摘 要：為探明不同生長周期對四數(shù)九里香（Murraya tetramera）代謝物種類差異的影響，建立科學(xué)的培育體系及采摘體系，該研究采用非靶向代謝組學(xué)分析方法對四數(shù)九里香新葉和老葉進行分析，通過主成分分析法（PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析法（OPLS-DA）對代謝物的組間差異進行分析，采取將差異倍數(shù)、t檢驗的P值和OPLS-DA模型的VIP值相結(jié)合的方法來篩選差異積累代謝物。結(jié)果表明：（1）共篩選到850個差異積累代謝物（DAMs），其中426 個DAMs在老葉中表達較高，424個 DAMs在新葉中表達較高。（2）對篩選到的DAMs進行分類，共分為41類，其中較為豐富的是羧酸及其衍生物、脂肪?；⒂袡C氧化合物、苯和取代衍生物、黃酮類、有機氮化合物。（3）通過KEGG進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異積累代謝物在2-氧代羧酸代謝、嘌呤代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝等代謝通路中顯著富集。綜上認(rèn)為，在老葉中表達較高的差異積累代謝物與在新葉中表達較高的差異積累代謝物所富集的KEGG通路具有顯著性差異。

關(guān)鍵詞：四數(shù)九里香，葉片，代謝組，差異積累代謝物，KEGG途徑

中圖分類號：Q946

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2025）02-0240-11

基金項目：河池學(xué)院2022年度校級重點課題項目（2022XJZD003）； 湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（QL20220179）。

第一作者：曹晶瀟（1988—），博士，講師，研究方向為環(huán)境生態(tài)學(xué)，（E-mail）caojxecho@163.com。

^*通信作者：周韜，博士，研究方向為環(huán)境生態(tài)學(xué)，（E-mail）1505726228@qq.com。

Effects of growth cycle on accumulation of metabolites in leaves of Murraya tetramera

CAO Jingxiao¹，XING Qinqin²，BU Jiahao²，HAN Wenjun²，ZHOU Tao^2，3*

（1. Guangxi Key Laboratory of Sericulture Ecology and Applied Intelligent Technology，Guangxi Collaborative Innovation Center of Modern Sericulture and Silk，Guangxi Colleges Universities Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Microbial and Botanical Resources，School of Chemistry and Bioengineering，Hechi University，Hechi 546300，Guangxi，China; 2. College of Life and Environmental Sciences，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China; 3. Xinjiang Academy of Forestry，Urumchi 830000，China）

Abstract：In order to investigate the effects of different growth cycles on the differences in metabolite species of Murraya tetramera，and to establish a scientific cultivation system and harvesting system. This study used non-targeted metabolomics to analyze the new and old leaves of M. tetramera，the inter-group differences of metabolites were analyzed by principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least square-discriminant analysis （OPLS-DA），and the method of combining the fold change，the P value of the t-test and the VIP-value of the OPLS-DA model were adopted to screen for differentially accumulated metabolites （DAMs）. The results were as follows：（1） A total of 850 DAMs were screened，of which 426 DAMs were highly expressed in old leaves and 424 DAMs were highly expressed in new leaves. （2） The scrcened DAMs were classified into 41 categories，among which carboxylic acids and their derivatives，fatty acyls，orgdnic oxygen compounds，benzene and substituted derivatives，flavonoids and organonitrogen compounds were more abundant. （3） Pathway enrichment analysis by KEGG showed that the differential metabolites were significantly enriched in 2-oxocarboxylic acid metabolism，purine metabolism，phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis，glyoxylate and dicarboxylate acid metabolism. The KEGG pathway enriched by DAMs expressed at higher levels in old leaf was significantly different from that enriched by DAMs expressed at higher levels in new leaf.

