摘要：為篩選出耐鈣脅迫的紫花苜蓿（Medicago sativa）品種，本研究選取14個紫花苜蓿品種作為試驗材料，配制不同Ca2+濃度的霍格蘭營養(yǎng)液模擬鈣生境進(jìn)行種子萌發(fā)試驗，通過測定發(fā)芽指標(biāo)、形態(tài)指標(biāo)、生物量指標(biāo)，基于隸屬函數(shù)法綜合評價紫花苜蓿品種間種子萌發(fā)期的耐鈣性。結(jié)果表明：在0～320 mmol?L-1鈣濃度下，大多數(shù)紫花苜蓿品種的發(fā)芽率、胚芽長等指標(biāo)隨鈣濃度提高先略微上升后呈下降趨勢，且鈣濃度越高下降幅度越大，其中在120 mmol?L-1鈣濃度下各品種間發(fā)芽率產(chǎn)生顯著差異（Plt;0.05），可視為拐點濃度；最適宜的發(fā)芽濃度為0.4～4 mmol?L-1，半致死濃度為120～160 mmol?L-1，致死濃度為160～200 mmol?L-1。通過聚類分析將14個品種的抗鈣能力劃分為5個類群?；陔`屬函數(shù)綜合評價結(jié)果篩選出耐鈣能力最強(qiáng)的品種為‘WL525HQ’，最弱的為‘WL656HQ’。研究結(jié)果表明紫花苜蓿‘WL525HQ’品種在高鈣脅迫下具有較強(qiáng)的耐鈣性和生存能力，建議將該品種作為巖溶區(qū)紫花苜蓿牧草種植推廣的首選品種。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；巖溶；鈣生境；種子萌發(fā)；耐鈣評價

中圖分類號：S541.9 " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A " " " "文章編號：1007-0435（2025）01-0157-13

Effects of Calcium Habitat on Germination and Growth Characteristics of Alfalfa Seeds and Comprehensive Evaluation of Calcium Tolerance

WAN Xiao-mei1，2， HANG Hong-tao1，2*， ZHANG Yun-fei1，2， GUO Guo-ling1，2

（1.School of Karst Science， Guizhou Normal University， Guiyang，Guizhou Province 550001， China； 2.State Engineering Technology Institute for Karst Desertification Control， Guiyang，Guizhou Province 550001， China）

Abstract：In order to screen out Medicago sativa varieties resistant to calcium stress， 14 alfalfa varieties were selected as experimental materials， and Hoagland nutrient solution with different Ca2+ concentrations was configured to simulate calcium habitats for seed germination tests. Germination indexes， morphological indexes and biomass indexes were determined. The calcium tolerance of alfalfa cultivars during seed germination was evaluated using membership function method. The results showed that under 0-320 mmol?L-1 calcium concentration， the germination rate and germ length of most alfalfa varieties first increased slightly with the increase of calcium concentration and then showed a downward trend， and the higher the calcium concentration was， the greater of the decline range was . In the range of 120 mmol?L-1 calcium concentration， there were significant differences in germination rate among varieties （Plt;0.05）， which could be regarded as the inflection point concentration. The optimal germination concentration ranged from 0.4 to 4 mmol?L-1， semi-lethal concentration ranged from 120 to 160 mmol?L-1， and lethal concentration ranged from 160 to 200 mmol?L-1. The calcium resistance of 14 varieties was divided into 5 groups by cluster analysis. Based on the comprehensive evaluation results of membership function， ‘WL525HQ’ variety with the strongest calcium tolerance and ‘WL656HQ’ variety with the weakest were selected. The results showed that alfalfa ‘WL525HQ’ variety had strong calcium tolerance and survival ability under high calcium stress. It suggested that alfalfa ‘WL525HQ’ variety should be the first choice for planting and promoting alfalfa forage in karst area.

Key words：Alfalfa；Karst；Calcium habitat；Seed germination；Calcium tolerance evaluation

