陳紹興 李 沁 董 艷 楊權(quán)芬 陳 婭 錢麗芳

摘要:以質(zhì)粒pBR322為對(duì)象,在經(jīng)典的質(zhì)粒提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn),將酚氯仿異戊醇抽提和氯仿異戊醇抽提省去。比較了簡(jiǎn)便方法和經(jīng)典方法提取質(zhì)粒的效果,結(jié)果顯示:兩種方法均能夠提取出質(zhì)粒DNA,RNA的量并沒(méi)有比經(jīng)典方法提出來(lái)的多;簡(jiǎn)便方法抽取的質(zhì)粒,蛋白含量稍稍多于后者;簡(jiǎn)便方法節(jié)省了大約一半的提取時(shí)間及大量的藥品,并且減少了有害的化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體的危害,是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法,完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)需要。

關(guān)鍵詞:質(zhì)粒DNA;提取;方法;pBR322

中圖分類號(hào):Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.002

An Improvement Method on Plasmid Extraction

CHEN Shao-xing,LI Qin,DONG Yan,YANG Quan-fen, CHEN Ya, QIAN Li-fang

(Life Science and Technology College, Honghe University, Mengzi, Yunnan 661100, China)

Abstract:Plasmid pBR322 was used in this study and some improvement wew made based on the classical extraction method.The step of extracting by phenol chloroform isoamyl alcohol and chloroform isoamyl alcohol was omitted. Comparing the result of this two extraction method, it can find that the two methods both can get plasmid DNA and the quantity of RNA was no more than it by using the classical way. After omitting the two extraction method, the amount of protein is a little more than classical method. On one hand it will save about a half time, on the other hand it also can save plenty of physic. It will decrease the harm to human. This is an economical and convenient method and it can absolutely match the need of general experiment.

Key words: plasmid DNA; extraction; method; pBR322

質(zhì)粒的提取作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)基本操作技術(shù),幾乎每天都要用到。盡管現(xiàn)在質(zhì)粒提取的試劑盒有很多,但是對(duì)于普通的實(shí)驗(yàn)室,特別是科研經(jīng)費(fèi)不夠充分的實(shí)驗(yàn)室,并不能實(shí)現(xiàn)每次都用試劑盒來(lái)提取質(zhì)粒。所以,采用的還都是薩姆布魯克[1]所提出的經(jīng)典提取方法。本研究是在經(jīng)典的質(zhì)粒提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn),既節(jié)省了一大半時(shí)間,還節(jié)省了耗材和藥品,另外,減少了對(duì)酚和氯仿等有害化學(xué)物質(zhì)的使用。

1材料和方法

1.1菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α菌株和質(zhì)粒pBR322均由武漢大學(xué)謝志雄教授饋贈(zèng)。

1.2質(zhì)粒提取方法

先將含有質(zhì)粒pBR322的大腸桿菌DH5α菌株接種到含氨芐青霉素(Amp)濃度為50 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)典的質(zhì)粒提取方法參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行,簡(jiǎn)便方法是在經(jīng)典方法基礎(chǔ)上,省去酚氯仿異戊醇抽提和氯仿異戊醇抽提兩個(gè)步驟。

1.2酶切檢測(cè)

將兩種方法所提取的質(zhì)粒DNA用同樣的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行酶切[2],取3 μL進(jìn)行電泳檢測(cè),比較兩種方法提取的質(zhì)粒大小是否一致。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒提取

質(zhì)粒提取作為實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)常規(guī)操作,經(jīng)常占用很多的時(shí)間,在經(jīng)典方法的基礎(chǔ)上,將酚氯仿異戊醇抽提和氯仿異戊醇抽提這兩步省去,大量地節(jié)省了時(shí)間,并且質(zhì)粒pBR322的提取效果也符合實(shí)驗(yàn)要求,如圖1所示,經(jīng)典方法所提的質(zhì)粒DNA中含有的RNA較簡(jiǎn)便方法的方法多;再比較質(zhì)粒中蛋白質(zhì)含量,經(jīng)典方法的上樣孔無(wú)亮帶,表明質(zhì)粒不含蛋白質(zhì),而B(niǎo)的上樣孔出現(xiàn)亮帶,說(shuō)明有蛋白質(zhì)存在。分析原因,由于經(jīng)典的質(zhì)粒提取方法多出了兩步有機(jī)溶解的抽提,幾乎所有的蛋白質(zhì)被抽提干凈,而簡(jiǎn)便的方法由于省去抽提蛋白的過(guò)程,導(dǎo)致了最后的質(zhì)粒中還含有微量的蛋白。

2.2酶切檢測(cè)

將圖1中的A前兩管和B的前兩管pBR322質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切,結(jié)果如圖2所示,不管是經(jīng)典方法提取的質(zhì)粒還是簡(jiǎn)便方法提取的質(zhì)粒,用EcoRⅠ酶切后,其大小均在4.3 kb左右,這與線性的pBR322質(zhì)粒大小(4.36 kb)相符。所以,將經(jīng)典方法中的兩步抽提蛋白質(zhì)的步驟省略,不但不影響質(zhì)粒的提取,而且同樣都可以被限制性內(nèi)切酶所切開(kāi),可以用于分子生物學(xué)后續(xù)的酶切、連接和轉(zhuǎn)化等操作。

3討論

本研究通過(guò)對(duì)經(jīng)典質(zhì)粒提取方法的改進(jìn),將其中的兩步蛋白質(zhì)抽提操作省去,從所得的試驗(yàn)結(jié)果看,省去蛋白質(zhì)抽提這兩步后,并沒(méi)有影響質(zhì)粒提取的效果;此外,兩種方法所提取的pBR322質(zhì)粒均能夠被EcoRⅠ所切開(kāi),證明兩種方法所提取的質(zhì)粒在本質(zhì)上沒(méi)有區(qū)別,都可以用于后續(xù)的酶切、連接和轉(zhuǎn)化等分子生物操作。通過(guò)對(duì)兩種方法的比較,很顯然簡(jiǎn)便方法具備了很多的優(yōu)點(diǎn):其一,大大節(jié)省了質(zhì)粒DNA提取的時(shí)間;其二,大大節(jié)省了大量耗材;其三,減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有毒物質(zhì)的接觸。綜上所述,簡(jiǎn)便的質(zhì)粒提取方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

參考文獻(xiàn):

[1] J 薩姆布魯克, D W 拉塞爾. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社, 2005.

[2] F M 奧斯伯(美).精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第五版)[M].北京:科學(xué)出版社, 2008.