關(guān)鍵詞高良姜素；膝關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；自噬；凋亡；AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路

膝關(guān)節(jié)炎（kneeosteoarthritis，KOA）是臨床上常見(jiàn)的一種慢性退行性疾病，以關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙為特征，其進(jìn)展緩慢，最終因疼痛和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)受損而導(dǎo)致患者活動(dòng)能力喪失[1]。我國(guó)KOA的患病率為25.51%，且隨著人口老齡化加劇和平均預(yù)期壽命延長(zhǎng)，KOA的患病率將進(jìn)一步上升[2]。目前，KOA患者的治療以口服非甾體抗炎藥為主，嚴(yán)重者需要進(jìn)行全關(guān)節(jié)置換術(shù)來(lái)恢復(fù)關(guān)節(jié)功能；然而，藥物只能暫時(shí)緩解癥狀，而手術(shù)是一種危險(xiǎn)且昂貴的選擇，效果有限[3]，加之學(xué)界對(duì)KOA的病因認(rèn)識(shí)有限，因此有必要進(jìn)一步闡明該病的生理病理，并開(kāi)發(fā)新的治療手段。

在細(xì)胞饑餓狀態(tài)下，腺苷一磷酸活化的蛋白質(zhì)激酶（adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK）可通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）來(lái)激活UNC-51樣激酶1（UNC-51-likekinase1，ULK1），從而觸發(fā)軟骨細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞凋亡，參與調(diào)控KOA的疾病進(jìn)展[4]。高良姜素（galangin，GLA）是一種重要的具有天然活性的類黃酮，具有抗炎、抗菌、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗高血壓等生物活性，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）、骨質(zhì)疏松癥等疾病具有較好的療效[5]。相關(guān)研究顯示，GLA可通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕鎘誘導(dǎo)的腎毒性[6]。然而，GLA在KOA中的作用機(jī)制尚不清楚?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)探討GLA調(diào)節(jié)AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路對(duì)KOA大鼠軟骨細(xì)胞自噬和凋亡的影響，以期為KOA的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

TalosF200XS型透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）購(gòu)自北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司；MACSQuant?VYB型流式細(xì)胞儀購(gòu)自德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司；LK-YG96型倒置顯微鏡購(gòu)自天津徠科光學(xué)儀器有限公司；SH-523型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自杭州申花科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

GLA對(duì)照品（批號(hào)ES-1114S，純度≥99%）購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；AMPK抑制劑CompoundC對(duì)照品（批號(hào)orb1909567，純度≥98%）購(gòu)自武漢博歐特生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)G1120-10）購(gòu)自北京祥生興業(yè)科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrixmetalloproteinase13，MMP-13）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為F16182、F15810）購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；自噬檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A486454）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)JC-A80300）購(gòu)自上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒（批號(hào)分別為KL-X126、KL-X122）購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?；兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、磷酸化AMPK（phosphorylatedAMPK，p-AMPK）、AMPK、磷酸化mTOR（phosphorylatedmTOR，p-mTOR）、mTOR、磷酸化ULK1（phosphorylatedULK1，p-ULK1）、ULK1抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)分別為ab181095、ab68206、ab271188、ab137133、ab32028、ab133766、ab177472、ab6721）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為雄性SD大鼠，體重250～300g，購(gòu)于武漢有度生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（鄂）2021-0025。所有大鼠均置于溫度24℃、濕度55%、12h光/暗循環(huán)的環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢有度生物科技有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批件號(hào)2242930）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組與給藥

將56只大鼠采用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，于右后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)側(cè)切口后暴露關(guān)節(jié)腔，之后橫切前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，然后將髕骨復(fù)位，縫合內(nèi)側(cè)囊切口，閉合皮膚。6周后，對(duì)大鼠進(jìn)行X射線檢查，若顯示關(guān)節(jié)面粗糙變形，邊緣有明顯骨贅，內(nèi)側(cè)間隙變窄，軟骨下骨的骨密度明顯增高，則說(shuō)明KOA模型構(gòu)建成功[7]。另選擇10只正常飼養(yǎng)的大鼠打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，但保持半月板完整，作為假手術(shù)組（即Sham組）。