鈣是植物生長必須的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，與氮、磷、鉀合稱為“肥料四要素”，具有極其重要的生理功能。植物體內(nèi)的鈣不僅是細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)者，而且作為第二信使在植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著核心作用［1］。Ca2+信號由不同的Ca2+受體組成，其中鈣調(diào)蛋白是特征最明顯的Ca2+傳感器之一［2］，當(dāng)植物感應(yīng)外界環(huán)境脅迫時，參與信號感受和傳遞、響應(yīng)表達(dá)等過程，具有提高植物抵抗環(huán)境脅迫的能力［3］。通常土壤中的鈣含量能滿足植物的正常需求，但由于土壤發(fā)育、元素礦化、施肥不均衡等原因?qū)е碌耐寥棱}元素分布不均，引起地上植被表現(xiàn)出缺鈣或富鈣現(xiàn)象，導(dǎo)致植被生長發(fā)育繁殖等生命過程受到抑制，給農(nóng)林草業(yè)等帶來負(fù)面影響，這在喀斯特地區(qū)表現(xiàn)的更加突出。我國約1/3的陸地面積屬于喀斯特地貌［4］，以西南喀斯特最為典型，主要集中分布在云南、貴州、四川、重慶等地，也是世界喀斯特發(fā)育最典型、最復(fù)雜、分布面積最大的集中連片之一［5］。喀斯特基巖主要以碳酸鹽巖為主，土壤中鈣含量較高，其含量是酸性土壤的3倍以上［6-7］。姬飛騰等［8］對貴州普定、荔波等典型喀斯特土壤檢測發(fā)現(xiàn)，土壤平均交換性鈣含量可達(dá)3.61 g?kg-1（換算90.25 mmol?kg-1），是中國非喀斯特土壤含量的數(shù)倍。此外，曹建華等［4］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，廣西、貴州巖溶地區(qū)的雨水中的鈣含量達(dá)2.9～6 mg?L-1，而非巖溶地區(qū)雨水中鈣離子含量常低于1 mg?L-1［9-11］。倪大偉等［12］研究表明，巖溶濕地沉積物中鈣離子的質(zhì)量濃度高達(dá)8140 mg?kg-1（換算203.5 mmol?kg-1）。環(huán)境中大氣、水、土壤、生物等各個要素相互作用，物質(zhì)循環(huán)與能量轉(zhuǎn)化致使鈣的分布范圍廣、覆蓋面積大，故巖溶區(qū)物質(zhì)循環(huán)系統(tǒng)均富含鈣。由于巖溶地區(qū)碳酸鹽巖具有可溶性，造就該地區(qū)地表和地下二元水文結(jié)構(gòu)，且土壤保水能力差，導(dǎo)致該地區(qū)土壤環(huán)境呈現(xiàn)巖溶干旱、富鈣特征［13］；加之地勢崎嶇陡峭以及人們生存發(fā)展過程中不合理的開發(fā)利用，導(dǎo)致植被退化、土層變薄、基巖裸露出現(xiàn)石漠化現(xiàn)象，加劇生態(tài)脆弱性，并成為限制該地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)恢復(fù)的重要因素［14］。特殊的地質(zhì)環(huán)境和氣候條件決定了適合巖溶區(qū)生長的植物應(yīng)具備耐旱、耐鈣等生長習(xí)性［15］。與其他生長型植物相比，草本植物生長受土壤養(yǎng)分和水分的影響相對較小，耐干旱、喜鈣等草本植物是喀斯特地區(qū)生態(tài)恢復(fù)中群落構(gòu)建的優(yōu)選植物群體。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是全球性廣泛種植的多年生豆科牧草，被譽為“牧草之王”［16］。紫花苜蓿因具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值豐富、適口性好是發(fā)展畜牧養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼料，同時其生長適應(yīng)能力較強(qiáng)，發(fā)達(dá)的根系結(jié)構(gòu)能夠增加土壤孔隙度、改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤儲水量，增加綠植面積，減少水土流失，起到保水保土作用［17］。因此，紫花苜蓿不僅可作為畜牧養(yǎng)殖的高蛋白飼料，也是生態(tài)修復(fù)的重要適生草本植物。目前關(guān)于紫花苜蓿在耐鈣方面做了有相關(guān)研究，如呂朝燕等［18-21］對紫花苜蓿在不同鈣濃度處理下的表型特征進(jìn)行了研究，適宜鈣濃度可以促進(jìn)紫花苜蓿生長，濃度過高能抑制種子發(fā)育，且鈣濃度越高對種子的迫害作用越強(qiáng)。但不同紫花苜蓿品種間耐鈣性會存在顯著差異，因此，篩選出耐富鈣環(huán)境生長的紫花苜蓿草種對巖溶區(qū)發(fā)展畜牧養(yǎng)殖業(yè)和生態(tài)環(huán)境恢復(fù)具有重要意義。在植物生長發(fā)育過程中，種子萌發(fā)期是植物對外界環(huán)境最敏感的物候期，可選擇這一時期進(jìn)行植物耐鈣能力的鑒定、評價與篩選［22］。因此，在萌發(fā)期篩選出耐鈣脅迫的紫花苜蓿品種，對不同鈣生境下因地制宜播種適宜紫花苜蓿品種和提高牧草產(chǎn)量具有重要作用。本研究選取14個紫花苜蓿品種為材料，以霍格蘭營養(yǎng)液作為母液，配制不同濃度的Ca（NO3）2處理液模擬不同鈣生境，在人工氣候箱中培養(yǎng)萌發(fā)，測定發(fā)芽、形態(tài)及生物量指標(biāo)，基于隸屬函數(shù)和聚類分析法鑒定各品種在萌發(fā)期的耐鈣性，篩選出耐鈣能力強(qiáng)的品種，以期為巖溶地區(qū)生態(tài)環(huán)境恢復(fù)和牧草優(yōu)化建植提高草地生產(chǎn)力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料共計14個紫花苜蓿品種，種子材料購于北京正道種業(yè)有限公司，如表1所示。

