張 群 楊光輝 叢笑倩 崔 磊 張文杰 劉 偉 曹誼林

毛囊干細(xì)胞表皮膜片修復(fù)裸鼠皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張 群 楊光輝 叢笑倩 崔 磊 張文杰 劉 偉 曹誼林

目的開發(fā)新的組織工程表皮替代物，利用毛囊干細(xì)胞-殼聚糖明膠膜片（Chitosan-gelatin membrane，CGM）進(jìn)行修復(fù)裸鼠皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究。方法將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞接種于CGM，構(gòu)建組織工程表皮膜片，裸鼠背部作直徑1 cm的全層皮膚缺損，將毛囊干細(xì)胞-CGM復(fù)合物覆蓋創(chuàng)面?；刂埠?周、4周和12周分別進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測。結(jié)果毛囊干細(xì)胞在CGM上生長良好。毛囊干細(xì)胞－CGM修復(fù)裸鼠后1周切片示創(chuàng)面有新生上皮覆蓋，表皮分化良好，而對照組殘留較大未愈創(chuàng)面。修復(fù)后4周和12周可見對照組收縮較實(shí)驗(yàn)組顯著。結(jié)論體外構(gòu)建的毛囊干細(xì)胞-CGM可以修復(fù)裸鼠皮膚缺損。

毛囊干細(xì)胞殼聚糖明膠膜片皮膚缺損

表皮是人體與外界接觸的第一道屏障，主要起保護(hù)防御功能，可防止體液丟失和病原體侵入。應(yīng)用組織工程原理，將體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞接種于有良好生物相容性的支架材料上，經(jīng)體外培養(yǎng)形成皮片，然后移植于燒傷、慢性皮膚潰瘍等皮膚創(chuàng)面處，可實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷的修復(fù)和重建。但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，移植物中缺乏干細(xì)胞導(dǎo)致療效不佳。只有將干細(xì)胞融入組織工程化組織的構(gòu)建之中，才有可能使得構(gòu)建的組織移植回體內(nèi)后能夠長期存活，并維持自我更新的能力。研究發(fā)現(xiàn)，毛囊干細(xì)胞比毛囊間表皮干細(xì)胞更有增殖能力[1]，并具有慢周期性和巨大的增殖潛能，利用毛囊干細(xì)胞的無限增殖能力可以使創(chuàng)面得到完全修復(fù)，因此相關(guān)研究正日益受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞，接種于殼聚糖明膠材料（Chitosan-gelatin membrane，CGM）上構(gòu)建組織工程表皮膜片，并用毛囊干細(xì)胞-CGM來修復(fù)裸鼠背部的全層皮膚缺損，進(jìn)行毛囊干細(xì)胞修復(fù)皮膚缺損的探索性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

整形外科手術(shù)廢氣的成人頭皮15例；分離毛囊的器械包括眼科剪刀、鑷子、解剖顯微鏡和顯微器械；中性蛋白酶（Dispase，Gibco公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；Ⅳ型膠原涂被的培養(yǎng)皿；K-SFM(Define Keratinocyte Serum Free Medium)培養(yǎng)液，添加EGF和牛垂體提取物（Gibco公司）；鼠抗人單克隆抗體CK；兔抗人單克隆抗體LAMINE；Balb/c-Nu裸鼠（中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛囊干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

毛囊干細(xì)胞的富集方法同文獻(xiàn)[2]。

1.2.2 殼聚糖明膠膜片的制備

將含2%殼聚糖的乙酸溶液與4%的明膠溶液混合，室溫下快速攪拌混合12 h，將一定量的混合液加入培養(yǎng)皿中，干燥成膜；將膜浸泡于20 mL含有2-嗎啡乙磺酸的40%乙醇中30 min，棄去液體，30 mmol/L碳化二亞胺溶液反應(yīng)2 h，大量蒸餾水洗滌24 h，二次干燥成膜。

1.2.3 表皮膜片的體外構(gòu)建

將培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞按照0.5×106cells/cm2的密度接種于殼聚糖明膠膜片，培養(yǎng)在K-SFM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液每3天更換一次。

1.2.4 體外構(gòu)建表皮膜片的檢測

將體外培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞殼聚糖明膠膜片PBS沖洗2次后，2%戊二醛磷酸緩沖液固定，4℃保存。檢測前PBS沖洗，1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5 裸鼠皮膚缺損的修復(fù)

選用4～6周齡裸鼠12只，速眠新麻醉，在背部正中作直徑1 cm的全層皮膚缺損，置一皮膚隔離器于缺損邊緣，防止裸鼠皮膚自身修復(fù)，創(chuàng)面覆蓋同樣大小的毛囊干細(xì)胞-殼聚糖明膠膜片，細(xì)胞面向下，打包固定。對照組則僅用殼聚糖明膠膜片直接覆蓋。

