王 嵐 邢 新 沈尊理

·綜述·

人工神經(jīng)血管化研究的進(jìn)展

王 嵐 邢 新 沈尊理

周圍神經(jīng)損傷后，缺損的替代修復(fù)是目前臨床上尚未完全解決的問題。目前主要的修復(fù)方法是自體神經(jīng)游離移植，該方法療效較為肯定，但存在供體來源有限，且易造成供區(qū)感覺或功能障礙、神經(jīng)瘤的形成、手術(shù)難度高以及軸突錯(cuò)位生長等問題。因此，應(yīng)用人工神經(jīng)移植物作為支架，修復(fù)周圍神經(jīng)缺損成為近年來周圍神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并已取得了可喜發(fā)展?，F(xiàn)在，不僅能在體外培養(yǎng)擴(kuò)增多種種子細(xì)胞，而且能將培養(yǎng)的細(xì)胞與各種生物材料復(fù)合，植入體內(nèi)以達(dá)到恢復(fù)周圍神經(jīng)功能的目的。然而，到目前為止，人工神經(jīng)移植尚不能完全與自體神經(jīng)移植的效果相媲美，如神經(jīng)缺損超過一定的長度或所需修復(fù)的神經(jīng)較粗大時(shí)，或有肌腱、骨外露等血供不良創(chuàng)面時(shí)，修復(fù)效果差?？赡艿脑?yàn)榻M織工程人工神經(jīng)移植體再血管化延遲，在早期不能及時(shí)建立內(nèi)在的血液循環(huán)，部分種子細(xì)胞由于缺血缺氧而死亡，影響神經(jīng)再生質(zhì)量。進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在血管周圍150～200 μm內(nèi)才能通過彌散來維持存活，否則移植體內(nèi)部的細(xì)胞將難以通過滲透作用獲得營養(yǎng)和氧分的支持。因此，組織工程人工神經(jīng)內(nèi)必須要有毛細(xì)血管的長入才能維持種子細(xì)胞正常的代謝[1]。目前，組織工程人工神經(jīng)早期血管化問題日益受到學(xué)者們的關(guān)注。

1 周圍神經(jīng)再生與再生微環(huán)境及局部血供

周圍神經(jīng)損傷后，末梢側(cè)靶組織分泌神經(jīng)生長因子等生物活性物質(zhì)，誘導(dǎo)中樞側(cè)的神經(jīng)出芽再生，神經(jīng)軸突由近端沿許旺細(xì)胞鞘膜的方向漸次延伸，達(dá)到神經(jīng)末梢。周圍神經(jīng)再生的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，由多因素共同參與。受損局部（包括近、遠(yuǎn)端的斷端）會(huì)釋放一系列內(nèi)源性生長因子，促進(jìn)神經(jīng)再生。這些誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)生長的因子包括，神經(jīng)營養(yǎng)因子家族、軸突生長促進(jìn)因子、作用于許旺細(xì)胞的因子等，它們是神經(jīng)軸突生長、許旺細(xì)胞遷移生長并形成髓鞘所不可或缺的[3－4]。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）如纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等在細(xì)胞的粘附和移行過程中發(fā)揮重要的作用。層粘連蛋白是基底膜的成分之一，能夠引導(dǎo)和促進(jìn)軸突長入基底膜支架，同時(shí)促使巨噬細(xì)胞移出移植物。纖維粘連蛋白也能促進(jìn)軸突再生并能夠抑制成纖維細(xì)胞過度浸潤。某些激素，如胰島素、甲狀腺素等也參與其中[5－6]。周圍神經(jīng)的血供有兩種形式：即外部縱形血管和內(nèi)部叢狀血管。Hirasawa發(fā)現(xiàn)神經(jīng)移植后，血管再形成有兩種形式：神經(jīng)外形式出現(xiàn)在移植后3～6周內(nèi)，為縱形血管；神經(jīng)內(nèi)形式即叢狀血管系統(tǒng)，可持續(xù)24周。不帶血管的神經(jīng)移植術(shù)后3 d為缺血狀態(tài)，術(shù)后1周發(fā)生急劇的血流增加。而帶血管的神經(jīng)移植早期雖也有血流升高，但基本處于平穩(wěn)狀態(tài)[7－8]，這對于保持神經(jīng)內(nèi)微環(huán)境的恒定可能有一定意義。周圍神經(jīng)損傷后，軸突和髓鞘的潰變產(chǎn)物是吸引巨噬細(xì)胞聚集的主要物質(zhì)[9]。來源于血液中的巨噬細(xì)胞能使移植體內(nèi)殘留的組織碎片得到較快清除，為軸突向遠(yuǎn)端生長打開通道[10]，為神經(jīng)軸索再生，迅速長入Bungner帶，提供了有利條件。帶血管的神經(jīng)移植的血流持續(xù)平穩(wěn)，維持了許旺細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)。調(diào)整局部神經(jīng)再生的微環(huán)境，對促進(jìn)神經(jīng)再生十分重要，而這又與局部血供密切相關(guān)。

