王德超 李 奎 崔冰寧 宇程峰

去抗原異種松質(zhì)骨材料的生物相容性研究

王德超 李 奎 崔冰寧 宇程峰

目的研究去抗原異種松質(zhì)骨支架材料的生物相容性，為其在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法對去抗原異種松質(zhì)骨支架材料進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)、熱源實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、凝血實(shí)驗(yàn)、兔肌肉內(nèi)種植實(shí)驗(yàn)和兔橈骨骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果去抗原異種松質(zhì)骨支架材料無毒性、無熱源性、不引起溶血和凝血反應(yīng)，植入兔肌肉后逐漸發(fā)生生物降解并被纖維組織取代，兔骨缺損區(qū)植入后可被骨組織取代。結(jié)論去抗原異種松質(zhì)骨支架材料具有良好的生物相容性，是理想的骨支架材料。

骨修復(fù)材料去抗原異種松質(zhì)骨生物相容性組織工程

目前，治療骨缺損的較理想方法是自體骨移植，但自體骨的來源困難，尤其是長骨缺損，是臨床上亟待解決的難題之一。組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，尤其是在細(xì)胞生物學(xué)原理基礎(chǔ)上，充分利用現(xiàn)代生物材料,以修復(fù)和替代損傷的組織器官。研制理想的生物材料替代自體骨移植用于修復(fù)骨組織缺損，是醫(yī)學(xué)和生物材料科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。臨床上已應(yīng)用的骨移植物較多，如無機(jī)骨、羥基磷灰石、脫鈣骨、脫蛋白骨以及各種各樣的人工復(fù)合材料等，為臨床骨缺損的治療提供了很多選擇。但是這些方法各有不足，難以滿足臨床上修復(fù)各種骨缺損的需要。異種骨來源廣泛，取材方便。去抗原異種松質(zhì)骨具有天然的多孔結(jié)構(gòu)，形狀規(guī)則，具有可塑性及一定的機(jī)械強(qiáng)度，容易加工成所需的形狀并有支撐作用。去抗原豬松質(zhì)骨支架材料作為骨組織工程支架的一種，具有良好的力學(xué)性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、降解性、骨傳導(dǎo)性、成骨誘導(dǎo)性等特點(diǎn)，日益受到重視，但其生物相容性尚未見報(bào)道。本研究對去抗原豬松質(zhì)骨的生物相容性進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

去抗原豬松質(zhì)骨材料制備：取新鮮豬股骨，去除軟組織和骨髓后，鋸成20 mm×10 mm×10 mm骨塊，依次經(jīng)過20%H2O2浸泡8 h；1:1甲醇/氯仿浸泡12 h；0.5%Triton X-100浸泡10 h；0.1%胰蛋白酶溶液（pH 7.8）中浸泡處理8 h；10%高滲鹽水浸泡8 h；蒸餾水沖洗浸泡l2 h；50℃以下烘干；包封后60Co照射(20 KGy)36 h備用。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

選健康小鼠10只，體重20～24 g，雌雄各半，隨機(jī)分成2組，每組5只。將塊狀的豬去細(xì)胞骨在37℃水浴箱中用生理鹽水持續(xù)浸泡24 h(材料重量與浸提介質(zhì)容量的比例為0.1 g/mL)，制備材料浸提液，過濾除菌。實(shí)驗(yàn)組無菌條件下向每只小鼠腹腔內(nèi)注入1 mL浸提液，對照組單純注入等量生理鹽水。觀察72 h，主要觀察記錄動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸、步態(tài)、活動(dòng)等不良反應(yīng)癥狀及有無死亡。然后取心、肺、肝、脾、腎標(biāo)本作常規(guī)組織學(xué)觀察。

1.2.2 熱源試驗(yàn)