1.2.6 回植表皮替代物的檢測

手術(shù)后定期拍照，觀察傷口愈合情況。回植后1周、4周和12周分別取材，石蠟包埋，制作組織切片，常規(guī)HE染色，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度水化，置于濕盒內(nèi)；0.25%Triton X-100，5%DMSO-PBS室溫10 min；滴加0.75%/1.5%-PBS H2O2，37℃15 min；滴加10%羊血清，37℃30 min，吸去羊血清，加入一抗，鼠抗人廣譜角蛋白，兔抗人Lamine抗體，工作濃度均為1∶100，置濕盒內(nèi)4℃過夜；人成纖維細(xì)胞為陰性對照，空白對照僅滴加PBS液。第2天滴加二抗生物素化羊抗鼠和抗兔IgG；DAB(1∶50)顯色；蘇木素襯染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水封片。

2 結(jié)果

2.1 毛囊干細(xì)胞—?dú)ぞ厶敲髂z膜片的構(gòu)建

接種到CGM上的毛囊干細(xì)胞與CGM生物相容性好，細(xì)胞生長良好，保持上皮細(xì)胞特征，呈典型的“鋪路石”狀。掃描電鏡示毛囊干細(xì)胞在CGM材料上粘附好，細(xì)胞仍保持典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞表面可見大量微絨毛（圖1）。

2.2 修復(fù)裸鼠皮膚缺損

術(shù)后1周，將外敷料打開，揭去未降解的殼聚糖明膠膜片，在實(shí)驗(yàn)組可見創(chuàng)面干燥，有新生上皮覆蓋創(chuàng)面，而對照組殘留較大未愈創(chuàng)面。4周時(shí)，皮膚隔離器開始脫落，實(shí)驗(yàn)組未見明顯收縮，對照組則收縮明顯。12周后，可見實(shí)驗(yàn)組和對照組均有不同程度的收縮（圖2）。

2.3 組織學(xué)

1周時(shí)，創(chuàng)面有新生上皮覆蓋，表皮分化良好，新生表皮分為基底層、顆粒層和角化層3層結(jié)構(gòu)，真皮內(nèi)未見腺體樣結(jié)構(gòu)；對照組則無新生上皮形成，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。4周時(shí)，皮膚隔離器基本已脫落，創(chuàng)面與周邊皮膚有明顯的分界，實(shí)驗(yàn)組未見明顯的創(chuàng)面收縮；對照組則見明顯的收縮。HE染色示實(shí)驗(yàn)組和對照組均形成復(fù)層表皮結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)組表皮層厚、層次多。12周時(shí)，創(chuàng)面進(jìn)一步收縮，尤以對照組劇烈。HE染色與4周時(shí)相似（圖3）。

2.4 層粘連蛋白（Lamine）和廣譜角蛋白（CK）檢測

回植后1周、4周和12周分別取材做檢測，實(shí)驗(yàn)組可見表皮基底層陽性表達(dá)Lamine，表皮層和角質(zhì)層表達(dá)廣譜角蛋白（圖3）。

圖1 毛囊干細(xì)胞在殼聚糖明膠膜片上生長良好

圖2 術(shù)后不同時(shí)間觀察

圖3 修復(fù)后不同時(shí)間HE染色和免疫組織化學(xué)染色（200×）

3 討論

組織工程表皮的研究經(jīng)歷了表皮細(xì)胞懸液、表皮細(xì)胞膜片和表皮細(xì)胞－生物材料復(fù)合物3個(gè)階段。隨著表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善與發(fā)展,組織工程表皮在成功救治大面積燒傷患者方面發(fā)揮了積極的作用，起到了早期覆蓋并封閉創(chuàng)面的目的。但實(shí)驗(yàn)技術(shù)精細(xì)，培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)的表皮細(xì)胞膜片易碎，不易操作，難以有效固定；移植到創(chuàng)面后成活率低；愈合后上皮組織彈性差，耐磨性差,易破潰和收縮；創(chuàng)面接受率低,只有50%～60%可永久存活，形成真皮不完整等。因此，開發(fā)適于表皮構(gòu)建的細(xì)胞載體系統(tǒng)需要深入研究。

殼聚糖是從蝦、蟹等海洋生物中提取的幾丁質(zhì)，經(jīng)脫乙?；蟮玫降囊环N天然多糖。結(jié)構(gòu)及某些性質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分氨基多糖極為相似，它具有高分子量和分子量分布單一，良好的生物相容性，生物可降解性等許多優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用非常廣泛[3]。明膠是膠原的部分變性產(chǎn)物，有助于角質(zhì)形成細(xì)胞在材料表面的增殖和遷移。殼聚糖-明膠材料可作為組織工程皮膚構(gòu)建的支架材料[3-4]。