Key words：Murraya tetramera，leaves，metabolome，differentially accumulated metabolites （DAMs），KEGG pathway

四數(shù)九里香（Murraya tetramera）為蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya）植物（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1997），是傳統(tǒng)的中藥材，其葉片具有行氣止痛、活血散瘀、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱之功效，可用于治療感冒發(fā)熱、胃痛、風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛等癥，是其主要藥用組織部位（全國中草藥匯編編寫組，1975）。近年來，隨著色譜技術(shù)的應(yīng)用，四數(shù)九里香的有效成分被逐步揭示，四數(shù)九里香植物富含類黃酮、咔唑生物堿等活性物質(zhì)，體外活性研究結(jié)果顯示對眾多癌細胞都具有顯著抑制作用（You et al.，2021），并且具有抗炎鎮(zhèn)痛作用及驅(qū)蟲作用等（You et al.，2017；Lyu et al.，2020）。

陳家源等（2009）用水蒸氣蒸餾法提取四數(shù)九里香揮發(fā)油并確認(rèn)了其中37個組分，主要化學(xué)成分為薄荷酮（53%）、異薄荷酮（14.45%）、檸檬烯（13.21%）和胡椒酮（7.96%）。牙啟康等（2010）從四數(shù)九里香乙醇提取物中分離得到5個單體化合物，即補骨脂素、槲皮素3-O-β-D吡喃葡萄糖苷、咖啡酸、正三十一烷和正三十四烷醇。張柯媛等（2012）建立了四數(shù)九里香補骨脂素的定性定量分析方法。毛長智等（2011）研究證明四數(shù)九里香揮發(fā)油、醇提物、水提物均具有顯著的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。Zhou等（2014）從四數(shù)九里香中分離出10種黃酮類化合物和3個蒽醌化合物。Lyu等（2020）對四數(shù)九里香的95%乙醇提取物進行檢測，發(fā)現(xiàn)19種簡單的咔唑生物堿，包括兩種新的咔唑生物堿，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分離的咔唑類生物堿化合物對NO產(chǎn)生的有效抑制活性，為四數(shù)九里香作為抗炎劑的傳統(tǒng)用途提供了證據(jù)。You等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，四數(shù)九里香的化學(xué)成分對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）具有不同程度的驅(qū)避活性，可成為防蟲的天然驅(qū)避劑。You等（2021）從四數(shù)九里香的葉和枝中分離出13種類黃酮化合物，并驗證分離的黃酮類化合物對腫瘤細胞具有細胞毒性。但是目前，還未見對四數(shù)九里香葉片的整體代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究。

代謝組學(xué)是研究生物體在特定條件下的代謝物組成和變化的科學(xué)，通過系統(tǒng)地分析生物樣本中的代謝物，如小分子有機物、代謝產(chǎn)物和代謝物組分，來揭示生物體內(nèi)代謝通路的功能和調(diào)控機制。本研究以四數(shù)九里香為研究對象，依托非靶向代謝組學(xué)分析方法，采用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）和質(zhì)譜技術(shù)（MS），通過對四數(shù)九里香新葉和老葉進行全面的代謝組學(xué)分析，擬探討以下問題：（1）不同生長周期對四數(shù)九里香葉片代謝物種類和含量的影響，以期揭示新葉與老葉之間的代謝差異；（2）通過差異積累代謝物的KEGG途徑富集分析，探索影響四數(shù)九里香代謝物種類和含量變化的主要生物合成途徑及其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為四數(shù)九里香葉片，將四數(shù)九里香生長1～2個月的葉片定為新葉（new leaf，NEW），生長1年半周期的葉片定為老葉（old leaf，OLD）。四數(shù)九里香種子采自廣西壯族自治區(qū)大化瑤族自治縣都陽林場（107.656 57° E、23.974 182° N），培養(yǎng)于湖南省長沙市中南林業(yè)科技大學(xué)校園溫室。取樣后立即置于液氮中速凍2 h后在-80 ℃超低溫冰箱中暫存用于后續(xù)試驗。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品制備 將四數(shù)九里香葉片放置于凍干機（Scientz-100F）中進行真空冷凍干燥；利用研磨儀（MM400，Retsch）將樣品研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg的樣品粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，之后將樣本置于4 ℃冰箱過夜；離心（12 000 r·min^-1，10 min）后，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm pore size）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 UPLC-MS/MS條件 液相條件：數(shù)據(jù)分析使用UPLC （SHIMADZU Nexera X2）進行色譜檢測，色譜柱為AgilentSB-C₁₈，2.1 mm × 100 mm，1.8 μm，柱溫 40 ℃；以流動相A和B進行梯度洗脫。流動相：A相為超純水加入0.1%的甲酸，B相為乙腈加入 0.1%的甲酸；柱平衡后，每個樣品進樣量為4 μL。洗脫梯度：0.00 min時B相比例為5%，9.00 min B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速為0.35 mL·min^-1。

