陳 亮 奚廷斐 王春仁

組織工程醫(yī)療產品免疫學評價研究

陳 亮 奚廷斐 王春仁

組織工程是一門將生命科學和工程學的原理與技術相結合，發(fā)展具有生物活性功能的替代物或移植物，用于修復、改善、再生組織和器官的結構和功能的交叉學科。組織工程醫(yī)療產品（Tissue Engineered Medical Products,TEMPs）是用組織工程技術和工藝制備的，含有經生產工藝處理的人體細胞和組織，用于再生、修復或替代人體組織的醫(yī)用產品。

組織工程醫(yī)療產品可包括細胞、生物材料（基質或支架）、生物分子等，是復雜的聯(lián)合產品，其產品的風險分析和安全性評價也具有復雜性。在組織工程中得到廣泛應用的生物材料，包括聚乳酸、聚羥基烷基酸酯等聚酯類可降解高分子材料，還有膠原及細胞外基質等生物組織衍生材料，以及殼聚糖、海藻酸鈉等天然生物材料。這幾類生物材料單獨植入后的異物炎癥反應是目前局部反應評價試驗的主要內容，但近來已有研究表明這幾類植入生物材料可影響免疫系統(tǒng)。另外，TEMPs除含有生物材料外，不同來源的細胞也是重要的組成成分。為達成商品化，同種異體來源的細胞（體細胞或干細胞）是現(xiàn)實的選擇。因此，從理論上分析，組織細胞中含有的過客抗原呈遞細胞、異體細胞分泌物、死細胞或碎片都將引起免疫應答反應，從而影響TEMPs的活性和功能。由于TEMPs中生物材料和同種異體細胞的同時存在，也將植入后宿主反應演化為異物炎癥反應和免疫反應，而兩者間還存在相互作用。因此，對植入后宿主反應的評價，特別是免疫學評價就成了組織工程醫(yī)療產品風險分析和安全性評價新的課題。

免疫學評價是檢測對免疫系統(tǒng)結構和功能的不良影響，或由對其他系統(tǒng)的影響而導致的免疫功能障礙。當抵抗感染或腫瘤等疾病的體液免疫或細胞免疫受到損害（即免疫抑制），或出現(xiàn)不必要的組織損傷（如自身免疫、超敏反應或慢性炎癥）時，即認為發(fā)生了免疫毒性作用。對免疫功能的影響還表現(xiàn)為免疫刺激，即非目的性的或不恰當的免疫系統(tǒng)的激活（抗原特異性或非特異性），包括生物材料非目的性的免疫原性（如異體蛋白的抗原或細胞免疫反應）和佐劑效應（即材料加強了與其共同存在的抗原的免疫反應）。目前對TEMPs中的生物材料（膠原、細胞外基質、聚合物、海藻酸鈉）成分和間充質干細胞成分的免疫學評價方面的研究結果如下文所述。

1 膠原

膠原（主要是Ⅰ型膠原）是大量存在于多種生物體組織的結構和功能蛋白，雖然已被廣泛認為是一種安全有效的生物材料，但動物來源的膠原總是會引起對其可能會引發(fā)免疫反應的關注[1]。膠原的抗原決定簇可分為三類：膠原分子三螺旋結構構象本身、膠原螺旋結構中的氨基酸序列和膠原非螺旋末端肽段。雖然膠原非螺旋末端的氨基酸在種間的變異可達到50%以上，在一些供者/受者組合的動物試驗（牛/兔、大鼠/兔）中發(fā)現(xiàn)主要的抗原決定簇位于這些區(qū)域，但是在其他不同的供者/受者組合的動物試驗中發(fā)現(xiàn)主要抗原決定簇在于三螺旋結構構象本身（牛/大鼠、牛/小鼠）或是螺旋結構中的氨基酸序列（大鼠/雞），由此說明膠原分子主要抗原決定簇的定位取決于供者和受者的種間組合[1]。研究表明，膠原在人體使用后，牛膠原（ZyDerm，酶解制備）的抗原決定簇位于三螺旋結構和氨基酸序列[2]。因此，動物來源的膠原，即使是通過酶解去除了高度變化的末端肽段的膠原，也應詳細研究在人體引起的免疫反應。