對于移植到創(chuàng)面上的皮膚替代物而言，能否被創(chuàng)面接受取決于創(chuàng)面本身的條件、皮膚替代物的情況（包括細(xì)胞的活力、所用的支架材料）、移植技術(shù)及移植后護(hù)理等諸多因素，其中細(xì)胞的活力尤為重要。因此，足量的干細(xì)胞對于組織工程皮膚替代物十分重要，它可以保證細(xì)胞的更新和移植物在創(chuàng)面上的長期存活。通過研究證實(shí)，毛囊干細(xì)胞具有自我更新、強(qiáng)大增殖和分化潛能，比表皮干細(xì)胞更具有增殖潛能[5-6]，如以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞來構(gòu)建皮膚，對于促進(jìn)皮膚結(jié)構(gòu)和功能的生理性修復(fù)有重大意義，更具發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖和膠原部分變性的衍生物明膠構(gòu)筑用于支持毛囊干細(xì)胞的固體載體系統(tǒng)，制備的殼聚糖-明膠材料與細(xì)胞外基質(zhì)糖胺多糖（GAG）的結(jié)構(gòu)類似，生物相容性好，可以支持毛囊干細(xì)胞的生長。培養(yǎng)在殼聚糖-明膠材料上的毛囊干細(xì)胞在移植后可以遷移到創(chuàng)面，并在創(chuàng)面繼續(xù)生長、增殖和分化，最終形成結(jié)構(gòu)完善的表皮結(jié)構(gòu)?；刂埠蟮慕Y(jié)果顯示，移植物的創(chuàng)面接受率為100%，在移植后1周，實(shí)驗(yàn)組已分化形成復(fù)層表皮，而空白對照組只有炎性細(xì)胞浸潤，無明顯表皮形成。免疫組化顯示，移植后1周實(shí)驗(yàn)組基底層Lamine和CK均呈陽性表達(dá)，說明已形成分化良好的表皮，移植后4周和12周的結(jié)果相似。創(chuàng)面回縮結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面回縮低于對照組，可能是實(shí)驗(yàn)組移植物中有較多的干細(xì)胞，可延長移植物在創(chuàng)面的存活時(shí)間，減少創(chuàng)面的回縮。

本實(shí)驗(yàn)采用人毛囊干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化表皮修復(fù)裸鼠的全層皮膚缺損，效果較好，但未發(fā)現(xiàn)皮膚附屬器的形成。因?yàn)槠つw附屬器的形成需要間充質(zhì)和上皮間復(fù)雜的相互作用，雖然毛囊隆突部干細(xì)胞可以分化成表皮上皮所有的細(xì)胞系,但很可能在某一特定條件下只能分化成一種細(xì)胞系，局部特殊的位置或是細(xì)胞的微環(huán)境決定了細(xì)胞分化的選擇，在合適的間質(zhì)刺激因子的誘導(dǎo)下，毛囊間表皮干細(xì)胞才能夠分化成毛發(fā)和皮脂腺的細(xì)胞系[7]。

應(yīng)用毛囊干細(xì)胞作為組織工程化皮膚的種子細(xì)胞，如能建立完善的培養(yǎng)擴(kuò)增體系，可以減少取材量。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明，利用殼聚糖-明膠薄膜構(gòu)建的毛囊干細(xì)胞載體，作為一種組織工程表皮替代物可以有效修復(fù)裸鼠皮膚缺損。

國內(nèi)外研究均表明，單純移植表皮由于缺乏真皮結(jié)構(gòu)的支持，存在移植存活率低、韌性差、瘢痕收縮嚴(yán)重等問題，不能獲得接近生理的皮膚愈合質(zhì)量。采用組織工程技術(shù)復(fù)合構(gòu)建包含表皮與真皮的人工皮膚應(yīng)用于皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)，是解決這一問題的較好途徑。由于表皮層、真皮層之間的相互作用參與了創(chuàng)面修復(fù)，同時(shí)真皮的存在為血管新生和表皮覆蓋提供了模板，因此移植的表皮和真皮保證了皮膚結(jié)構(gòu)和功能的完整性，有助于加快皮膚再生及限制瘢痕組織形成。

隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、生物支架材料學(xué)和免疫學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，應(yīng)用毛囊干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚將顯現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。

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An Experimental study of human hair follicle stem cells-chitosan-gelatin membrane for repairing the skin defect of nude mouse

ZHANG Qun,YANG Guanghui,CONG Xiaoqian,CUI Lei,ZHANG Wenjie,LIU Wei,CAO Yilin.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Yilin

ObjectiveTo develop a new tissue engineering(TE)-epidermal substitute by using the hair follicle stem cells-chitosan-gelatin membrane（CGM）to repair skin defects of the nude mouse.MethodsA full-thickness skin defect was made on the dorsum of nude mouse.The hair follicle stem cells were inoculated and on the CGM,the hair follicle stem cells-CGM was constructed to repair the skin defects of nude mouse.A full-thickness skin defect was only covered with chitosan-gelatin membrane in the control group.The nude mice were sacrificed 1,4,12 weeks respectively after the operation. The grafts were examined by HE and immunohistology staining.ResultsThe hair follicle stem cells grow well on the surface of CGM.1 week after operation,a new epidermal covered the surface of the skin defects.HE showed the welldifferentiated keratinocytes of new epidermal;The unhealed wound was found 4,12 weeks after transplantation in the control group and the contraction of the skin was significantly greater than the experimental group.ConclusionThe hair follicle stem cells-chitosan-gelatin membrane is an ideal cell source for repairing the skin defect in nude mouse.

Human hair follicle stem cells;Chitosan-gelatin membrane;Skin defect

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）－02－0079－04

2008年8月12日；

2009年12月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.005

國家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（863）（2003AA205120，2003AA205122）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

曹誼林。