1.2 試驗設(shè)計

以霍格蘭營養(yǎng)液［23］為培養(yǎng)母液，配制成Ca（NO3）2質(zhì)量體積濃度0.4，1，2，4，40，80，120，160，200，240，280，320 mmol?L-1的處理液，其中0 mmol?L-1作為對照組。選用口徑為90 mm 的培養(yǎng)皿，內(nèi)鋪雙層滅菌的濾紙作發(fā)芽床。選取健康飽滿的種子，用75%酒精消毒10 min，后用蒸餾水反復(fù)沖洗4～5 次并用濾紙吸干表面水分，每個培養(yǎng)皿隨機(jī)選取40粒種子均勻鋪放在發(fā)芽床，置于人工氣候箱（RGX-400PF）培養(yǎng)，每個處理3個重復(fù)。人工氣候箱參數(shù)設(shè)置如下：光照12 h，25℃，濕度70%；黑夜12 h，25℃，濕度75%。連續(xù)培養(yǎng)10 d，按時定量添加相應(yīng)的處理液，以種子胚根突破種皮1 mm以上視為發(fā)芽，每d記錄發(fā)芽數(shù)量，于第10 d收獲芽苗并分析測試相關(guān)指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定

參照《草種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》［24］，于鈣處理后第４d統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)并計算發(fā)芽勢，第10 d統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)并計算發(fā)芽率，每個處理隨機(jī)選取長勢一致的10株種苗，用游標(biāo)卡尺測量胚芽和胚根長（mm），用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分并稱鮮重（FW），置于烘箱中105 ℃殺青30 min，85 ℃下烘干至恒重（DW）。相應(yīng)指標(biāo)公式計算如下所示：

發(fā)芽勢（%）=鈣處理后第4 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100。

發(fā)芽率（%）=鈣處理后第10 d全部正常發(fā)芽的種子粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100。

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt／Dt（式中：Gt為時間在t天的發(fā)芽個數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)）。

活力指數(shù)（VI）=GI×S（式中：GI為發(fā)芽指數(shù)；S為平均胚根長度）。

含水量（%）=（FW-DW）/FW×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析及綜合評價

利用 Microsoft Excel 2010進(jìn)行原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示；使用IBM SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析及聚類分析。

耐鈣閾值：用IBM SPSS 25.0軟件對每個品種及處理的發(fā)芽率和鈣離子濃度（X，mmol?L-1）之間進(jìn)行一元二次曲線回歸分析，且根據(jù)回歸方程求解得出發(fā)芽率為50%時的理論鈣離子濃度X，表示為X50%，公式為：GR＝aX2+bX+c，其中a、b、c為常量。

采用隸屬函數(shù)法［25］，對14個紫花苜蓿品種的耐鈣性進(jìn)行綜合評價，即把每個品種各耐鈣性指標(biāo)的隸屬函數(shù)值（Ｙij）進(jìn)行累加并計算其平均值（Δ），依據(jù)此隸屬平均值對14個品種的耐鈣性進(jìn)行排序，計算方法如下：

（1）若j指標(biāo)與抗鈣性呈正相關(guān)，則Ｙij=（Ｘij-Ｘj min）/（Ｘj max-Ｘj min）

（2）若j指標(biāo)與抗鈣性呈負(fù)相關(guān)，則Ｙij=1-（Ｘij-Ｘj min）/（Ｘj max-Ｘj min）

式中，Ｙij為i品種j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Ｘij為i品種j指標(biāo)的均值；Ｘj max為各品種j指標(biāo)均值的最大值；Ｘj min為各品種j指標(biāo)均值的最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈣水平對紫花苜蓿發(fā)芽的影響

