摘要：本研究設(shè)置了4個生長條件（正常、低氮2 mmol?L-1 N+不接種根瘤菌、低氮+接種根瘤菌、5 mmol?L-1 N +不接種根瘤菌）對一個蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）共生固氮突變體esn1進(jìn)行了生長發(fā)育表型鑒定，以期明確該材料的生長發(fā)育特征。結(jié)果顯示，在正常生長條件下，突變體esn1的所有器官，包括根、莖、葉、花、果莢、種子以及花期、分枝數(shù)均正常；但在低氮條件下，其接菌的生長速度與未接菌的生長速度幾乎一樣，這表明該突變體幾乎不能固氮。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該突變體雖然存在嚴(yán)重的固氮缺陷，但其仍然保留非常微弱的（lt;1%）固氮能力。在低氮條件下，突變體esn1根系、葉片、株高等發(fā)育與野生型植株的也沒有差異。這些結(jié)果表明，esn1僅在共生固氮方面存在極其嚴(yán)重的缺陷，而其他的生長發(fā)育過程均不受影響。

關(guān)鍵詞：蒺藜苜蓿；共生固氮；突變體；表型鑒定；生長發(fā)育

中圖分類號：S542.9" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " 文章編號：1007-0435（2025）02-0327-08

Phenotypic Characterization of esn1， a Symbiotic Nitrogen-Fixing Mutant of Medicago truncatula

GAO Ya-qing， SHI Wen-min， ZHANG Yong-kang， SUN Wan-yu， ZhU Long-tao， YIN Xu， XI Jie-jun*

（College of Grassland Agriculture， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：To characterize the growth and development of a symbiotic nitrogen-fixing mutant esn1 of Medicago truncatula， in this study we set up 4 different growth conditions： normal nitrogen， low nitrogen with rhizobia inoculation， low nitrogen without rhizobia inoculation， 5 mmol?L-1 N without rhizobia inoculation. The results showed that under normal nitrogen growth conditions， all organs of the mutant esn1， including roots， stems， leaves， flowers， pods， seeds， flowering period， and number of branches were normal； but under low-nitrogen conditions， the growth rate of the mutant esn1 with rhizobia inoculation was almost identical to that of uninoculated， indicating that it could hardly fix nitrogen. Further analysis found that although the mutant had severe nitrogen fixation defect， it still retained a very weak （lt;1%） nitrogen fixation ability. Under low-nitrogen conditions， the development of the root system， leaves， and plant height of the mutant esn1 was not different from that of the wild-type plant. These results indicate that esn1 only has extremely severe defect in symbiotic nitrogen fixation， while other growth and development processes are not affected.

Key words：Medicago truncatula；Symbiotic nitrogen fixation；Mutants；Phenotypic characterization；Growth and development

表型鑒定是生物科學(xué)研究中的慣常研究內(nèi)容之一。在宏觀上，表型鑒定可以通過對不同物種或不同個體的表型特征進(jìn)行觀察和比較，揭示生物在形態(tài)、生理和行為等方面的差異，進(jìn)而加深對生物多樣性的理解［1］，還可以通過觀察和分析生物在不同環(huán)境中的表型變化，揭示生物對環(huán)境變化的適應(yīng)策略和適應(yīng)機(jī)制［2］。在微觀上，可利用基因敲除、突變體篩選等方法，通過表型變化來推斷基因的生物學(xué)功能［3］；還可通過對農(nóng)作物、畜禽、野生動植物等的表型特征進(jìn)行鑒定和評估，可以為其良種選育、品種改良、保護(hù)管理等提供科學(xué)依據(jù)［4］。此外，在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，表型鑒定在疾病診斷、藥物研發(fā)等方面具有重要應(yīng)用價值，可通過對患者的表型特征進(jìn)行分析，為疾病的診斷和治療提供重要信息，促進(jìn)個性化醫(yī)療的發(fā)展［5］。因此，表型鑒定通常是各種基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究工作的必要前提。

