張開剛 曾炳芳 張長青

小腸粘膜下層復(fù)合成骨誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細胞體內(nèi)成骨的實驗研究

張開剛 曾炳芳 張長青

目的探討利用組織工程方法，以小腸粘膜下層為支架材料復(fù)合成骨誘導(dǎo)后的骨髓基質(zhì)干細胞構(gòu)建骨組織的可行性。方法將取自兔骨髓中的骨髓基質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，與經(jīng)處理的豬小腸粘膜下層在體外共培養(yǎng)。1周后，將共培養(yǎng)的豬小腸粘膜下層埋置于無胸腺裸鼠皮下。分別在不同時間進行掃描電鏡、透射電鏡、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察。結(jié)果體外培養(yǎng)時，見細胞與材料粘附良好，且分泌大量的細胞外基質(zhì)，細胞分化、增殖活躍。大體觀察植入體內(nèi)的細胞－材料復(fù)合物，見顏色變白，組織硬度增加，組織學(xué)和電鏡觀察見有大量骨組織形成。免疫組化示細胞為具有分泌特異性骨鈣蛋白的成骨細胞。結(jié)論骨髓基質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)為成骨細胞后與小腸粘膜下層共培養(yǎng)，植入裸鼠體內(nèi)后可形成骨組織，小腸粘膜下層是一種良好的骨組織工程支架材料。

組織工程小腸粘膜下層骨支架材料骨髓基質(zhì)干細胞

骨缺損修復(fù)是骨科面臨的難題之一，骨移植是治療骨缺損的有效方法。骨移植材料因來源受限、免疫排斥和疾病傳播等原因，限制了其臨床應(yīng)用。應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織，用以修復(fù)骨缺損，為臨床骨缺損治療提供了新的途徑[1-2]。

小腸粘膜下層（Small intestinal submucosa，SIS）與骨髓基質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)有良好的組織相容性[1]，可用作骨組織工程支架。本實驗將兩者共培養(yǎng)后植入體內(nèi)，探討其成骨可行性。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

相差顯微鏡（Olympus，日本），掃描電鏡(FEIQuanta 200，Philips，荷蘭)，透射電鏡（JEM-200CX，日本）；新生牛血清(杭州四季青生物制品公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；地塞米松(Sigma公司)；維生素C(Sigma公司)；β－甘油磷酸鈉(Sigma公司)；24孔培養(yǎng)板（上海普飛生物技術(shù)有限公司）；免疫組化試劑盒(DAKO，美國)；鼠抗兔骨鈣蛋白(OCN)(Chenicon，美國)；裸鼠（上海市腫瘤研究所）。

1.2 SIS制備

1.2.1 物理方法處理

小腸取自體重200 Kg以上的封閉飼養(yǎng)的豬，小腸在運輸過程中置于冰中，并且清潔過程在豬死亡后4 h內(nèi)完成，小腸的漿膜層和肌層用裹有紗布的刀柄去除，在去除粘膜和肌層過程中用40℃溫水持續(xù)沖洗。

1.2.2 化學(xué)方法處理

按Abraham等[2]的方法制備。把用物理方法處理后的小腸順小腸長軸縱行剖開，切成15 cm長后再經(jīng)過一系列的化學(xué)方法處理。每一步化學(xué)方法處理工程中，材料與溶液的體積比例保持在1∶100，并且所有的處理過程均在室溫下進行。步驟：①將機械方法制得的SIS浸泡在含有100 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH溶液中（pH=11～12）16 h；②用去離子水將基質(zhì)沖洗干凈，在含有1 mmol/L HCl和1 mmol/L NaCl溶液中（pH=0～1）浸泡6～8 h；③用去離子水沖洗基質(zhì)，然后在1 mmol/L NaCl的PBS中浸泡16 h；④用去離子水沖洗基質(zhì)，然后在PBS溶液中(pH=7～7.4)浸泡2 h；⑤再用去離子水沖洗基質(zhì)2 h（pH=5.8～7.0）；⑥殺菌，將SIS在含0.1%過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05%NaN3的PBS溶液清洗2 h，然后－70℃程序凍干后用γ射線照射（25～35 KGy）消毒。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)