將建模成功的大鼠分為模型組（即KOA組），GLA低、中、高劑量組（即L-GLA、M-GLA、H-GLA組，皮下注射100、200、400μg/kg的GLA[8]，臨用時(shí)以二甲基亞砜溶解），GLA+CompoundC組（皮下注射400μg/kg的GLA+0.2mg/kg的AMPK抑制劑CompoundC[9]），每組10只。各給藥組皮下注射相應(yīng)藥液，Sham組和KOA組大鼠注射等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥21d。

2.2 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度檢測(cè)

于給藥第7、21天時(shí)，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左右膝關(guān)節(jié)直徑，計(jì)算右膝關(guān)節(jié)腫脹度（即右膝關(guān)節(jié)直徑與左膝關(guān)節(jié)直徑的差值）。

2.3 樣品采集

測(cè)量完大鼠左右膝關(guān)節(jié)直徑后，各組大鼠以頸椎脫臼法處死，于眼眶采集全血標(biāo)本，分離血清，保存于－80℃。將右后肢膝關(guān)節(jié)軟骨組織分成兩部分：一部分置于10%多聚甲醛中固定，用于病理學(xué)觀察；另一部分保存于－80℃，備用。

2.4 大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下血清樣品，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，采用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并繪制MMP-13、IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平。

2.5 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)特征觀察

取“2.3”項(xiàng)下固定的膝關(guān)節(jié)軟骨組織適量，用水沖洗30min，在乙二胺四乙酸中室溫脫鈣4～6周，每周更換脫鈣液，然后用水沖洗30min，用不同濃度的乙醇（50%～100%）脫水，再以二甲苯透明，經(jīng)石蠟包埋后制成5μm切片；切片經(jīng)蘇木素染色10min，再以伊紅染色3～5min，然后在顯微鏡下觀察其病理學(xué)特征。

2.6 大鼠軟骨細(xì)胞自噬觀察

取“2.3”項(xiàng)下凍存的膝關(guān)節(jié)軟骨組織適量，修剪為1mm×1mm×1mm大小，在四氧化鋨（1%）中固定3h，經(jīng)脫水、包埋后，切成70nm厚的薄片，再以檸檬酸鉛、醋酸鈾進(jìn)行雙重染色，然后采用TEM觀察，并統(tǒng)計(jì)自噬空泡數(shù)。

2.7 大鼠軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下凍存的膝關(guān)節(jié)軟骨組織適量，用0.25%胰蛋白酶消化10min，加入500μL結(jié)合緩沖液重懸，再加入5μLAnnexinⅤ-FITC試劑和5μL碘化丙啶（PI），室溫下黑暗反應(yīng)15min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡率（凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

2.8 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Westernblot法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下凍存的膝關(guān)節(jié)軟骨組織適量，用RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)上清液中的蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性處理后，取50μg至10%十二烷基硫酸鈉凝膠上，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將分離的樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST在室溫下阻斷1h，加入β-actin（稀釋度為1∶1000）、p-AMPK（稀釋度為1∶2000）、AMPK（稀釋度為1∶1000）、p-mTOR（稀釋度為1∶1000）、mTOR（稀釋度為1∶1000）、p-ULK1（稀釋度為1∶1000）、ULK1（稀釋度為1∶10000）一抗在4℃下孵育過(guò)夜；用TBST洗滌10min，加入二抗（稀釋度為1∶5000）在室溫下孵育1h，使用ECL試劑盒進(jìn)行顯色、成像。使用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行歸一化，以p-AMPK與AMPK、p-mTOR與mTOR、p-ULK1與ULK1的比值表示AMPK、mTOR、ULK1的磷酸化水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 GLA對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響

GLA處理7、21d后，KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度均顯著高于Sham組（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度均顯著低于KOA組，且具有劑量依賴性（P＜0.05）；GLA+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度顯著高于H-GLA組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 GLA對(duì)KOA大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平的影響

KOA組大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平均顯著高于Sham組（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA組大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平均顯著低于KOA組，且具有劑量依賴性（P＜0.05）；GLA+CompoundC組大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平均顯著高于H-GLA組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 GLA對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)的影響

Sham組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列整齊、形態(tài)規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，關(guān)節(jié)軟骨層纖維化嚴(yán)重，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與KOA組相比，L-GLA、MGLA、H-GLA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷得到明顯改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)；與H-GLA組相比，GLA+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷加重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加重。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.4 GLA對(duì)KOA大鼠軟骨細(xì)胞自噬的影響