質(zhì)譜條件：使用配備ESI-Turbo離子噴霧接口的MS系統(tǒng)（Applied Biosystems 4500 QTRAP）對UPLC流出物進行分析，操作參數(shù)如下：ESI源溫度550 ℃，正離子噴霧電壓5.5 kV，負(fù)離子噴霧電壓4.5 kV，簾氣25 psi，碰撞激活解離裝置5 pis。三重四級桿掃描是作為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple response monitoring，MRM）實驗獲得的，針對每個單獨的MRM轉(zhuǎn)變，具有優(yōu)化的去簇電位和碰撞能量CE。

1.2.3 代謝物定性定量分析 基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB （metware database），根據(jù)二級譜信息進行物質(zhì)定性，分析時去除同位素信號，使用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。這個過程涵蓋了基于二級質(zhì)譜信息的物質(zhì)鑒定，并排除了同位素信號、含有K⁺、Na⁺、NH₄⁺離子的信號，以及源自更大分子的碎片離子的重復(fù)信號。

定量分析則通過使用三重四極桿質(zhì)譜儀的MRM模式完成，這一步驟通過三重四極桿篩選出每種物質(zhì)的特征離子，并在檢測器中測量這些離子的信號強度。使用MultiQuant軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件，對色譜峰進行積分和校正，其中每個色譜峰的面積代表了相應(yīng)物質(zhì)的相對含量。通過對所有樣本的代謝物質(zhì)譜峰面積進行積分，并對不同樣本中相同代謝物的峰面積進行校正，得到準(zhǔn)確的代謝物質(zhì)量分析數(shù)據(jù)。

1.3 差異積累代謝物篩選

通過質(zhì)控樣本QC質(zhì)譜檢測分析代謝物的提取和檢測的重復(fù)性，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析法（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）進行代謝物組間差異分析。使用代謝物變量重要性投影（VIP） ≥1，折疊變化率（FC） ≥1，Plt;0.05作為篩選條件，并使用KEGG數(shù)據(jù)庫對篩選的差異積累代謝物進行富集分析。

1.4 差異積累代謝物驗證

1.4.1 樣品溶液的制備 精密稱取0.5 g烘干的四數(shù)九里香葉片，液氮研磨成粉末，加20 mL 75%甲醇，超聲提?。?00 W、55 ℃）30 min，過濾，重復(fù)2次，合并濾液，置50 mL量瓶中，用甲醇定容，取上清液，過0.22 μm濾膜，即得待測樣品溶液。

1.4.2 HPLC色譜條件 參考程慧林等（2022）的實驗條件，采用Waters ODS C₁₈柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為色譜乙腈（溶液A）和含有0.1%甲酸的超純水（溶液B），進行線性梯度洗脫，檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流速1 mL·min^-1。采用購自北京索萊寶科技有限公司的標(biāo)準(zhǔn)品對香豆酸、柚皮苷查爾酮、異槲皮苷用甲醇將其分別配制成2 mmol·L^-1的母液，進行梯度稀釋，以進樣量（μL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對香豆酸、柚皮苷查爾酮、異槲皮苷的回歸方程分別為Y=14.752X+23.015（r²=0.999 2）、Y=30.15X-0.084（r²=0.999 6）、Y=48.67X-2.315（r²=0.999 5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組PCA和OPLS-DA分析

基于UPLC-MS/MS檢測平臺、 北京百邁客生物科技有限公司自建植物代謝數(shù)據(jù)庫以及多元統(tǒng)計分析對NEW和OLD進行代謝組分析。主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，NEW和OLD組間離散程度較高，代謝差異明顯（圖1：A）。如圖1：B所示，OPLS-DA對于自變量X和因變量Y的擬合度分別為R²X=0.911，R²Y=1，預(yù)測度Q²Y=0.999。OPLS-DA模型為有效模型，樣本數(shù)據(jù)真實可靠度較高，穩(wěn)定性和預(yù)測能力較強，也表明四數(shù)九里香新葉與老葉中存在著不同類型以及不同含量的顯著差異積累代謝物。