取2月齡新西蘭大白兔，體重1.5～2.5 Kg，經(jīng)耳緣靜脈注射戊巴必妥鈉全麻，用量為30 mg/Kg。脛骨上段及膝關(guān)節(jié)周圍備皮，碘伏消毒皮膚，鋪無菌手術(shù)巾，保持無菌狀態(tài)，用小兒骨髓穿刺針接10 mL注射器，注射器內(nèi)含稀釋的肝素鈉2 500 U/mL，加入2 mL PBS混勻，自脛骨上段前內(nèi)側(cè)穿刺抽取骨髓4 mL，緩慢注入預(yù)先加入4 mL淋巴細胞分層液的離心試管中，密度梯度離心，2 000 r/min 20 min，吸取單核細胞層，用D-Hanks液洗滌離心2次，每次1 000 r/min 10 min，按1×105cells/mL的密度接種于培養(yǎng)皿，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL（其中含有青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL， pH值7.2～7.4），在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 d，更換培養(yǎng)液將未貼壁細胞棄掉。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3～4 d更換一次培養(yǎng)液，相差顯微鏡下觀察見細胞大部分長滿貼壁后，用0.25%胰蛋白酶消化5 min后傳代培養(yǎng)。

1.4 BMSCs與SIS復(fù)合物體外復(fù)合培養(yǎng)

在完全培養(yǎng)基中加入成骨誘導(dǎo)劑（β-甘油酸鈉80μg/mL、地塞米松10nmol/mL、L-抗壞血酸80 μg/mL）培養(yǎng)的第3代BMSCs，以5.0×105個/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加1 cm×1 cm大小的SIS材料1片，再加入培養(yǎng)基1 mL，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下復(fù)合培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)液。分別于1周、2周后取出SIS用于觀察及檢測。另設(shè)6個空白對照，材料上不種植細胞。

1.5 復(fù)合材料移植

將10片細胞－材料復(fù)合物和6片無細胞的材料埋植入10只裸鼠（2周齡）背部皮下，觀察體內(nèi)生長情況。

1.6 相差顯微鏡觀察

逐日在相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)基有無混濁、細胞生長及與生物材料附著情況和SIS形態(tài)變化。1.7組織學(xué)觀察

不同時期將體外和體內(nèi)復(fù)合組織進行HE染色，觀察復(fù)合組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

1.8 掃描電鏡（SEM）觀察

將BMSCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第1周、第2周，將培養(yǎng)孔內(nèi)生物材料取出，2.5%戊二醛固定，系列丙酮脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金后觀察BMSCs在SIS上的附著、生長、分裂、增殖情況。

1.9 透射電鏡（TEM）觀察

將BMSCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)1周、2周、4周及植入裸鼠體內(nèi)4周、8周、12周后，2.5%戊二醛固定，系列丙酮脫水，浸透及環(huán)氧樹酯包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾－檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

1.10 免疫組織化學(xué)觀察

將體外及體內(nèi)復(fù)合物進行骨鈣蛋白（OCN）免疫雙染色觀察體外骨髓基質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為成骨細胞和復(fù)合材料植入裸鼠體內(nèi)后的成骨情況。

2 結(jié)果

2.1 相差顯微鏡觀察

細胞與材料體外共培養(yǎng)2～4 d時，細胞增殖不明顯。單純培養(yǎng)的細胞呈長梭形或不規(guī)則型（圖1）。細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后變?yōu)槎噙呅?，核仁大。在? d后材料周圍有較多細胞直接貼附于材料邊緣。在10 d時大量細胞聚集材料邊緣（圖2）。細胞形態(tài)多為梭形及多角形。開始時，SIS呈展開的紙片狀；細胞成骨誘導(dǎo)后，SIS的厚度和硬度比未誘導(dǎo)組的明顯增加，未形成卷曲。

2.2 體內(nèi)移植后的細胞－材料復(fù)合物大體觀察

實驗裸鼠植入復(fù)合物后，未出現(xiàn)局部感染和復(fù)合物排出。4周時，裸鼠背部種植細胞－材料復(fù)合物處觸及有韌性，隨著時間延長，復(fù)合物硬度增加，顏色逐漸變白。無細胞材料始終較軟，12周后基本觸不到材料。取材后檢查發(fā)現(xiàn)，細胞－材料復(fù)合物顏色變白，無細胞材料為淡黃色，但表面都有血管形成（圖3，4）。

2.3 組織學(xué)觀察

將不同時間所取標本以甲醛固定、石蠟包埋后HE染色，行組織學(xué)觀察。細胞、材料體外共培養(yǎng)2周時，材料表面有大量的細胞粘附，細胞成多層生長（圖5）。復(fù)合物植入體內(nèi)后，4周時可見大量新生軟骨細胞，陷窩較大，軟骨細胞不夠成熟，SIS完整；8周時可見軟骨化骨現(xiàn)象，有大量骨痂及膠原形成（圖6）。單純材料組內(nèi)無軟骨細胞，只有少量的炎性細胞和成纖維細胞，沒有骨組織形成。

