維生素K2是一種脂溶性維生素，天然存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是結(jié)構(gòu)相似的一系列物質(zhì)的總稱。其中，七烯甲萘醌（MK-7）是指?jìng)?cè)鏈含有七個(gè)雙鍵的維生素K2類化合物，也是活性最高、功能最強(qiáng)的維生素K2化合物。MK-7在人體內(nèi)參與骨代謝，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的功效，還能誘導(dǎo)肝癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤等癌細(xì)胞凋亡，具有較好的抗癌功效。市場(chǎng)監(jiān)督管理總局于2016年發(fā)布的205號(hào)公告將MK-7收錄于保健食品原料目錄，批準(zhǔn)采用發(fā)酵法生產(chǎn)的MK-7可作為保健食品的維生素K來(lái)源，適用于所有人群，每日允許攝入量為15—100μg。當(dāng)前市售的維生素K2保健食品較多，但食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法體系框架內(nèi)暫時(shí)沒(méi)有保健食品維生素K2的配套方法。市售保健食品中以添加反式結(jié)構(gòu)MK-7為主，本實(shí)驗(yàn)旨在找到一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高精密度、操作簡(jiǎn)單的高效液相色譜法，用于檢測(cè)保健食品中的反式MK-7含量。

1. 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器（FLD）/二極管陣列檢測(cè)器（DAD），U3000，美國(guó)賽默飛世爾；數(shù)控超聲波清洗器，KQ2200DETB，昆山市超聲儀器有限公司；渦旋儀，Vortex-Genie2，美國(guó)Scientific Industries公司；離心機(jī)，SF-TDL-4A，上海菲恰爾；恒溫振蕩箱，THZ-98AB，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；色譜柱：SB-C18色譜柱，250mm*4.6mm，5μm，880975-902，美國(guó)安捷倫；鋅粉還原柱：50mm*4.6mm，LAAA-0002-01，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 材料

七烯甲萘醌，MK-7，含量：99.5%，USP挪威；異丙醇，色譜純，北京迪馬科技；甲醇，色譜純，北京迪馬科技；四氫呋喃，色譜純，北京迪馬科技；冰醋酸，分析純，上海凌峰；無(wú)水乙酸鈉，分析純，上海凌峰；氯化鋅，分析純，上海凌峰；無(wú)水乙醇，分析純，上海凌峰；碳酸鉀，分析純，上海凌峰；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2. 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 七烯甲萘醌（MK-7）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

準(zhǔn)確稱取MK-7標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No：2124-57-4）10mg，用異丙醇溶解并轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，再用異丙醇定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100μg/mL。

2.2 樣品前處理

固體片劑樣品均勻研磨成粉狀，膠囊樣品取內(nèi)容物混合均勻，液體口服液樣品混合均勻。精密稱取1g樣品至10mL棕色容量瓶中（用變性淀粉或糊精包埋過(guò)的樣品先加0.01mol/L鹽酸溶液1.0mL，渦旋混勻后超聲10min破包埋；含油脂的軟膠囊樣品加脂肪酶0.2g，加水2.0mL，渦旋混勻后于37℃恒溫振蕩箱酶解4h以上），加異丙醇約5mL，渦旋混合至樣品分散，超聲提取30min，中間超聲處理10min后，取出手動(dòng)搖勻1次。超聲完成后，取出放至室溫，用異丙醇定容至刻度，搖勻，離心，取上清液過(guò)膜上機(jī)。

2.3 上機(jī)測(cè)試色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250mm*4.6mm，5μm，880975-902），上海安譜生產(chǎn)的鋅粉還原柱（50mm*4.6mm，LAAA-0002-01）。流動(dòng)相配制：甲醇900mL、四氫呋喃100mL、冰醋酸0.3mL、氯化鋅1.5g和無(wú)水乙酸鈉0.5g混合均勻，超聲脫氣30min備用。流動(dòng)相上機(jī)流速為1.0mL/min，等度洗脫。采用FLD檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)（EX）為243nm，發(fā)射波長(zhǎng)（EM）為430nm，色譜柱柱溫為30℃，進(jìn)樣量10為μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取MK-7標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5mL至100mL棕色容量瓶中，用異丙醇溶解并定容至刻度，搖勻，此中間液濃度為0.5μg/mL。分別精密移取0.00、0.50、1.00、2.00、5.00mL中間液至10mL棕色容量瓶中，用異丙醇溶解并定容至刻度，搖勻，取中間液作為曲線最高點(diǎn)。MK-7標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的濃度分別為0.000、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500μg/mL，各取10μL，按照上述色譜條件上機(jī)測(cè)試，記錄色譜圖峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 結(jié)果與分析

3.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

3.1.1 前處理優(yōu)化。原衛(wèi)計(jì)委《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告（2016年第8號(hào)）》附件3方法中的測(cè)試基質(zhì)為維生素K2（發(fā)酵法）油劑產(chǎn)品與粉劑產(chǎn)品，此類基質(zhì)為生產(chǎn)MK-7保健食品的原料。本研究參照原衛(wèi)計(jì)委方法中的樣品前處理方式，采用異丙醇超聲提取30min后過(guò)膜上機(jī)，色譜峰分離度較好，峰形對(duì)稱良好，MK-7測(cè)試值能達(dá)到樣品理論添加量的90%以上，復(fù)現(xiàn)性較好，偏差不超過(guò)10%。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)前處理還參考了GB 5009.290-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K2的測(cè)定》中的提取方式，樣品經(jīng)脂肪酶、淀粉酶在37℃恒溫箱酶解2h以上，加入10mL無(wú)水乙醇及1.0g碳酸鉀，混勻后分2次（每次10mL）加入正己烷20mL，振蕩提取10min，再離心分層，合并正己烷層至100mL旋蒸瓶中，旋蒸至干，用流動(dòng)相復(fù)溶，混勻后過(guò)膜上機(jī)，色譜峰分離度較好，峰形對(duì)稱良好，但MK-7測(cè)試值偏低，不到理論添加量的80%，且復(fù)現(xiàn)性較差，偏差在30%以上。因此，前處理確定采用異丙醇超聲提取的方式，操作簡(jiǎn)單，測(cè)試結(jié)果符合理論預(yù)期，復(fù)現(xiàn)性較好。