2.2 差異積累代謝物篩選

新葉與老葉比較，以FCgt;1、Plt;0.05和VIPgt;1篩選差異積累代謝物，共篩選到850個差異積累代謝物，其中426個在老葉中表達較高，424個在新葉中表達較高（圖2：A、B），代謝物的log₂FC在0、13、-13出現(xiàn)了3個峰，VIP峰值在1左右（圖2：C、D）。利用KEGG對差異積累代謝物進行注釋，310個差異積累代謝物被注釋到，并對其進行分類，共分為41類，其中較為豐富的是羧酸及其衍生物、脂肪?；?、有機氧化合物、苯和取代衍生物、黃酮類、有機氮化合物（表1）。

2.3 差異積累代謝物KEGG功能注釋及富集分析

將差異表達代謝物進行KEGG注釋（Kanehisa et al.，2004），富集分析得到168條變化的代謝途徑，差異積累代謝物主要富集在2-氧代羧酸代謝（ko01210），嘌呤代謝（ko00230），苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（ko00400），乙醛酸和二羧酸代謝（ko00630），色氨酸代謝（ko00380），嘧啶代謝（ko00240）等代謝通路（圖3）。2-氧代羧酸代謝參與多種物質(zhì)的代謝，包括葡萄糖、乳酸、丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸等，在這個代謝通路中，代謝物被氧化成2-氧代羧酸，之后被進一步分解成二氧化碳和水。嘌呤代謝通路涉及嘌呤核苷酸的合成和降解，包括腺苷酸、鳥苷酸和肌苷酸等，對于DNA和RNA的合成以及細胞能量代謝都非常重要，嘧啶代謝通路對于細胞的生長和分裂非常重要。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，這個代謝通路參與芳香族氨基酸的合成，是生物體內(nèi)合成多種重要物質(zhì)的前體，如色素、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等。乙醛酸和二羧酸代謝通路參與多種有機酸的代謝，包括乳酸、蘋果酸、琥珀酸等，這些有機酸在細胞代謝中起著重要的作用，如能量產(chǎn)生、酸堿平衡等。

將上調(diào)和下調(diào)的差異積累代謝物分別進行分析，發(fā)現(xiàn)在老葉中上調(diào)的差異物主要富集在色氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，芥子油苷生物合成等途徑中（圖4：A）。這表明老葉中色氨酸代謝、苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成途徑更為活躍，導(dǎo)致相關(guān)代謝物的積累。色氨酸是一種重要的氨基酸，參與植物中多種生物合成途徑的合成，如類黃酮、激素和光合色素的合成。苯丙氨酸和酪氨酸則是色氨酸的前體，參與植物中多種次生代謝物的合成。相反，在老葉中，代謝途徑、次生代謝物的生物合成和氨基酸的生物合成途徑中下調(diào)的差異積累代謝物較為豐富（圖4：B）。這表明在老葉中，代謝活動相對降低。

KEGG富集網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析（圖5）顯示，新葉與老葉差異積累代謝物在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成與色氨酸代謝2條代謝通路上較為活躍，分別有10個、9個差異積累代謝物富集到這2條代謝通路中，在光合生物的碳固定、糖酵解/糖異生和戊糖和葡糖醛酸互變3條通路中各有6個、6個、5個差異積累代謝物富集。這些富集結(jié)果揭示了新葉與老葉之間代謝活性的差異。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及色氨酸代謝通路的活躍度增加，可能意味著在新葉中這些通路的代謝更為活躍。然而，光合生物的碳固定、糖酵解/糖異生和戊糖和葡糖醛酸互變通路的活躍度增加，則可能反映了新葉中的能量代謝和碳源利用的增強。

2.4 高效液相色譜分析驗證

為驗證代謝組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究篩選了3個差異積累代謝物進行高效液相色譜檢測分析，結(jié)果見圖6。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到四數(shù)九里香中對香豆酸、柚皮苷查爾酮、異槲皮苷在新葉中的含量分別為0.225、0.756、0.156 μg·g^-1，在老葉中的含量分別為0.018、0.164、0.546 μg·g^-1，對香豆

酸、柚皮苷查爾酮在老葉中顯著下調(diào)，在新葉中上調(diào)。結(jié)果表明這些代謝物的積累程度與代謝組數(shù)據(jù)一致，說明代謝組數(shù)據(jù)的可靠性。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同生長周期對四數(shù)九里香葉片代謝物種類和含量的影響