2.4 掃描電鏡觀察

細胞、材料體外共培養(yǎng)，7 d時細胞數(shù)量明顯增多，基質(zhì)分泌旺盛，細胞間有大量膠原纖維絲形成細胞間連接。部分細胞跨越孔隙，呈長梭形。培養(yǎng)10 d以后細胞數(shù)量增多，且連成片（圖7）。2周時細胞數(shù)量更多，細胞層數(shù)也逐漸增加（圖8）。細胞分裂增殖呈三維生長，細胞分泌大量細胞外基質(zhì)，呈蜂窩狀，縫隙逐漸被細胞外基質(zhì)填塞而變得致密，細胞輪廓也變得模糊。

2.5 透射電鏡觀察

體外培養(yǎng)時BMSCs在SIS上呈多層生長，細胞連接緊密。胞體成梭形，膜表面有微絨毛狀突起，細胞核呈梭形或不規(guī)則形，偶見有分葉形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、擴張、增粗，細胞間基質(zhì)致密，可見鈣化灶形成（圖9）。復(fù)合物植入體內(nèi)4周時，見有大量的成軟骨細胞和成骨細胞，細胞核較大,細胞內(nèi)有大量的線粒體、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞分泌大量的細胞外基質(zhì)，并有血管形成，間質(zhì)中有部分鈣化帶形成。在血管周圍可見細胞膜表面帶大量絨毛的巨噬細胞（圖10，11）。8周時中央部分骨細胞數(shù)量明顯減少，胞漿中細胞器退化，細胞狹長，包埋于成熟的細胞外基質(zhì)中。

2.6 免疫組織化學(xué)染色

體外培養(yǎng)的BMSCs用免疫熒光雙染法檢測成骨誘導(dǎo)后OCN呈陽性反應(yīng)，表明細胞誘導(dǎo)分化為成骨細胞（圖12）。細胞-材料復(fù)合物植入體內(nèi)，免疫組織化學(xué)OCN檢測示細胞呈棕黃色，表明細胞在體內(nèi)形成骨細胞（圖13）。

圖1 BMSCs原代培養(yǎng)第7天(40×)

圖2 BMSC與SIS體外共培養(yǎng)第10天(100×)

圖3 植入4周后，無細胞材料軟，表面形成血管

圖4 植入4周后，細胞－材料復(fù)合物硬，表面形成血管

圖5 體外共培養(yǎng)2周，材料表面有大量細胞生長（HE，40×）

圖6 植入體內(nèi)4周時，有大量軟骨細胞形成（HE，100×）

圖7 SIS與BMSCs體外共培養(yǎng)7 d (SEM，2 000×)

圖8 SIS與BMSCs體外共培養(yǎng)2周(SEM，200×)

圖9 SIS與BMSCs體外共培養(yǎng)2周（TEM，4 000×）

圖10 復(fù)合物植入4周后，有血管形成，周圍有成骨細胞、巨噬細胞和成纖維細胞（TEM，2 500×）

圖11 復(fù)合物植入4周后，有大量成骨細胞和成纖維細胞，并有鈣鹽沉積（TEM，1 850×）

圖12 體外培養(yǎng)的BMSCs OCN呈陽性反應(yīng)

3 討論

3.1 SIS的生物學(xué)特性

小腸粘膜下層（SIS）是從豬空腸粘膜下層分離出的無細胞膠原層，是天然的細胞外基質(zhì)類材料，無免疫性，作為可吸收支架和基質(zhì)材料已廣泛應(yīng)用于多種組織的修復(fù)，如肌腱、半月板和骨缺損的修復(fù)［3－5］。SIS這種生物材料更接近于天然結(jié)締組織復(fù)雜的成分結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)與細胞具有親和力，可以有效地傳遞分子和細胞信息，具有良好的細胞相容性[6－7]，可促進多種細胞在材料上的粘附、生長、分化和遷移，并含有VEGF、FGF-2、TGF-β等多種生長因子，能促進與創(chuàng)面愈合有關(guān)的細胞增殖，當SIS植入宿主體內(nèi)后，能迅速誘導(dǎo)細胞浸潤，刺激血管生成和宿主細胞的長入和分化，產(chǎn)生的再生組織在結(jié)構(gòu)和功能上與原有組織相似，能為宿主細胞提供可吸收的支架材料，基本能滿足生物支架材料的要求，最終達到修復(fù)組織缺損的目的。SIS包含有超過90%的Ⅰ型和Ⅲ型膠原，以及纖維粘連蛋白（FN）。Ⅰ型膠原是骨有機質(zhì)組成的主要成分，在體內(nèi)為鈣鹽的沉積提供支架；同時，體外實驗中，Ⅰ型膠原促進BMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)分化[8]。膠原有利于細胞粘附和早期血管的長入，并且可吸附血液中的生長因子（如BMP等）。