發(fā)芽率是反映種子萌發(fā)期發(fā)芽能力的主要指標(biāo)，由表2可知，14份供試材料的發(fā)芽率隨著鈣水平的提高大多品種呈現(xiàn)先略微上升后下降的趨勢，其中在120 mmol?L-1鈣水平下，有一半以上的品種呈顯著下降趨勢（Plt;0.05）。各品種發(fā)芽率在0～40 mmol?L-1鈣水平下，除‘WL525HQ’‘WL656HQ’品種顯著提高以外，其余12個品種無顯著差異性。在80 mmol?L-1鈣水平下，除了WL656HQ品種顯著提高，及‘WL319HQ’‘WL358HQ’顯著下降（Plt;0.05）以外，其余11個品種無顯著差異性；隨著鈣濃度增加到120 mmol?L-1時，有8個品種的發(fā)芽率呈顯著下降（Plt;0.05）。在160 mmol?L-1鈣水平下，除‘WL525HQ’，以外，其有13個品種相對于對照組均呈現(xiàn)顯著下降（Plt;0.05），但‘WL525HQ’和‘WL712’的發(fā)芽率仍具有90.83%和70%，分別為對照組的97.32%和77.07%，說明‘WL525HQ’和‘WL712’在該鈣水平下的發(fā)芽狀況表現(xiàn)最好，其次為‘WL440HQ’‘WL363HQ’，剩余10個品種發(fā)芽率均在40%以下，其中有4個品種（‘WL319HQ’‘WL343HQ’‘普拉圖’‘30°N’）顯著下降到20%以下，該鈣濃度已接近致死濃度，而‘30°N’顯著下降到10%，已達(dá)到致死濃度。在200 mmol?L-1鈣水平下，所有品種的發(fā)芽率均顯著下降（Plt;0.05），其中兩個品種（‘WL525HQ’‘WL440HQ’）發(fā)芽率保持在20%以上，有9個品種發(fā)芽率均在10%以下，有3個品種（‘WL656HQ’‘WL168HQ’和‘WL358HQ’）未發(fā)芽，說明該濃度水平已達(dá)到致死濃度，對種子萌發(fā)產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。在240 mmol?L-1鈣水平及以上，所有品種均未發(fā)芽，說明該濃度水平已超過種子發(fā)芽的耐受程度。

發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是反映幼苗生長情況和生長量的綜合反映。由表3、表4可知，分析得出發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)與發(fā)芽率變化趨勢相似，其中在0～40 mmol?L-1鈣水平下，略微提升；在80 mmol?L-1鈣水平下開始出現(xiàn)下降趨勢，而在120 mmol?L-1鈣水平下顯著下降（Plt;0.05）?；盍χ笖?shù)與平均根長相關(guān)（表5），與對照組相比，有8個品種在0～4 mmol?L-1鈣水平下活力指數(shù)呈現(xiàn)顯著上升且為最大值，有6個品種（‘WL168HQ’‘WL319HQ’‘WL343HQ’‘WXWL003’‘普拉圖’和‘WL354HQ’）隨鈣濃度增加呈顯著下降趨勢（Plt;0.05）。在40 mmol?L-1鈣水平下各品種均顯著下降（Plt;0.05）。

2.2 不同鈣水平對紫花苜蓿形態(tài)的影響

植物形態(tài)是對生存環(huán)境適應(yīng)情況的直接反映，以此可以判斷植物生長狀況。由表6可知，有7個品種的胚根長在0～4 mmol?L-1鈣濃度范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢，其余7個品種隨著鈣濃度增加表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢。在40 mmol?L-1以上鈣水平下均呈顯著下降趨勢（Plt;0.05）。在120 mmol?L-1鈣水平下，所有品種胚根長極小，但‘WL525HQ’胚根長仍有3.09 mm，相當(dāng)于對照組的7.67%，表現(xiàn)出較強(qiáng)耐鈣能力，而最弱的是‘WL656HQ’，在該濃度水平下僅發(fā)芽但無明顯胚根長。

在供試的14份紫花苜蓿中，有13個品種胚芽長總體上隨鈣濃度增加先上升后呈下降趨勢（表7），有1個品種（‘WL363HQ’）品種隨鈣濃度增加呈下降趨勢。在0～4 mmol?L-1鈣水平下，所有品種的胚芽長出現(xiàn)最大值。在40 mmol?L-1鈣水平下，有11個品種呈顯著下降趨勢（Plt;0.05），其中下降幅度最大的是‘WL363HQ’品種，降幅為10.43 mm，相當(dāng)于對照的44.96%。在80 mmol?L-1鈣水平以上，所有品種均呈現(xiàn)顯著下降趨勢（Plt;0.05），且鈣水平越高下降幅度越大。