雖然表型鑒定在生物學(xué)研究中具有重要作用，但也面臨著一些挑戰(zhàn)和困難。表型作為生物體外在表現(xiàn)的總和，包括形態(tài)特征、生理特性和行為等多方面內(nèi)容。因此，表型鑒定通常需要綜合考慮不同方面的多種觀察和測量，這使其具有較高的復(fù)雜性［6］。由于生物表型受環(huán)境因素影響較大，因此需要在控制條件下進(jìn)行表型鑒定，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性［7］。而對于某些表型特征或研究目的，可能存在多種探究方法，而不同的探究方法可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果。因此，在進(jìn)行表型鑒定時，需要選擇合適的探究方法，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以確保結(jié)果的可靠性和可比性［8］。此外，在突變體的創(chuàng)制過程中，各種化學(xué)、物理或生物誘變通常會造成全基因組的較多位點(diǎn)損傷［9］，而多數(shù)實(shí)驗室通常只關(guān)注與本實(shí)驗室研究方向相關(guān)的表型，至于多效基因突變體所有的附帶表型或其他方面的微弱表型通常因研究困難而被忽略。上述種種原因都可導(dǎo)致表型解析的偏差或不完全，通常會導(dǎo)致對目標(biāo)基因生物學(xué)功能認(rèn)知的不完全或偏頗。

豆科植物與根瘤菌形成的共生固氮作用，可在常溫常壓下將空氣中的游離氮?dú)猓∟2）固定成植物可以利用的化合態(tài)氮素，是一種對農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境極其重要的特殊生物性狀。在當(dāng)今化學(xué)合成氮肥造成嚴(yán)重污染且成本高昂的背景下，通過基因工程將豆科植物共生固氮的能力轉(zhuǎn)移至農(nóng)作物中的嘗試引起了極大的關(guān)注［10］。因此，學(xué)界早在2000年左右選定蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）作為豆科植物的模式生物，通過甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate， EMS）、快中子以及轉(zhuǎn)座子插入等方式創(chuàng)造了各種來源的突變體庫［11-13］，以探究豆科植物共生固氮的遺傳基礎(chǔ)和發(fā)育過程。過去20多年通過對豆科植物共生固氮突變體的表型鑒定研究，發(fā)現(xiàn)了很多重要的生物過程，如根瘤原基的形成、根瘤菌對植物的侵染、根瘤固氮功能的形成以及根瘤數(shù)量的調(diào)控等。這些過程在豆科植物共生固氮性狀中隸屬不同的調(diào)控等級和方面，共同協(xié)調(diào)共生固氮的高效有序進(jìn)行［11］。本課題組曾經(jīng)篩選鑒定到一個蒺藜苜蓿快中子突變源的共生固氮效率相關(guān)的突變體esn1（early senescent nodule 1）［14］并克隆了其對應(yīng)的突變基因MtNCR211［11，15］。突變體esn1因其根瘤較野生型的發(fā)生早衰而命名，而后的遺傳定位發(fā)現(xiàn)其目的基因隸屬于更早報道的蒺藜苜蓿NCR肽（Nodule Cysteine-Rich Peptides）家族的第211個成員。當(dāng)前，關(guān)于esn1突變體的信息主要集中在固氮相關(guān)生物發(fā)育過程以及對應(yīng)基因的分子功能，尚未有其他方面的報道。

在上述背景下，本研究對蒺藜苜蓿共生固氮突變體esn1進(jìn)行了全面的生長發(fā)育鑒定，以評估其目的基因MtNCR211的缺失對各種生物發(fā)育過程的影響，同時為該材料用于其他目的的研究提供基礎(chǔ)的支撐信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