2 血管新生的相關(guān)機(jī)制

根據(jù)血管再生中內(nèi)皮細(xì)胞的來源不同，可將血管新生（Neovascularization）分成血管形成（Vasculogenesis）和血管生成（Angiogenesis）兩種形式。血管形成，指血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于其前體細(xì)胞，即內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）或血管母細(xì)胞，這種血管形成方式主要是指在胚胎發(fā)育時(shí)，由中胚層的成血管細(xì)胞發(fā)育成血管系統(tǒng)。血管生成，是指血管的生長來源于已經(jīng)存在的成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過出芽及微血管融合生長等方式來進(jìn)行的。以往認(rèn)為，血管形成只限于胚胎，血管生成只存在于成體，隨著成體來源的EPC在體外分離成功，證明血管形成也發(fā)生在成體階段，主要參與重癥缺血區(qū)域血管的新生。

血管新生均由生長因子、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）間的相互作用所調(diào)控的。生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管生成素（Angiopoietin，Ang）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF－β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等。其中，VEGF和Ang是兩種最重要的促血管生成因子，在血管的新生中二者協(xié)同作用，VEGF促進(jìn)原始血管網(wǎng)的形成，而Ang則作用于隨后的血管改建塑形，促進(jìn)形成成熟且有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)。細(xì)胞外基質(zhì)包括整合素αγβ3、基質(zhì)－細(xì)胞蛋白、蛋白水解酶等可促進(jìn)新生血管形成和穩(wěn)定以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

3 人工神經(jīng)的血管化策略

3.1 人工神經(jīng)導(dǎo)管材料的修飾

人工神經(jīng)血管化的最終目的，是在導(dǎo)管內(nèi)形成有功能的血管網(wǎng)。這就要求導(dǎo)管材料與血管內(nèi)皮細(xì)胞有良好的組織相容性，并能促進(jìn)毛細(xì)血管的長入[14]。對材料進(jìn)行修飾，主要包括內(nèi)部支架的建立和外部多孔狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。適宜的內(nèi)外部結(jié)構(gòu)可以支持種子細(xì)胞的分化和軸突再生，支持細(xì)胞的貼附，防止結(jié)締組織長入，同時(shí)可以在導(dǎo)管表面固定添加一些促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附和增殖的物質(zhì)如：膠原、纖維結(jié)合素、層粘連蛋白等?，F(xiàn)在的人工神經(jīng)導(dǎo)管一般選擇孔隙率為70%，孔徑20～40 μm的半滲透性導(dǎo)管，以利于血管的長入和營養(yǎng)物質(zhì)的滲入[15]。

3.2 在人工神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)置入緩釋的生長因子

在人工神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)置入緩釋的復(fù)合生長因子，可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞向材料內(nèi)部遷移、增殖從而形成毛細(xì)血管網(wǎng)。直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和遷移的生長因子主要有VEGF、FGF家族；體內(nèi)能間接促進(jìn)血管形成的生長因子有TGF-β、PDGF和Ang[16]。后者主要作用是促進(jìn)血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分裂、增殖和遷移。

3.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞與種子細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)

血管內(nèi)皮細(xì)胞種植在材料內(nèi)可增殖分化形成血管。Sahota等[17]將人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種到可降解的支架上，植入裸鼠體內(nèi)，1 d后發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞在支架內(nèi)遷移，5 d后形成毛細(xì)血管樣管道，1周后形成了微血管，3周就與宿主的血管相連通。

3.4 體內(nèi)血管網(wǎng)包裹

Zhang等[18]研究表明，大網(wǎng)膜脂細(xì)胞能合成血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，大網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞能合成堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)。目前實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，VEGF和bFGF是強(qiáng)有力的促血管生長因子[19－20]。周建生等[2]利用帶蒂大網(wǎng)膜移位包裹人工神經(jīng)移植體，在術(shù)后3 d出現(xiàn)再血管化，7 d、14 d再血管化程度逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)其早期再血管化。

3.5 血管束植入

為了改善移植神經(jīng)的血供，1976年Taylor等提出了吻合血管的神經(jīng)移植，應(yīng)用帶橈動(dòng)、靜脈的橈神經(jīng)淺支修復(fù)正中神經(jīng)缺損，取得了成功。但在臨床上，由于帶血供的血管化神經(jīng)供區(qū)有限，1994年Cavadas等進(jìn)行了植入血管束預(yù)制血管化神經(jīng)的研究。張媛媛等[21]利用兔右耳的中央動(dòng)靜脈束植入面神經(jīng)上頰支，人為地形成一條帶血管的神經(jīng)移植體，在神經(jīng)移植過程中保持了血液供應(yīng)的連續(xù)性，為神經(jīng)軸索再生及迅速長入Bungner帶，提供了有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后6周、8周、10周，髓鞘厚度和神經(jīng)纖維直徑均優(yōu)于對照組；術(shù)后神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)快，遠(yuǎn)端肌肉和運(yùn)動(dòng)終板恢復(fù)快，SDH和AchE升高迅速。神經(jīng)血管束的植入方法相對血管網(wǎng)包裹而言可能具有更大的優(yōu)點(diǎn)，比較符合生理上神經(jīng)血供特點(diǎn)，植入材料內(nèi)部后縮短了再血管化的距離和時(shí)間，而且可以形成以植入血管束為蒂的帶蒂的人工神經(jīng)。