膠原引起的免疫反應包括體液免疫和細胞免疫，但兩者相對作用還未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，膠原引起免疫反應同樣取決于供者和受者的種間組合。臨床通過檢測循環(huán)抗體的水平來評估膠原免疫反應風險[3]。目前研究最充分的膠原產品可能是注射型膠原充填劑，相關資料表明人群中對牛膠原的超敏反應發(fā)生率為2%～4%，使用膠原產品后會增加1%左右，不良反應發(fā)生率較低[4-5]。但是，新的膠原材料，以及新的應用方式不斷增加，例如作為皮膚替代物、骨填充物、心血管支架材料、止血材料等。已有報道在這些應用中出現(xiàn)了稍微增高的變態(tài)反應發(fā)生率[6]和肉芽腫異物反應[7]。用牛Ⅰ型膠原密封的多孔聚酯血管在豬體內植入后，觀察期內膠原抗體陽性率為41%～68%，引起了對膠原引發(fā)體液免疫反應和植入局部炎癥反應間關聯(lián)性的關注[8]。因此，以膠原為支架材料與同種異體細胞復合，對此應用中的膠原進行免疫學及其引發(fā)免疫反應在整個膠原-細胞復合物引起宿主反應中的作用的評價是亟待解決的問題。

2 細胞外基質

細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）也是在組織工程中廣泛應用的生物支架材料，如經處理的豬小腸粘膜下層(Small Intestinal Submucosa，SIS)、膀胱粘膜下層、人羊膜等。ECM除主要由膠原構成外，還含有其他抗原性蛋白，而且取決于脫細胞處理方法，殘留的細胞成分也決定著免疫反應的發(fā)生。因為，完全除去細胞膜及細胞核物質是困難的，或是不可能的[9]。以非交聯(lián)SIS（無細胞的）進行的動物試驗中出現(xiàn)了Th2型免疫反應，再次植入增強了Th2型反應，但未出現(xiàn)致敏[10]。研究表明，豬SIS含有少量半乳糖（α-gal）抗原決定簇，雖然半乳糖決定簇的含量和分布，或產生的抗體未導致補體活化[11]，SIS在人體應用后也未檢測到抗半乳糖抗體增加[9]，但也反應了這類細胞外基質材料具有免疫原性的現(xiàn)實。非交聯(lián)SIS降解代謝迅速（單層約90%在28 d降解，多層在90～120 d完全降解），也許是SIS未引起排斥性反應的原因。而低劑量半乳糖決定簇的持續(xù)存在是異種移植慢性排斥的原因[12]，降解緩慢或經交聯(lián)處理的細胞外基質材料可能會存在這樣的問題，已有報道顯示光氧化交聯(lián)的心包組織引起的抗體反應長達2年[13]。組織工程構建的組織器官的多樣化，決定了用于不同目的的細胞外基質具有不同性質，包括降解性能和是否需要交聯(lián)加強力學強度等，也決定了免疫學評價的必要性。而且，上述SIS試驗結果是發(fā)生在SIS無細胞前提下，組織工程中的細胞外基質復合細胞的免疫學評價研究尚未深入開展。

3 聚合物

在組織工程中應用較多的可降解聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚羥基烷基酸酯等。一般評價其植入后的生物相容性是基于發(fā)生的異物炎癥反應的程度，即組織反應的纖維化和血管化的程度，目前認為這些材料植入后局部反應是可接受的。但新的研究表明，這類聚合物材料對機體免疫系統(tǒng)也有影響。很直接的證據來自疫苗方面的研究，利用聚乳酸或聚乳酸-聚乙醇酸（PLGA）制成可降解微球，包被抗原性蛋白，可以作為單次性疫苗而產生免疫作用[14]，聚合物是作為免疫佐劑發(fā)揮作用，抗原的聚合物微球形式促進了抗原呈遞細胞對其的吞噬，增強了巨噬細胞和樹突狀細胞的活化[15]。但是，在組織工程領域，TEMPs應避免刺激免疫系統(tǒng)以避免排斥和免疫炎癥反應，聚合物材料的免疫佐劑效應可能是不需要的副作用。已有研究表明這樣的免疫佐劑效應在聚乳酸作為生物支架材料時也可能發(fā)生，模式抗原蛋白與聚乳酸多孔支架共同植入后，引起的抗體反應雖與完全弗氏免疫佐劑有差異，但也顯著高于單純的抗原蛋白注射，且與聚乳酸微球效應相似[16]。進一步研究顯示，PLGA可以促進單核細胞來源的樹突狀細胞成熟[17]，該作用與PLGA形狀有關，免疫佐劑作用的進一步機理還有待研究。甲基丙烯酸-2-羥基乙酯的免疫佐劑效應也有報道[18]，在動物試驗中引起了對內源性蛋白的自身抗體。另外，聚合物的抗原性也被證實，動物試驗中檢測出了抗聚酯Dacron的抗體[19]。因此，在聚合物作為TEMPs的支架材料時，對其免疫學評價應成為TEMPs安全性和有效性的研究內容。

4 天然生物材料

殼聚糖是自甲殼綱動物的甲殼中提取的聚糖，或是在一些酵母菌和霉菌中合成，通過發(fā)酵得到。殼聚糖作為生物材料得到了廣泛應用，它具有良好的生物活性，并可制成膜、海綿狀、微粒、凝膠等。研究也顯示殼聚糖具有免疫刺激活性[20]，能活化非特性免疫系統(tǒng)的成分，如巨噬細胞等。在疫苗中也用作佐劑去增強免疫[21]。研究已發(fā)現(xiàn)針對幾丁質產生的抗體，雖然報道在植入后未檢測到針對殼聚糖的抗體[22]，但殼聚糖是否存在抗原性還需進一步證明。