蒺藜苜蓿A17（M. truncatula ‘Jemalong A17’）和突變體esn1均來自美國諾貝基金會［14］。健康飽滿的種子用濃硫酸處理6～8 min后用蒸餾水沖洗干凈， 吸脹4～6 h，然后置于培養(yǎng)皿中室溫（25℃左右）避光發(fā)芽48 h，待胚根長至1 cm左右移栽。對于正常生長條件下的生長評估，將發(fā)芽種子種于含草炭土的花盆（上口徑17㎝×下口徑10 cm×高2 cm），生長期間根據(jù)需求澆灌全氮營養(yǎng)液。對于低氮、低氮接菌和 5 mmol?L-1 KNO3條件的生長生理評估，則將發(fā)芽種子種于裝有珍珠巖∶河沙（3∶1，v/v）的滅菌基質(zhì)的32孔育苗穴盤（長54 cm×寬28 cm；穴孔6 cm×2.6 cm×5.3 cm），移栽時每盤澆灌1 L用KNO3調(diào)至2 mmol?L-1 N的低氮ISV營養(yǎng)液（0.125 mmol?L-1 N，0.125 mmol?L-1 P， 0.56 mmol?L-1 K，0.31 mmol?L-1 Ca， 0.06 mmol?L-1 Mg，14 μmol?L-1 Fe）［14］。植物生長一周后，低氮組用ISV營養(yǎng)液澆灌；低氮接菌組用ISV營養(yǎng)液稀釋的中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）懸浮液（OD600=0.05）澆灌接種；5 mmol?L-1 KNO3組用KNO3將ISV營養(yǎng)液中氮素調(diào)至5 mmol?L-1進(jìn)行澆灌。智能溫室光周期16 h/8 h，晝夜溫度為25℃/20℃。

1.2 指標(biāo)測定

根據(jù)試驗?zāi)康模孟鄼C(jī)、尺子及天平對植株、葉片、種子和果莢等器官在設(shè)定時間點(diǎn)上進(jìn)行取樣觀測，每處理三個重復(fù)，每重復(fù)8個植株。采用通用方法測量植物鮮重、干重［16］，使用Chlorophyll Meter SPAD 502Plus（Konica Minolta Sensing， Inc.）測量葉綠素含量 ［17］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和顯著性檢驗，用Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常生長條件下esn1的生長發(fā)育評估

為了探究esn1生長發(fā)育是否正常，本研究在正常生長條件下對其除根瘤以外的所有器官進(jìn)行了觀測，結(jié)果如圖1所示。在草炭土中生長并澆全營養(yǎng)液的條件下，esn1植株生長正常。其在葉片的大小、色澤、紫色花青素斑點(diǎn)（圖1C-D），植株的大小、分枝以及生育時期（圖1A-B和E），花的大小、顏色、形態(tài)及體毛（圖1F-G），果莢的大小和形態(tài)（螺旋結(jié)構(gòu)、蒺藜倒刺）（圖1H-I），以及種子的顏色、形態(tài)、大小及重量（圖1J-M）等方面，均與野生型植株A17無顯著差別。此外，esn1的根發(fā)育與野生型的也沒有差異（圖1N-O）。這些結(jié)果表明，在正常生長條件下，esn1的器官包括根、莖、葉、花、果和種子具有與野生型植株A17一樣正常的發(fā)育過程和發(fā)育時期。

2.2 在低氮、低氮接菌和 5 mmol?L-1 KNO3條件下對esn1的生長生理評估

在低氮條件下接種兼容性根瘤菌時，蒺藜苜蓿會與根瘤菌互作進(jìn)行共生固氮以克服氮素匱乏的生長限制困境。因此，若esn1存在固氮共生突變，那么在低氮接菌條件下，由于其不能固氮或固氮較少或固更多的氮會影響植株的生長發(fā)育。在這一假設(shè)下，本研究設(shè)計了檢測esn1共生固氮缺陷程度的試驗：將野生型A17和突變體esn1植株種于珍珠巖和砂子中，在低氮、低氮接菌和5 mmol?L-1 KNO3條件下對復(fù)葉數(shù)進(jìn)行了連續(xù)統(tǒng)計。