用與急性毒性試驗(yàn)相同的方法制備和消毒去抗原豬松質(zhì)骨浸提液。選健康4月齡新西蘭白兔3只，體重2～2.5 Kg，飼養(yǎng)條件一致，氯胺酮+異丙嗪麻醉，測量肛溫兩次，間隔1 h，取平均值為正常體溫。試驗(yàn)材料研成細(xì)粉末，按1 g/10mL比例制成生理鹽水浸提液，過濾除菌。向每只兔耳緣靜脈注入5 mL浸提液，注射后每隔1 h測量兔體溫1次，共3次，以3次體溫中的最高值減去正常體溫，即為該兔的體溫升高值。

1.2.3 溶血試驗(yàn)

取新鮮兔血用生理鹽水釋成2%兔血懸液，將材料浸提液、生理鹽水（陰性對照）和雙蒸水（陽性對照）各2 mL、試驗(yàn)材料2 g分別加入2%兔血懸液2 mL，每組各3份。37℃水浴1 h，肉眼觀察有無溶血，隨即離心，取上清液1 mL，在722型分光光度計(jì)于545 nm處測定吸光度值，計(jì)算溶血率。

1.2.4 凝血試驗(yàn)

取材料50 mg、100 mg、200 mg分別加入正?；旌涎獫{中，用自動(dòng)血液凝固儀于1 h內(nèi)測定凝血酶原時(shí)間(PT)、部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶凝固時(shí)間(TT)和纖維蛋白原，觀察材料對凝血功能的影響。

1.2.5 肌肉、骨內(nèi)長期植入試驗(yàn)

取健康家兔15只，體重2.0～2.5 Kg，無菌條件下在距股骨髁關(guān)節(jié)面8～10 mm松質(zhì)骨處作經(jīng)髁橫形截骨，復(fù)位后在髁間凹中心鉆孔，插入一枚HA/PDLLA棒材固定，另取2 mm×2 mm×12 mm HA/PDLLA試件植入雙側(cè)骶棘肌內(nèi)，術(shù)后動(dòng)物自由活動(dòng)，不用外固定。進(jìn)行以下觀察：于8周、16周、24周各處死5只動(dòng)物，作X線攝片后取股骨遠(yuǎn)端、材料周圍肌肉組織作常規(guī)組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)

動(dòng)物一般情況良好，活動(dòng)、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無驚厥、癱瘓和死亡現(xiàn)象，心、肺、肝、脾、腎標(biāo)本組織學(xué)觀察未見組織和細(xì)胞的變性及壞死。按WHO化學(xué)物質(zhì)急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，說明材料按毒性分級屬于無毒級。

2.2 熱源試驗(yàn)

3只家兔體溫升高均低于0.6℃，升高總值0.86℃，低于1.4℃的標(biāo)準(zhǔn)。材料浸提液熱源檢查符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 溶血試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水陰性對照組均無溶血現(xiàn)象，雙蒸水陽性對照組全部溶血。實(shí)驗(yàn)組溶血率為1.9%，小于5%，說明該材料具有良好的血液相容性。

2.4 凝血試驗(yàn)

加入不同劑量顆粒樣品后，血漿中4項(xiàng)指標(biāo)均正常，說明材料對凝血功能無影響。

2.5 肌肉、骨內(nèi)長期植入試驗(yàn)

去抗原豬松質(zhì)骨在肌肉植入實(shí)驗(yàn)中，有溶解現(xiàn)象，包膜未增厚，未見多核巨細(xì)胞。骨內(nèi)長期植入實(shí)驗(yàn)X線攝片見6周時(shí)骨折愈合，無畸形。材料在12周前可清晰顯影。組織學(xué)觀察3周時(shí)骨折端有明顯骨痂生成，材料在髁部與骨組織直接接觸，在髓腔中材料周圍有明顯新骨生成，無中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集，偶見巨噬細(xì)胞。6周時(shí)骨折均愈合，炎性細(xì)胞減少。