3.1.2 高效液相色譜上機(jī)條件優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了原衛(wèi)計(jì)委《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告（2016年第8號(hào)）》附件3、GB 5009.290-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K2的測(cè)定》、GB 5009.158-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測(cè)定》第一法的上機(jī)條件。第一種方法的上機(jī)測(cè)試條件是：采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，流動(dòng)相為純甲醇，流速為1.0mL/min，等度洗脫，DAD檢測(cè)，波長(zhǎng)為254nm，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為20μL。通過(guò)驗(yàn)證，此方法的定量限為10μg/g。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)的各種保健食品中MK-7含量為0.6-360μg/g，因此原衛(wèi)計(jì)委方法中的上機(jī)條件不適用于低含量保健食品的檢測(cè)。維生素K1、維生素K2在國(guó)標(biāo)方法中的上機(jī)測(cè)試條件是：色譜柱、流動(dòng)相、流速、柱溫、進(jìn)樣量參照上述色譜條件，采用FLD檢測(cè)，維生素K1的EX為243nm、EM為430nm，維生素K2的EX為326nm、EM為410nm。兩種方法除了檢測(cè)波長(zhǎng)不一樣，其余色譜條件都一樣。表1統(tǒng)計(jì)對(duì)比了同一濃度的MK-7標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同波長(zhǎng)下檢測(cè)到的色譜峰峰面積，由此可知，在EX為243nm、EM為430nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，MK-7響應(yīng)最好。

3.2 方法線性范圍及定量限

MK-7標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1040879X（R2=0.9999），MK-7在0.00—0.50μg/mL與色譜峰峰面積呈正相關(guān)。稱取1.0g維生素K口服液空白樣品至10mL棕色容量瓶中，共10份，每份添加0.25μg的MK-7，進(jìn)行樣品處理后上機(jī)測(cè)試，計(jì)算樣品中的MK-7含量。計(jì)算10個(gè)空白樣品加標(biāo)含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，分析方法的檢出限（LOD）為3SD對(duì)應(yīng)的待分析物含量，定量限（LOQ）為10SD對(duì)應(yīng)的待分析物含量。結(jié)果顯示，方法檢出限為0.0408μg/g，定量限為0.136μg/g。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試經(jīng)驗(yàn)，大部分保健食品的MK-7含量在0.6—360μg/g，故此方法定量限能夠滿足同類產(chǎn)品的定量測(cè)試需求。

3.3 精密度與耐用性

稱取6份維生素K口服液陽(yáng)性樣品、6份維生素K咀嚼片陽(yáng)性樣品各1.0g至10mL棕色容量瓶中，進(jìn)行樣品處理后，檢測(cè)樣品的MK-7含量，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值，口服液為2.18%，咀嚼片為1.21%，詳見(jiàn)表2。取1號(hào)、2號(hào)口服液樣品溶液進(jìn)行0.9、1.0、1.1mL/min不同流速上機(jī)測(cè)試的耐用性試驗(yàn)，計(jì)算其RSD值為3.85%；取1號(hào)、2號(hào)口服液樣品溶液進(jìn)行28、30、32℃不同柱溫上機(jī)測(cè)試的耐用性試驗(yàn)，計(jì)算其RSD值為3.01%；取1號(hào)口服液樣品溶液進(jìn)行0、8、16、24h不同存放時(shí)間后的上機(jī)測(cè)試耐用性試驗(yàn)，計(jì)算其RSD值為1.24%。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，本分析方法具有良好的精密度與耐用性。

3.4 準(zhǔn)確度

稱取維生素K口服液空白樣品9份各1.0g至10mL棕色容量瓶中，平均分成3組，每組3個(gè)樣品，分別向每組添加0.5、1.0、1.5μg的MK-7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行樣品處理后，檢測(cè)樣品中MK-7加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示，回收率范圍為94.4%—99.6%，RSD值為1.82%，說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確度較好。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確度高、精密度高、耐用性好，能夠滿足絕大部分市售保健食品中七烯甲萘醌含量的檢測(cè)需求。不過(guò)，目前本方法只能檢測(cè)CAS號(hào)為2124-57-4的反式結(jié)構(gòu)MK-7，對(duì)于其異構(gòu)體（CAS：27670-94-6）則會(huì)在目標(biāo)位出現(xiàn)五指峰。用變性淀粉或糊精包埋處理的樣品需要添加鹽酸溶液破包埋，含油量高的樣品則需要用脂肪酶酶解后再進(jìn)行下一步操作。同時(shí)，因?yàn)镸K-7對(duì)光敏感，所以整個(gè)操作過(guò)程必須嚴(yán)格避光。

作者簡(jiǎn)介：張霞（1983—），女，漢族，重慶人，工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称分芯S生素含量的檢測(cè)。