3.2 SIS作為骨組織工程細胞支架材料的可行性

圖13 免疫組化示復(fù)合物植入體內(nèi)后形成大量的成骨細胞

種子細胞和支架材料是組織工程研究的核心內(nèi)容。種子細胞的功能有賴于細胞外基質(zhì)的存在。細胞與材料的粘附是體外構(gòu)建組織工程骨的前體和條件[9]。尋找具有良好的生物相容性、生物可降解性、來源廣泛、操作處理簡單、易于消毒的生物支架材料成為目前的研究熱點。BMSCs具有來源廣泛、對機體損傷小、分離方便、增殖快、能多向分化的優(yōu)點[10]，體外培養(yǎng)最易向成骨細胞轉(zhuǎn)化，已經(jīng)成為骨組織工程研究中的最佳種子細胞。體外培養(yǎng)中，在培養(yǎng)液中加入β-磷酸甘油、地塞米松、抗壞血酸后，BMSCs就能向成骨細胞轉(zhuǎn)變，表達多種由成骨細胞分泌的骨基質(zhì)蛋白，如Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白、骨橋蛋白等，同時細胞外基質(zhì)出現(xiàn)鈣化現(xiàn)象。我們將BMSCs與SIS在體外共培養(yǎng)后，細胞不僅具有生物活性，且能夠大量繁殖，說明BMSCs與SIS具有良好的相容性，為體內(nèi)植入的成功奠定了基礎(chǔ)。

組織工程骨發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵因素是血管化，只有血管化才能使細胞進行正常的新陳代謝，獲得營養(yǎng)，維持生命力。血管再生的最早步驟是血管內(nèi)皮細胞與底物材料的粘附，材料的物理特性和組成成分必須適合內(nèi)皮細胞粘附，血管生成需要有能使血管內(nèi)皮細胞粘附、遷移、侵入并且分化成成熟內(nèi)皮細胞的底物材料。SIS能為血管內(nèi)皮細胞提供良好的附著、增殖的環(huán)境。Badylak等[11]的實驗證明，血管內(nèi)皮細胞在水合SIS表面有良好的粘附。Hodde等[12]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞能通過SIS中幾種附著蛋白，如Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、纖維結(jié)合素而直接附著在SIS上，血管內(nèi)皮細胞能在SIS的兩個面上生長，如果將血管內(nèi)皮細胞種植在SIS的管腔面，到后期血管內(nèi)皮細胞可以穿透SIS。本實驗中，細胞－材料復(fù)合物植入裸鼠皮下后，在材料內(nèi)形成大量的骨基質(zhì)，并可見血管長入，表明植入物的血管化促進了新骨形成，也為骨細胞的新陳代謝提供了場所。在體內(nèi)構(gòu)建的組織工程骨中能夠在早期形成血管可能與SIS中含有的VEGF有關(guān)。

3.3 SIS復(fù)合BMSCs成骨鑒定指標的選擇

BMSCs在體外培養(yǎng)中最易向成骨細胞轉(zhuǎn)化，在培養(yǎng)液中加入成骨誘導(dǎo)液（β-甘油酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸）后，BMSCs就開始向成骨表型轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為堿性磷酸酶陽性，表達各種由成骨細胞分泌的骨基質(zhì)蛋白（Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白、骨橋蛋白等），同時細胞外基質(zhì)出現(xiàn)鈣化。BMSCs體外誘導(dǎo)分化為成骨細胞的過程，為闡明骨形成發(fā)育機制提供了參考[13]。OCN為成骨細胞所特有，本實驗通過免疫組織化學(xué)證實胞漿內(nèi)有OCN的表達，說明BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后在體外可轉(zhuǎn)化為成骨細胞，植入體內(nèi)后可以繼續(xù)分泌細胞外基質(zhì)并具有成骨能力。組織學(xué)和透射電鏡結(jié)果顯示成骨細胞分泌大量的細胞外骨基質(zhì)，并且出現(xiàn)鈣化帶，形成類似正常的骨組織結(jié)構(gòu)。

3.4 SIS復(fù)合BMSCs體內(nèi)成骨的意義

本研究利用SIS制作的三維支架材料，可供細胞遷移、分化，與BMSCs在體外共培養(yǎng)時，細胞在支架的表面附著良好。植入體內(nèi)后BMSCs能在SIS支架上誘導(dǎo)成骨，這就為進一步深入研究構(gòu)建組織工程骨，用于臨床移植，修復(fù)骨缺損奠定實驗基礎(chǔ)，為最終代替自體移植修復(fù)骨缺損提供依據(jù)。

[1]張開剛,曾炳芳,張長青.小腸粘膜下層的制備及細胞相容性的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2005,7:344－348.