通過廣泛非靶向代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，我們對四數(shù)九里香新葉和老葉中的代謝物進行了初步分析。本研究結(jié)果表明，新葉和老葉之間的差異積累代謝物種類和含量的變化可能與葉片的生長和發(fā)育階段有關(guān)。本研究共檢測到1 122個代謝物，并發(fā)現(xiàn)其中有850個代謝物在新葉和老葉之間存在差異表達。四數(shù)九里香在不同的生長周期其同一代謝物含量有明顯差異，說明植物的代謝物積累與生長階段有顯著相關(guān)性。隨著生長周期的延續(xù)，植物中的代謝物可能隨年齡的增長而增加，也可能在某個時期達到最高值后下降。程慧林等（2022）對不同柑橘（Citrus）品種類黃酮含量的分析發(fā)現(xiàn)，同一品種新葉和老葉間的類黃酮含量及種類也存在較大差異，大部分品種老葉中類黃酮總量高于新葉。Li等（2014）連續(xù)3個年份對“國慶1號”柑橘（Citrus unshiu）果實組織中的主要苦味物質(zhì)（諾米林、檸檬苦素和柚皮苷）進行了測定，結(jié)果表明這些物質(zhì)隨著生長周期的延長而下降。代謝物的差異變化是由RNA水平上的基因表達而引起。Bi等（2022）通過對3個柑橘雜交品種在開花90 d、變色180 d和成熟270 d進行代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明在果實發(fā)育和成熟過程中，與初級代謝、次級代謝、細胞壁代謝、植物激素和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的許多基因均上調(diào)，從而導(dǎo)致代謝物差異。此外，次生代謝物在植物的生長發(fā)育中具有重要作用。Li等（2021）采用代謝組分析發(fā)現(xiàn)酸棗（Ziziphus jujuba）芽葉和成熟葉中黃酮類化合物是主要的差異積累代謝物，并且其對葉片顏色具有決定性的作用。通過對植物代謝組分析可知藥用植物的積累規(guī)律，從而確定其最佳采收期（Li et al.，2020）。一般而言，生長周期越長生物量積累越多，對于特定的成分，我們還需要綜合研究其生物量和組成，以確定這些特定成分的最佳采收期。

3.2 植物代謝物的差異是由一定的生理活動造成

在植物的生長過程中，新葉通常處于較為活躍的生長和發(fā)育階段，其代謝旺盛；而老葉則經(jīng)歷了較長時間的光合作用和代謝活動，代謝活動開始下降。因此，在四數(shù)九里香中，我們觀察到新葉中高表達的代謝物主要富集在代謝途徑、次生代謝物的生物合成和氨基酸的生物合成途徑中，老葉中高表達的代謝物主要富集在色氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，芥子油苷生物合成等途徑中。老葉中光合生物的碳固定也顯著下降，說明其光合作用降低。芥子油苷是一種天然的殺蟲劑，在老葉抵御病原體及害蟲中具有重要作用（Chhajed et al.，2020）。代謝物的含量與樹齡有一定的關(guān)系，辣木（Moringa oleifera）樹齡與總類胡蘿卜素含量呈正相關(guān)，與抗壞血酸含量呈負(fù)相關(guān)。類胡蘿卜素可以保護細胞免受輻射傷害，而抗壞血酸的下降可能因其分解大于合成而導(dǎo)致（Vázquez-León et al.，2017）。此外，外部因素如光、溫度、土壤水分、肥力和鹽度等都可以顯著影響與植物生長和發(fā)育有關(guān)的某些過程，甚至影響植物合成次生代謝物的能力，從而響應(yīng)環(huán)境脅迫（Verma amp; Shukla，2015）。例如，在水分脅迫條件下圣約翰草（Hypericum perforatum）的葉片凈光合速率顯著低于對照，植物葉片組織對氧自由基的解毒能力顯著提高（Zobayed et al.，2007）。

綜上表明，四數(shù)九里香葉片的代謝物在生長周期中會發(fā)生變化，反映了葉片的生長和發(fā)育狀態(tài)以及代謝活動的需求。這為進一步探索四數(shù)九里香的生長和發(fā)育機制、優(yōu)化種植和加工工藝提供了重要線索，并且對于揭示植物生理和代謝調(diào)控的基本規(guī)律具有一定的科學(xué)價值。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）