3 討論

骨缺損的修復(fù)是骨科的難題之一，國內(nèi)外學(xué)者都在研究骨的替代材料以解決這個(gè)難題。骨組織工程概念出現(xiàn)后，引起廣大學(xué)者的關(guān)注。骨組織工程學(xué)研究中，種子細(xì)胞及細(xì)胞載體的選擇是極其重要的問題。其中生物材料具有不可替代的作用，它能為細(xì)胞的黏附、分化和增殖提供良好的三維空間。因此，理想的生物材料應(yīng)具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、一定的骨誘導(dǎo)性、一定的抗負(fù)荷能力、可生物降解、有利于細(xì)胞貼附和血管長入，對細(xì)胞、組織等應(yīng)無毒性、無刺激性、無致畸突性，有可加工性及可消毒性。異種松質(zhì)骨具有天然密集孔，大小較均勻，孔的直徑更接近天然孔；隨著免疫學(xué)、生物化學(xué)的發(fā)展，經(jīng)一系列化學(xué)處理后，其中的免疫原性成分基本上被去除，故一般不會(huì)引起排斥反應(yīng)。

理想的骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料應(yīng)具有良好的生物相容性和可降解性，合適的三維多孔結(jié)構(gòu)，較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)性，良好的可塑性和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度，尤其是作為管狀骨的修復(fù)材料[1-2]。由于創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥等造成的大范圍骨缺損是骨科難題之一。目前骨移植手術(shù)是最為常用且行之有效的方法。提供移植的材料多種多樣，但理想的骨缺損修復(fù)材料，尤其是修復(fù)大段骨缺損的移植材料仍是骨科面臨的重要課題。異種骨由于來源廣泛和經(jīng)濟(jì)簡便，在解剖形狀、組織結(jié)構(gòu)等方面具有無法比擬的優(yōu)越性，一直是相關(guān)學(xué)者熱衷于研制、改良、開發(fā)的植骨材料。然而，異種骨的免疫排斥反應(yīng)妨礙植骨與骨缺損區(qū)域直接接觸，破壞植骨成分，造成局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致植骨吸收。

在消除異種骨的抗原性的同時(shí)，保留其誘導(dǎo)成骨能力，是人們所期望的。骨是一種復(fù)合組織，除骨細(xì)胞和骨基質(zhì)之外，還有血管、神經(jīng)、脂肪及殘留的骨髓成分等，這些成分均具有免疫原性。劉瑋等[3]用現(xiàn)代免疫組織化學(xué)方法結(jié)合新鮮不脫鈣切片技術(shù)首先證實(shí)：皮質(zhì)骨抗原性主要位于骨細(xì)胞和哈佛管內(nèi)皮上，免疫酶染色棕色酶反應(yīng)物主要集中在骨細(xì)胞周邊和中央管周圍基質(zhì)上，推測抗原可能位于細(xì)胞膜上。羅卓荊等[4]通過對松質(zhì)骨抗原性的研究發(fā)現(xiàn)，在骨小梁骨基質(zhì)染色陰性，而骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨陷窩等均有不同程度的陽性染色。細(xì)胞陽性染色的部位主要在胞漿中。也就是說，各種細(xì)胞成分仍是松質(zhì)骨中抗原的主要成分。常用的去細(xì)胞方法有酶消化法、滲透溶液法和去污清洗法。異種骨經(jīng)過脫蛋白、脫脂及脫細(xì)胞處理后抗原性降低，同時(shí)保留其特有的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和骨礦支架，且與人的骨組織結(jié)構(gòu)具有同源性，無機(jī)成分主要是羥基磷灰石，與人骨相同，具有較好的生物相容性。在具體制作工藝中，異種骨處理的無機(jī)與有機(jī)成分比至關(guān)重要。異種骨有機(jī)成分中很多非膠原的酸溶性蛋白具有免疫原性，去除不充分則保留較強(qiáng)抗原性，但去除過多膠原蛋白則材料易碎，影響生物力學(xué)強(qiáng)度。我們在總結(jié)以往制備工藝的基礎(chǔ)上，盡量保留膠原纖維，去除非膠原蛋白、肽類及脂類、細(xì)胞等，以降低抗原性，同時(shí)保留力學(xué)強(qiáng)度。H2O2可消除非膠原蛋白，氯仿、甲醇去脂，除垢劑Triton X-100是非離子性除垢劑，同蛋白酶及高滲鹽水一道具有脫細(xì)胞作用。Triton X-100屬于非離子型表面活性劑，在溶液中穩(wěn)定性強(qiáng)，能與細(xì)胞膜中的磷脂結(jié)合形成復(fù)合物，溶解于溶液中，同時(shí)其疏水端能和膜蛋白結(jié)合破壞細(xì)胞膜。高滲生理鹽水是借助細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差別，致使細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞從基質(zhì)中分離，從而獲得去細(xì)胞基質(zhì)。蛋白酶用酶的消化破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，細(xì)胞與基質(zhì)分離，從而達(dá)到脫細(xì)胞目的。