[2]Abraham GA,Murray J,Billiar K,et al.Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomaterial[J].Biomed Mater Res, 2000,51:442-452.

[3]Derwin K,Androjna C,Spencer E,et al.Porcine small intestine submucosa as a flexor tendon graft[J].Clin Orthop,2004,423:245-252.

[4]Muller-Rath R,Mumme T,Miltner O.Meniscus replacement: current aspects in the field of tissue engineering[J].Z Orthop Ihre Grenzgeb,2004,142(5):540-545.

[5]Lee SJ,Lee IW,Lee YM,et al.Macroporous biodegradable natural/synthetic hybrid scaffolds as small intestine submucosa impregnated poly(D,L-lactide-co-glycolide)for tissue-engineered bone[J].J Biomater Sci Polym Ed,2004,15(8):1003-1017.

[6]Grimes M,Pembroke JT,McGloughlin T.The effect of choice of sterilization method on the biocompatibility and biodegradability of SIS(small intestinal submucosa)[J].Biomed Mater Eng,2005, 15(1-2):65-71.

[7]Luo J,Yang Z,Li X,et al.Cellular compatibility of small intestinal submucosa in vitro[J].Shengwu Yixue Gongchengxue Zazhi,2004, 21(5):800-804.

[8]Hsu FY,Chueh S.Microspheres of hydroxyapatite rreconstituted collagen as supports of osteoblast cell growth[J].Biomaterials, 1999,20(20):1931-1936.

[9]Gumbiner BM.Cell adhesion:the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis[J].Cell,1996,84:345-357.

[10]曹誼林,崔磊,劉偉.組織工程在創(chuàng)傷骨科領(lǐng)域的研究進展[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,6(7):724-727.

[11]Badylak S,Liang A,Record R,et al.Endothelial cell adherence to small intestinal submucosa:an acellular bioscaffold[J]. Biomaterials,1999,20(23-24):2257-2263.

[12]Hodde JP,Record RD,Tullius RS,et al.Retention of endothelial cell adherence to porcine-derived extracellular matrix after disinfection and sterilization[J].Tissue Eng,2002,8(2):225-234.

[13]Ducy P,Schinke T,Karsenty G.The ostenblast:a sophisticated fibroblast under central surveillance[J].Science,2000,289(5484): 1501-1504.

An Experimental Study of Bone Mesenchymal Stem Cells Seeds into Small Intestinal Submucosa Induced Toward Bone In Vitro

ZHANG Kaigang1,ZENG Bingfang2,ZHANG Changqing2.
1 Department of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shandong,271000,China;2 Department of Orthopedic Surgery,Shanghai Sixth People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.

ObjectiveTo investigate the feasibility of bone mesenchymal stem cells(BMSCs)seeded into small intestinal submucosa(SIS)to form the tissue engineered bone through inducing culture.MethodsThe BMSCs were isolated by percoll gradient centrifugation from rabbit’s bone marrow.The BMSCs were induced to become osteogenic cells in the defined medium,and were seeded on SIS as the scaffold material for the formation of cell-SIS composite.The scaffold-cell constructs were cultured in vitro for 1 week and were implanted subcutaneously in the dorsa of nude mice.The implants were examined by scanning electron microscopy(SEM),transmission electron microscopy(TEM),histology and immunohistochemistry. ResultsBMSCs adhered and proliferated on SIS,secreted a great deal of extracellular matrices with active cellular function. Gross observation showed subcutaneous lump with considerable tenacity.Large amount of osteocyte were seen and the expression of osteocalcin(OCN)were detected by immunohistological staining technique.ConclusionIt is demonstrated that BMSCs seed SIS can be induced toward bone by induction media.The SIS is an ideal scaffold for the bone tissue engineering.

Tissue engineering;Small intestinal submucosa;Bone;Scaffold;Bone mesenchymal stem cells

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）－02－0070－05

2009年2月2日；

2009年3月28日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.003

271000山東省泰安市泰安市中心醫(yī)院骨科（張開剛）；200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院骨科（曾炳芳，張長青）。