draize test用于全面評(píng)價(jià)受試物的刺激性，只能用于粗篩試驗(yàn)。

2.2血紅蛋白變性試驗(yàn)(Haemoglobin Denaturation Test)

血紅蛋白變性試驗(yàn)(Haemoglobin Denaturation test，HD test)是用評(píng)價(jià)蛋白變性的指標(biāo)RDC50(血紅蛋白變性率為50％的受試物濃度)和1％λmax(1％受試物的最大可吸收波長(zhǎng)變化值)來(lái)預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)的眼刺激性的一種試驗(yàn)方法。這種方法的理論基礎(chǔ)是眼刺激性反應(yīng)是由一系列的蛋白質(zhì)變性所引起的，而血紅蛋白變性時(shí)會(huì)引起吸光度特性的改變，利用血紅蛋白變性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)表面活性劑對(duì)血紅蛋白結(jié)構(gòu)活性的量化改變作為評(píng)價(jià)刺激性的指標(biāo)。最初的方法是通過(guò)吸光度值計(jì)算血紅蛋白的變性率而建立的。后來(lái)發(fā)明者提出了新的方程式用以與Draize分值進(jìn)行相關(guān)性研究，比如進(jìn)行l(wèi)og數(shù)值代換等。Hayashi T等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)變性試驗(yàn)(HD test)與紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)(RBCs test)聯(lián)合試驗(yàn)結(jié)果與Draize評(píng)分的相關(guān)性非常高。在刺激性評(píng)價(jià)中，應(yīng)適當(dāng)考慮二者結(jié)合進(jìn)行。該法不需要特別設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)流程短，可大大縮短粗篩的時(shí)間。但血紅蛋白變性試驗(yàn)不能用于在418 nm有強(qiáng)吸收峰的有色物質(zhì)和超過(guò)磷酸鹽緩沖液范圍的強(qiáng)酸，也不能檢測(cè)磷酸

鹽變性以外的因素引起的眼刺激性。

2.3基于雞胚尿囊絨膜試驗(yàn)(Chorioallantoic Membrane-based Assays)

受精雞卵尿囊絨膜試驗(yàn)(Hen's egg test-ehorioallantoic-membrane，HET-CAM)利用尿囊絨膜(CAM)與結(jié)膜結(jié)構(gòu)相似的特點(diǎn)，通過(guò)以下兩種方法檢測(cè)化學(xué)物對(duì)CAM的損傷來(lái)評(píng)價(jià)其眼刺激性。顯微鏡觀察法(HET-CAM score)是用解剖顯微鏡觀察經(jīng)化學(xué)物作用后不同時(shí)間段CAM血管的損傷情況，以出現(xiàn)溶血(hemolysis)、出血(haemorrhage)和凝血(coagulation)作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。臺(tái)盼藍(lán)染色法(CAM-TB)是通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)化學(xué)物處理后CAM吸收的臺(tái)盼藍(lán)量來(lái)評(píng)價(jià)CAM的損傷。

用CAM方法評(píng)估特定種類化學(xué)品眼刺激性的試驗(yàn)都顯示較滿意結(jié)果。CAM試驗(yàn)?zāi)芎芎妙A(yù)測(cè)角膜混濁和虹膜炎癥；比較而言，HET-CAM分析表面活性劑類產(chǎn)品的效果較好，CAMVA分析醇類效果較好。運(yùn)用該種方法每天可以檢測(cè)大量受試物，且不需要特殊儀器，有快速、靈敏、簡(jiǎn)單和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)。由于使用的是孵育第10天的雞卵，CAM上沒(méi)有神經(jīng)支配，避免了對(duì)雞胚造成的痛苦并可減少動(dòng)物的使用量，符合“3R”精神。

2.4離體器官試驗(yàn)(The Enueleated Eye Test)

離體眼球試驗(yàn)(The Enucleated Eye Test簡(jiǎn)稱EET)是一種非常有價(jià)值的眼刺激性評(píng)價(jià)方法。該方法使用離體眼球，其試驗(yàn)系統(tǒng)非常接近體內(nèi)試驗(yàn)，無(wú)需活體動(dòng)物。該試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)角膜水腫、混濁及熒光素滯留，并進(jìn)行組織學(xué)觀察評(píng)估受試物的眼刺激性。在這些測(cè)定指標(biāo)中，角膜水腫客觀性和區(qū)分不同刺激性物質(zhì)的敏感度都較高，再輔以渾濁度和熒光素滯留量?jī)芍笜?biāo)，形成了一種具有相當(dāng)說(shuō)服力的評(píng)價(jià)眼刺激性的試驗(yàn)方法。包括離體兔眼、豬眼、雞眼等試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，現(xiàn)在主要作為一種評(píng)價(jià)各種產(chǎn)品及其成分、個(gè)體化合物等是否對(duì)眼部具有腐蝕性和嚴(yán)重刺激性的篩選方法。該法也可作為體外聯(lián)合評(píng)價(jià)試驗(yàn)的篩選方法之一。

2.5細(xì)胞試驗(yàn)(Cell Cultrue)