KOA組大鼠軟骨細(xì)胞自噬空泡數(shù)顯著高于Sham組（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA組大鼠軟骨細(xì)胞自噬空泡數(shù)顯著高于KOA組，且具有劑量依賴性（P＜0.05）；GLA+CompoundC組大鼠軟骨細(xì)胞自噬空泡數(shù)顯著低于H-GLA組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

3.5 GLA對(duì)KOA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響

KOA組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率顯著高于Sham組（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率顯著低于KOA組（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；GLA+CompoundC組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率顯著高于H-GLA組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖3。

3.6 GLA對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)組織中AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均顯著低于Sham組，mTOR蛋白的磷酸化水平顯著高于Sham組（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均顯著高于KOA組，mTOR蛋白的磷酸化水平顯著低于KOA組（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；GLA+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均顯著低于H-GLA組，mTOR蛋白磷酸化水平顯著高于H-GLA組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、表4。

4 討論

OA是全球致殘疾病的主要原因，臨床上膝關(guān)節(jié)是最常見(jiàn)的OA部位[10]。KOA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括機(jī)械負(fù)荷、炎癥、代謝改變、細(xì)胞衰老等，這些因素共同導(dǎo)致滑膜關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)惡化和功能衰竭，其中炎癥反應(yīng)在KOA的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2]。關(guān)節(jié)損傷會(huì)導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥，而高水平的炎癥因子，如MMP-13、IL-1β等，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨退變[11]。自噬是一種重要的細(xì)胞功能，可通過(guò)降解冗余或受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。在KOA的進(jìn)展過(guò)程中，軟骨細(xì)胞的自噬活性存在缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，從而加劇KOA的病理進(jìn)程[12]。因此，探討KOA軟骨細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)的分子機(jī)制，對(duì)尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物至關(guān)重要。本研究構(gòu)建KOA大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠關(guān)節(jié)腫脹、炎癥因子表達(dá)升高，軟骨細(xì)胞自噬空泡數(shù)、凋亡率增加，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂，且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明KOA伴隨著明顯的炎癥反應(yīng)，存在細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出膝關(guān)節(jié)自噬損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，提取自中藥高良姜根部的GLA可以調(diào)控軟骨細(xì)胞，參與OA的進(jìn)展[13]。相關(guān)研究顯示，GLA可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，減弱軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而改善OA進(jìn)展[14]。此外，有研究表明，GLA在體外可抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在體內(nèi)可改善軟骨退行性變化，可作為治療OA的潛在新藥物[15]。GLA還可在體內(nèi)抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，可作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在新藥物[16]。本研究結(jié)果顯示，GLA可促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕軟骨細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)。這提示GLA可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕KOA組織損傷。

研究表明，AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路在自噬和凋亡中具有重要作用：AMPK可直接磷酸化mTOR，導(dǎo)致mTOR活性下調(diào)；還可通過(guò)調(diào)節(jié)ULK1泛素化，促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡[17]。Xiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，基烯醇可以通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路，促進(jìn)急性肺損傷細(xì)胞自噬，減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥和白細(xì)胞浸潤(rùn)。吳偉欣等[19]研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠可通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬，減少軟骨細(xì)胞凋亡，對(duì)KOA具有較好的治療效果。蔡猛等[20]研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元可激活A(yù)MPK/ULK1信號(hào)通路，促進(jìn)OA細(xì)胞自噬，抑制軟骨細(xì)胞焦亡，減輕關(guān)節(jié)軟骨組織損傷。本研究結(jié)果顯示，KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均低于Sham組，mTOR蛋白的磷酸化水平高于Sham組，這提示AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路被抑制，可能是KOA發(fā)生的重要原因。經(jīng)GLA干預(yù)后，AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均高于KOA組，mTOR蛋白的磷酸化水平低于KOA組；進(jìn)一步以AMPK抑制劑CompoundC干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，其可逆轉(zhuǎn)GLA對(duì)AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路的激活作用。這提示，GLA可能通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路，促進(jìn)KOA大鼠軟骨細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，從而改善KOA組織損傷。

綜上所述，GLA可促進(jìn)KOA大鼠軟骨細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路有關(guān)。