生物相容性是指材料與機(jī)體之間相互作用產(chǎn)生各種復(fù)雜的生物、物理、化學(xué)反應(yīng)，以及機(jī)體對這些反應(yīng)的忍受程度。目前對生物材料的相容性評價(jià)方法主要有兩類，一是動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即將材料植入體內(nèi)做組織學(xué)檢查，觀察材料及周圍組織病理變化；另一類為體外試驗(yàn)，即用材料或浸提液研究材料對組織生長、代謝及增殖方面的影響。目前國內(nèi)外尚沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方案，我們主要參考《生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評價(jià)技術(shù)要求》[5]，選用了6個(gè)實(shí)驗(yàn)對研制的去細(xì)胞基質(zhì)骨的生物相容性進(jìn)行評價(jià)。本研究通過對去抗原豬松質(zhì)骨進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)、溶血反應(yīng)、凝血反應(yīng)和熱源實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)該材料無毒性、無熱源性、不引起溶血和凝血反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，肌肉和骨長期植入試驗(yàn)動(dòng)物傷口Ⅰ期愈合，無感染和竇道形成，組織學(xué)觀察見骨折正常愈合，無抑制現(xiàn)象，組織反應(yīng)溫和，未見大量炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多核巨細(xì)胞集聚，證明材料無毒性、無刺激性和致突變性，不會(huì)引起溶血或凝血，生物相容性好。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，可以初步認(rèn)為，自行制備的去抗原異種松質(zhì)骨材料無毒性作用，具有良好的生物相容性，可望成為一種較理想的骨移植替代材料。

[1]Griffith LG.Emerging design principles in biomaterials and scaffolds for tissue engineering[J].Ann NY Acad Sci,2002,961:83-95.

[2]Chu TM,Holister SJ,Halloran JW,et al.Manufacturing and characterization of 3-D hydroxyapatite bone tissue engineering scaffolds[J].Ann NY Acad Sci,2002,961:114-117.

[3]劉瑋,陸裕樸,胡蘊(yùn)玉,等.異種植骨抗原性的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[J].中華骨科雜志,1989,9(1):53.

[4]羅卓荊,胡蘊(yùn)玉,王茜,等.異種松質(zhì)骨移植抗原分布的免疫組化研究[J].中國矯形外科雜志,1998,5(6):539-540.

[5]衛(wèi)生部藥政管理局.生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評價(jià)技術(shù)要求[M].1997,1-44.

The Biocompatibility Study of Antigen-Extracted Xenogeneic Cancellous Bone Matrix

WANG Dechao,LI Kui,CUI Bing,NING Yu,CHENG Feng.
Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College,Luohe 462000,China.

ObjectiveTo study the biocompatibility of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix for the clinical use in the bone reconstruction field.MethodsAcute toxicity test,pyrogen test,hemolysis test,hemopexis test,and long-term muscle and bone implant reaction were included in this study to evaluate the biocompatibility of antique-extrated xenogenetic cancellous bone matrix.ResultsAll results indicated that the material had no toxicity,and it did not cause hemolysis and hemopexis.The material is safe without pyrogen.It could be biodegradated and replaced by fibrous after implanting into muscle.It also could be replaced by bone tissue after implanting into bone defects in rabbits.Conclusion Antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix has good biocompatibility.It is a kind of ideal scaffold material.

Bone repair material;Antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix;Biocompatibility; Tissue engineering

R392-33

A

1673－0364（2009）－01－0032－03

2008年8月22日；

2008年11月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.009

462000河南省漯河市漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院骨五科。