細(xì)胞毒性試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)染料或其代謝產(chǎn)物的攝取、還原、排斥、釋放及炎性介質(zhì)漏出等變化，反映受試物對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及存活力的影響。采用該研究思路，國(guó)外建立了多種細(xì)胞模型，采用檢測(cè)多種指標(biāo)評(píng)價(jià)物質(zhì)潛在的刺激性，檢測(cè)的指標(biāo)主要包括細(xì)胞增殖、膜完整性和細(xì)胞活性。兔眼角膜上皮細(xì)胞就是較早用于該領(lǐng)域的細(xì)胞模型，主要通過(guò)LDH和MTT兩種方法進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)。O.Doucet等利用人眼角膜細(xì)胞建立三維上皮模型，以細(xì)胞毒性反應(yīng)為終點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。檢測(cè)終點(diǎn)也發(fā)展到對(duì)一些微觀指標(biāo)的測(cè)定，如細(xì)胞因子含量等，例如Debbasch等發(fā)現(xiàn)以IL-8釋放為終點(diǎn)的人類角膜上皮細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種敏感而可靠的預(yù)測(cè)人類輕微眼刺激性產(chǎn)品的方法。

2.6商業(yè)試劑盒

采用兔角膜上皮細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)方法而建立的CornePack試劑盒，具有靈敏度高、可應(yīng)用于有色物質(zhì)的估測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但是與其它細(xì)胞毒性方法相比，對(duì)不溶物質(zhì)檢測(cè)，其重現(xiàn)性不好，而且與體內(nèi)試驗(yàn)的相關(guān)性較差。Gor-don和Bergman采用分光光度計(jì)測(cè)定合成蛋白質(zhì)基質(zhì)中的渾濁度來(lái)估測(cè)受試物對(duì)眼的刺激性，建立了EYTEX試驗(yàn)系統(tǒng)。將人的鱗狀上皮細(xì)胞和基質(zhì)纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)在尼龍表面，形成有氣液表面的上皮層原型而建立的SKIN2^TMZK1200試劑盒，其結(jié)構(gòu)類似于眼角膜和結(jié)膜。Kurishita等用此模型驗(yàn)證了39種化妝品成分的刺激性，發(fā)現(xiàn)相關(guān)性較好(r＝0.71)。

2.7其它

Adriaens.E等使用蛞蝓黏膜刺激性試驗(yàn)(SlugMucosal Irritation assay SMI)作為篩選眼刺激性的試驗(yàn)方法，該法通過(guò)檢測(cè)蛞蝓粘膜表面暴露于受試物以后的蛋白質(zhì)變化和酶的釋放評(píng)價(jià)刺激性，可以檢測(cè)出熱和燒灼感的影響，這是其它體外方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。研究表明，該試驗(yàn)是一種有希望的篩選眼刺激性物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法，但耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合大批量的篩選試驗(yàn)。

3結(jié)論與展望

現(xiàn)階段提出的一些體外試驗(yàn)方法雖然在一定程度上能夠反應(yīng)出其對(duì)眼部的刺激性，但是每種方法都有其各自的缺點(diǎn)，沒(méi)有一種方法能像Draize test一樣具有多功能、多指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果，所以幾乎沒(méi)有一種方法能夠被官方所認(rèn)可接受用以替代Draize test。

當(dāng)今國(guó)際上流行的化學(xué)物眼刺激檢測(cè)策略有兩種：多層試驗(yàn)(TIERED TEST)和同步聯(lián)合試驗(yàn)(BATTERY TEST)。多層試驗(yàn)又稱逐步檢測(cè)策略，即通過(guò)文獻(xiàn)資料、理化性質(zhì)等對(duì)化學(xué)物的刺激性預(yù)先估測(cè)，然后進(jìn)行體外試驗(yàn)即替代試驗(yàn)，對(duì)不能確定刺激效應(yīng)的物質(zhì)才進(jìn)行少量動(dòng)物的確定性試驗(yàn)。同步聯(lián)合試驗(yàn)根據(jù)刺激作用發(fā)生的機(jī)制，采用多種體外試驗(yàn)相結(jié)合的方式進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，比如用細(xì)胞毒性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)變性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞毒性試驗(yàn)等幾個(gè)試驗(yàn)相結(jié)合，共同預(yù)測(cè)化合物的眼刺激性。但在對(duì)體外方法進(jìn)行同步聯(lián)合試驗(yàn)的過(guò)程中，需要發(fā)展合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或建立有效的預(yù)測(cè)模型。

目前我國(guó)在這方面的研究剛剛開(kāi)始，與國(guó)外差距較大，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有學(xué)者開(kāi)始嘗試進(jìn)行了這方面的實(shí)驗(yàn)研究，但是這種研究的深度與廣度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，我國(guó)學(xué)者在這一研究領(lǐng)域的發(fā)展空間十分廣闊。將這一領(lǐng)域的研究成果運(yùn)用于中藥滴眼液的研發(fā)必將加快這一產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

責(zé)任編輯曾楚華