圖2顯示，在低氮接菌的情況下，esn1和A17在接種后3天（3 days post inoculation， 3dpi）和7 dpi時，植株的復(fù)葉數(shù)沒有差異，分別為1片和2片復(fù)葉；但在14 dpi，A17的葉片已經(jīng)為6片，而esn1的為3片；在21 dpi和28 dpi，A17的復(fù)葉差不多為14片和21片，而esn1的復(fù)葉卻一直沒有超過5片。在低氮未接菌的情況下，A17和esn1葉片的發(fā)育速度沒有差異；此外，在5 mmol?L-1 N的情況下，A17和esn1葉片的發(fā)育速度也沒有差異。由于esn1與A17在低氮不接菌和5 mmol?L-1 N的生長條件下葉片發(fā)育速度沒有差異，而在低氮接菌時esn1的葉片發(fā)育比A17慢且數(shù)量較少，這表明esn1的確存在固氮缺陷。有趣的是，在低氮接菌28 dpi時A17的葉片數(shù)比其種在5 mmol?L-1 N條件下的葉片數(shù)還要多，表明蒺藜苜蓿具有很強(qiáng)的共生固氮能力。

為了更直觀地描述esn1共生固氮缺陷的特性，本研究還對種植于珍珠巖和砂子中野生型和突變體植株在低氮、低氮接菌和5 mmol?L-1 KNO3條件下進(jìn)行了地上部分高度的連續(xù)測量。結(jié)果顯示（表1），在低氮接菌的情況下，A17和esn1在3 dpi和7 dpi時，植株的高度沒有差異；但在14 dpi以后，A17的增長速度明顯高于esn1的；在低氮未接菌的情況下和5 mmol?L-1 N的生長條件下，esn1突變體和A17野生型植株的生長速度差異都不大。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，esn1具有嚴(yán)重的固氮缺陷。在低氮接菌條件下28 dpi時，A17地上部的高度為12.1 cm，而其在澆灌5 mmol?L-1 N營養(yǎng)液時地上部的高度僅為7.4 cm，表明蒺藜苜蓿共生固氮所提供的氮比每周給植物補(bǔ)充的氮供應(yīng)量要大的多，進(jìn)一步表明豆科植物蒺藜苜蓿的共生固氮能力很強(qiáng)。

雖然形態(tài)指標(biāo)如復(fù)葉數(shù)和地上部高度明確地顯示了esn1存在共生固氮缺陷，但很難分辨其到底能否固氮。為此我們對野生型A17和突變體esn1植株在低氮、低氮接菌和5 mmol?L-1 KNO3條件下進(jìn)行了葉片葉綠素含量的連續(xù)測量。結(jié)果顯示（表 2），在所有處理中，A17和esn1植株從3 dpi到7 dpi時，葉綠素的含量都下降，這因為在3 dpi時植株還比較小，其體內(nèi)氮素主要來自種子自身的營養(yǎng)儲存，因此葉綠素含量較高而且沒有差異。在7 dpi時，由于植株的進(jìn)一步生長，更多新器官如根和葉片的形成需要更多的營養(yǎng)元素，也包括氮素，由于環(huán)境氮供應(yīng)有限，造成葉片葉綠素含量的下降。值得一提的是，在7 dpi時蒺藜苜蓿的根瘤還未發(fā)育完全，此時幾乎沒有或即將形成固氮能力。

在14 dpi以后，低氮接菌處理中的野生型A17葉綠素含量遠(yuǎn)高于突變體esn1植株的，再次表明esn1存在共生固氮缺陷；而在低氮不接菌和5 mmol?L-1 KNO3條件下，野生型A17與突變體esn1植株在各時間點(diǎn)上的葉綠素幾乎沒有差異。由于低氮接菌esn1植株的葉綠素含量與低氮不接菌的A17及esn1的相當(dāng)，表明低氮接菌的esn1因無法共生固氮而氮素匱乏致使葉綠素含量與低氮不接菌的植株相當(dāng)。此外，5 mmol?L-1氮不接菌條件下，野生型A17與突變體esn1植株的葉綠素含量相當(dāng)且遠(yuǎn)高于低氮不接菌的植株，表明esn1的氮素吸收利用代謝途徑不存在問題。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，esn1植株在低氮不接菌條件下葉綠素含量自14 dpi開始一直下降，而在低氮接菌時則一直維持著一個穩(wěn)定的較低值；此外，與7 dpi的葉綠素含量相比，esn1植株在低氮不接菌條件下葉綠素下降了45.8%，而低氮接菌時則下降了30.8%；而且28 dpi時esn1植株的葉綠素含量在低氮接菌時比低氮不接菌條件下的高。這些結(jié)果表明，esn1植株可以進(jìn)行非常微弱的固氮作用。在低氮接菌時野生型A17植株在能固氮即14 dpi以后葉綠素含量遠(yuǎn)高于其在5 mmol?L-1氮不接菌條件下的，表明蒺藜苜蓿的共生固氮能力超過外源添加5 mmol?L-1氮素當(dāng)量的氮供應(yīng)。