海藻酸鈉是1，4-糖苷鍵連接的β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸構成的共聚物，也是應用廣泛的天然生物材料，多從褐藻中提取，也可通過細菌發(fā)酵生產。研究報道海藻酸鹽微囊在疫苗配方中可發(fā)揮佐劑作用。由甘露糖醛酸含量高的海藻酸鈉植入小鼠后檢測到了海藻酸鈉抗體的產生[23]。而由海藻酸鈉衍生的低聚糖—寡聚甘露糖醛酸酯（Oligomannuronate）對活化的免疫細胞反應性氧化物的產生有抑制作用[24]。這些結果表明了對免疫系統(tǒng)可能存在的影響。

海藻酸鈉微囊作為異種或異體細胞的免疫隔離包囊是組織工程中一類重要方法。在這樣的應用中，微囊發(fā)揮的細胞隔離效果、微囊的分子量截斷產生的阻滯效應、微囊植入產生的炎癥反應都是決定微囊化細胞是否發(fā)揮作用時值得評價的免疫學方面的影響因素。

5 細胞

組織工程中的細胞來源理論上包括異種、異體及自體細胞（體細胞或干細胞），本文的討論集中在同種異體間充質干細胞上。間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）主要存在于骨髓，但也可從臍帶血、脂肪或其他組織分離獲得。研究報道狒狒MSC不會引起同種異體淋巴細胞的增殖[25]，人MSC在混合淋巴細胞反應中可抑制T淋巴細胞的增殖[26]，抑制程度與MSC的數量具有量效關系[27]。另一方面，也有試驗報道發(fā)現(xiàn)了主要Ⅱ類組織相容性抗原復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)在人MSC的較強表達，在單向混合淋巴培養(yǎng)試驗中，經γ射線照射或多聚甲醛處理的MSC可以促進同種異體T淋巴細胞的增殖[28]；但在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗中，MSC作為第三方細胞卻可以抑制淋巴細胞的增殖，并表現(xiàn)出了否定樣（Veto-like）細胞的功能[28]，即對同種異體抗原引起的細胞毒性作用有抑制效果，而對記憶抗原(Recall antigen)引起的免疫反應無影響，這種區(qū)別反應能力對MSC的臨床應用是有幫助的。不過，有報道在同種異體的小鼠腫瘤移植試驗中發(fā)現(xiàn)MSC具有的免疫抑制作用有利于腫瘤生長[29]。

此外，研究報道MSC可抑制單核細胞來源的樹突狀細胞的分化和功能[30]；在一定條件下抑制自然殺傷細胞的增殖、細胞因子分泌，以及對HLA-Ⅰ類抗原的細胞毒性作用等，但活化的自然殺傷細胞能破壞MSC[31]。

6 組織工程醫(yī)療產品

生物材料支架和細胞構成的組織工程醫(yī)療產品在植入后的宿主反應包括對生物材料的（異物）炎癥反應和對細胞的免疫反應[32]，而且對于以上所提及的膠原、細胞外基質、聚乳酸、殼聚糖、海藻酸鈉等，還要包括生物材料本身即具有抗原性或免疫原性，或對免疫系統(tǒng)的影響作用。對生物材料的炎癥反應和對細胞的免疫反應將是相互影響的過程。生物材料引起炎癥反應將具有佐劑效果，巨噬細胞等抗原呈遞細胞將局部出現(xiàn)，因與生物材料接觸或吞噬生物材料降解產物而活化。炎癥反應結果是巨噬細胞、白細胞活化，釋放細胞因子、生長因子、蛋白溶酶、活性氧類和活性氮類等，而調節(jié)炎癥反應的免疫細胞因子將是炎癥反應和免疫反應相互影響的環(huán)節(jié)之一。巨噬細胞等被激活后可分泌細胞因子如IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α、IFNγ等，可促進T細胞增殖，增強細胞毒性，從而可影響植入的MSC的存活和功能。并且這些細胞因子也可直接作用于MSC，如IFNγ可以誘導MSC表達MHCⅡ類抗原[33]。

每一種組織工程醫(yī)療產品都具有獨特性,其特有的生物材料支架和細胞的組合，其引起的炎癥反應和免疫反應，以及兩者的相互作用也將是不同和各具特點的，對其的評價將成為對其安全性和有效性評價中不可缺少的一環(huán)。

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R392.9

B

1673－0364（2009）－01－0056－02

2008年6月20日；

2008年8月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.017

國家自然科學基金（30670573）。

100050北京市中國藥品生物制品檢定所。