3.6 體外構(gòu)建血管網(wǎng)

1998年，Shinoka等[37]用Polyglatin/PGA制成管狀支架，從羊頸總動(dòng)脈或頸外靜脈取EC、SMC、FB，體外培養(yǎng)2周后種植于支架上，繼續(xù)孵育7 d后，細(xì)胞在支架融成片狀，即移植于羊的肺動(dòng)脈，11周后支架完全降解，管壁內(nèi)膠原蛋白含量為正常自體肺動(dòng)脈的73%左右，管壁中膜有彈性纖維生成，內(nèi)膜有ES特有的Ⅷ因子存在；管壁中鈣含量高于鄰近的自體肺動(dòng)脈，但無大塊鈣化組織出現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)中，PGA材料的機(jī)械支撐力較弱，可用于低壓的肺循環(huán)，但置于壓力較高的體循環(huán)中，則可能形成動(dòng)脈瘤。1998年，L’Heureux等[38]分別將人臍靜脈SMC和人皮膚下FB于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，,30 d后形成由細(xì)胞和ECM構(gòu)成的膜片，,將膜片從瓶壁上剝離，包裹在惰性管軸外繼續(xù)培養(yǎng)。在成熟期，膜片相互緊密粘接，形成圓柱狀培養(yǎng)物。將FB管膜經(jīng)脫水處理后制成無細(xì)胞內(nèi)膜，然后分步組裝：先將內(nèi)膜套在聚四氟乙烯多孔管軸(外徑3 mm)外，再裹上SMC膜片制為中膜，此時(shí)將構(gòu)制物置于生物反應(yīng)器中，將培養(yǎng)液同時(shí)通過管腔和管外進(jìn)行回流培養(yǎng)，然后再裹上FB膜作為外膜，最后取出中心管軸，于管內(nèi)接種EC，于3個(gè)月后構(gòu)制成具有活性細(xì)胞、有類似機(jī)體血管板層結(jié)構(gòu)的組織工程血管。其中的SMC和EC均表現(xiàn)分化狀態(tài)，血液相容性好，能耐受2 000 mmHg（7.5 mmHg=1 KPa）的靜水壓，其移植于體內(nèi)的長期通暢率和穩(wěn)定性等則有待進(jìn)一步觀察。在3個(gè)月時(shí)，膠原蛋白的含量為相應(yīng)自體腹主動(dòng)脈的25%左右，至5個(gè)月增加到99%；中膜有大量彈力纖維生成，內(nèi)膜有平整的EC。隨著時(shí)間延長，其機(jī)構(gòu)拉力曲線逐漸與自體腹主動(dòng)脈相一致，并且在中膜發(fā)現(xiàn)有金屬蛋白酶(MMP22)，這是種明膠酶，可分解膠原蛋白，表明組織工程血管的膠原組織處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。2001年，熊猛等[39]將培養(yǎng)3～7代的牛主動(dòng)脈的EC接種于PGA上，旋轉(zhuǎn)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)10 d，結(jié)果形成較完整的內(nèi)膜層，復(fù)蓋率達(dá)91%左右，前列環(huán)素生成率為4.6%，培養(yǎng)血管的ECⅧ因子相關(guān)抗原抗體染色呈陽性，EC在管腔內(nèi)表面貼附良好，細(xì)胞相互融合成片。

4 展望

目前采用的組織工程血管化的方法或多或少地存在一些問題，例如在材料內(nèi)復(fù)合生長因子的使用量、緩釋的速度調(diào)控、誘導(dǎo)形成的血管的成熟程度，以及種子細(xì)胞基因突變等安全性問題，都需要進(jìn)一步的研究。利用宿主體內(nèi)的血管進(jìn)行血管化，因血管長入需要一定時(shí)間，導(dǎo)致構(gòu)建組織的大小受到限制。體外構(gòu)造血管網(wǎng)是一種非常有前景的方法，但其難度大，有很多的技術(shù)問題需要解決，比如如何獲得非常大量的內(nèi)皮細(xì)胞，形成的血管網(wǎng)在體外怎樣保持其有效的生理功能等。相信隨著對血管化的形成和調(diào)控機(jī)制分子水平的基礎(chǔ)研究不斷深入，以及各種技術(shù)手段不斷發(fā)展、完善，最終會(huì)找到比較理想化的人工神經(jīng)血管化的方法。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）－01－0049－03

2008年7月24日；

2008年10月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.015

200080上海市上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院整形科（王嵐，沈尊理）；200433上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院整形科（邢新）。