雖然從葉綠素連續(xù)測量的試驗可推斷esn1具有微弱的固氮活性，然而為了確保這種微弱固氮活性不是由于試驗誤差或試驗精度水平所得出的錯誤結(jié)論，進(jìn)而提出假設(shè)：若esn1真的具有微弱的固氮活性，那么隨著時間的積累，其在低氮接菌時的生物量應(yīng)該比低氮未接菌時的高。因此，本研究對低氮、低氮接菌和5 mmol?L-1 KNO3處理下的21 dpi和28 dpi的植株干鮮重進(jìn)行了測量。結(jié)果顯示（圖3），在低氮未接菌和5 mmol?L-1 N的試驗條件下，esn1和A17在21 dpi和28 dpi時的干鮮重幾乎相當(dāng)，而低氮接菌處理則大幅度低于野生型的，表明其固氮缺陷嚴(yán)重。但在28 dpi時esn1低氮接菌處理中的干重顯著地高于低氮未接菌的，表明esn1的確具有微弱的固氮活性。

2.3 低氮條件下esn1的根系發(fā)育觀測

Veereshlingam等［18］報道一個蒺藜苜蓿突變體nip不僅共生固氮存在缺陷，而且其側(cè)根在低氮條件下也變得很少。因此，本研究也在低氮條件下對共生固氮缺陷突變體esn1的根系發(fā)育進(jìn)行了觀測。結(jié)果顯示（圖4），在低氮條件下esn1的主根長和側(cè)根數(shù)在5 d，10 d和15 d與A17的在統(tǒng)計上沒有差異。此外，這些結(jié)果還表明esn1與nip的共生固氮缺陷不是由同一基因造成的。

3 討論

表型鑒定的主要目的為通過比較鑒別發(fā)現(xiàn)各種處理對客體造成的影響或效果。本研究通過各種處理對之前報道的一個蒺藜苜蓿共生固氮突變體esn1進(jìn)行了生長發(fā)育相關(guān)的表型鑒定［14-15］，結(jié)果顯示MtESN1的突變，除了對共生固氮性狀有影響外，對其他發(fā)育過程或性狀如葉片、花、果莢、種子、根的發(fā)育以及花期、分枝和氮的吸收和利用等過程均無影響。這些結(jié)果表明MtESN1/NCR211僅轄限在共生固氮的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，不像其他基因如MtSGL1突變后不但使蒺藜苜蓿三出復(fù)葉變成單片小葉，而且還造成花的發(fā)育異常，并且無法形成種子［19］。研究發(fā)現(xiàn)，MtESN1編碼一個抗菌肽NCR211［15］。NCR是一類富含半胱氨酸的大小為60～90個氨基酸的類似防御素小肽，家族成員多達(dá)600個以上，僅在IRLC豆科植物分枝中存在，主要控制根瘤細(xì)胞內(nèi)類菌體的分化［20-21］。在267種不同的試驗條件下利用344種RNA探針對NCR基因表達(dá)進(jìn)行全局分析的結(jié)果顯示，334個NCR基因，除了5個基因NCR247，NCR077，NCR218，NCR122和NCR247在其他組織或試驗條件下有表達(dá)外，都不受其他生物或非生物因素的影響，僅在根瘤組織里高水平表達(dá)［22］。本研究對根、莖、葉、根瘤、花、幼嫩果莢等組織進(jìn)行qRT-PCR定量的研究發(fā)現(xiàn)， NCR211也僅在根瘤內(nèi)高度表達(dá)，而在其他組織則沒有表達(dá)（未發(fā)表）。在低氮條件下，與nip突變體不同［18］，esn1的主根和側(cè)根發(fā)育不受影響（圖4）。這些證據(jù)表明NCR是極端特異的共生固氮相關(guān)基因，因此，MtESN1/NCR211的突變僅影響共生固氮，而不會影響其他的性狀發(fā)育或代謝過程，而這與本研究中的表型鑒定結(jié)果相吻合。

為了析因或定性，在科學(xué)探究的過程中往往會碰到一些非常邊際或觀測起來非常困難的問題，因此，常常需要高精準(zhǔn)度的試驗結(jié)果。本研究對蒺藜苜蓿突變體esn1進(jìn)行表型表征的結(jié)果顯示，其在低氮接菌的情況下與野生型的發(fā)育存在巨大差異，因此很容易判斷其存在嚴(yán)重的共生固氮缺陷（圖2及表1），但其株高及葉片發(fā)育速度又與低氮不接菌的相當(dāng)，而且研究發(fā)現(xiàn)esn1根瘤固氮酶nifH在9 dpi時的表達(dá)與野生型A17的沒有差異［14］ ，因此，很難判定其是否依然存在微弱的固氮能力。而該問題是表征共生固氮突變體特征特性以及分析其生物學(xué)功能的核心問題。為了厘清該問題，我們假設(shè)其存在微弱的固氮能力并對葉綠素和干鮮重進(jìn)行了連續(xù)的觀測，試驗結(jié)果可相互驗證且都顯示esn1具有微弱的共生固氮能力（表2和圖3）。通過乙炔還原測定固氮酶活性的試驗結(jié)果顯示，14 dpi時esn1固氮酶活力為0.0081，而A17的為1.04（單位：nmol?L-1 ·plant-1·h-1）［14］，前者僅為后者的0.78%。這些結(jié)果表明，esn1雖然存在極其嚴(yán)重的固氮缺陷，但依然存在非常微弱的共生固氮能力。此外，本研究的結(jié)果還表明，不借助價格高昂的儀器和復(fù)雜的試驗技術(shù)，在精心的試驗設(shè)計和嚴(yán)格的試驗條件下，也可對某些困難問題進(jìn)行高精準(zhǔn)度的定性觀測，而且這些定性觀測結(jié)果有助于對高精尖儀器所測量到的微弱數(shù)值的真實(shí)性進(jìn)行判定。

豆科植物因突出的共生固氮能力而備受關(guān)注，因其有助于減少化學(xué)合成氮肥的施用，從而降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對化石燃料的依賴，減少溫室氣體排放和氮污染［23］。此外，共生固氮還在改善土壤結(jié)構(gòu)和質(zhì)量、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和生物多樣性［24］、增強(qiáng)植物對干旱、鹽堿和重金屬［25-26］等逆境的抗性方面也具有重要的作用。因此，為了解析豆科植物遺傳發(fā)育基礎(chǔ)而創(chuàng)制的共生固氮突變體不但可以應(yīng)用于共生固氮發(fā)育過程和遺傳定位研究，也可用于上述研究以全面評估并揭示共生固氮在不同領(lǐng)域中的意義。 在本研究中，共生固氮突變體esn1，因MtESN1/NCR211突變不影響其他發(fā)育過程而僅限于共生固氮過程，而且固氮效率喪失99%以上，因此，可成為各種共生固氮相關(guān)評估研究的優(yōu)良材料。

4 結(jié)論

蒺藜苜蓿突變體esn1是一個幾乎沒有固氮活性的共生固氮缺陷突變體，其目的基因MtESN1/NCR211的突變，僅影響共生固氮過程而不影響其他器官的生長及發(fā)育。

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（責(zé)任編輯" 閔芝智）