2.3 不同鈣水平對紫花苜蓿生物量的影響

生物量是衡量植物生長情況的重要指標(biāo)之一，是反映植物有機(jī)物質(zhì)積累的體現(xiàn)。由表8可知，從整體上看，所有品種的鮮重隨鈣水平的增加略微上升后呈顯著下降（Plt;0.05）。其中在0～2 mmol?L-1鈣水平下，一半以上品種的鮮重有上升趨勢，鮮重最大值在0～4 mmol?L-1鈣水平區(qū)間。在40 mmol?L-1水平下，有一半品種顯著下降（Plt;0.05）。在80 mmol?L-1鈣水平下，除‘WL298HQ’以外，其余13個品種均呈現(xiàn)顯著下降，其中降幅最大的是‘WL168HQ’品種，降幅為0.063，相當(dāng)于對照的40.57%。隨著鈣水平增加到120 mmol?L-1時，所有品種鮮重均呈顯著下降，其中降幅最大的是‘WL656HQ’，降幅為0.091，相當(dāng)于對照的22.22%，其次是‘30°N’，降幅為0.088，相當(dāng)于對照的20.72%。在160 mmol?L-1鈣水平下，所有品種的鮮重均在0.035 g以下。在200 mmol?L-1鈣水平下，僅有3個品種（‘WL525HQ’‘WL363HQ’和‘WL440HQ’）發(fā)芽，但數(shù)量極少，鮮重均在0.25 g以下，說明該濃度下已嚴(yán)重制約種子發(fā)芽和生物量的積累。由表9可知，在0.4～80 mmol?L-1鈣水平下，所有品種中除‘WL363HQ’的干重呈下降趨勢以外，其余均先上升后下降。在120 mmol?L-1鈣水平及以上，所有品種干重呈顯著下降（Plt;0.05）。

2.4 不同鈣水平下種子萌發(fā)期各項指標(biāo)的相關(guān)性

由表10可知，14份紫花苜蓿品種間各項發(fā)芽指標(biāo)之間存在不同程度的相關(guān)性。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長、胚根長、鮮重、干重和含水量之間呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），與鈣水平呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）。

2.5 耐鈣閾值計算

以鈣濃度（x）作為變量，發(fā)芽率（y）作為因變量建立回歸方程，求得鈣處理后10ｄ時的鈣濃度相對于發(fā)芽率的一元二次回歸（y=ax2+bx+c），以發(fā)芽率下降50%作為不同紫花苜蓿品種存活臨界鈣離子濃度，得出不同品種具有50%存活臨界鈣離子濃度，即為表11中X50%。發(fā)芽率下降到對照組一半以下對應(yīng)的響應(yīng)濃度中，不同品種響應(yīng)濃度存在差異，數(shù)值越低表明耐鈣能力越差，數(shù)值越高則耐鈣能力越強(qiáng)。由表11可知，所有品種的回歸曲線擬合效果很好（R2≥0.89，Plt;0.01），通過此回歸方程模型可較好的預(yù)測各品種發(fā)芽率降低到對照組一半時的理論鈣離子濃度。結(jié)果表明在110～130 mmol?L-1鈣水平下有5個品種，在130～170 mmol?L-1鈣水平下有7個品種，在170～200 mmol?L-1鈣水平下有1個品種，在200 mmol?L-1鈣水平以上有1個。其中響應(yīng)濃度最高的前兩個品種為‘WL525HQ’和‘WL440HQ’，X50%（mmol?L-1）分別為213.68和176.92，并且這兩個品種能在160 mmol?L-1高鈣環(huán)境下仍保持較高的發(fā)芽率（90.83%，41.67%），具有較強(qiáng)的耐高鈣能力。

2.6 不同紫花苜蓿品種隸屬值及排序

隸屬值函數(shù)法可以消除評價指標(biāo)間的量綱差異，是綜合評價分析中常用的方法，可以有效反映植物受某種因子影響的表現(xiàn)程度。隸屬值越大，說明植物受該因子影響越小，抵抗因子影響能力越強(qiáng)［26］。以14個紫花苜蓿品種各項指標(biāo)測定值為依據(jù)，通過隸屬函數(shù)法，綜合比較14個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的抗鈣能力差異。隸屬值反映了不同品種的表現(xiàn)受鈣水平影響的程度，值越大，耐鈣能力越強(qiáng)。由表12結(jié)果表明，‘WL525HQ’各項指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值最大，為0.76，其次是‘WL440HQ’，隸屬函數(shù)平均值為0.68，而‘WL656HQ’和‘WXML003’各測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值最小，分別為0.29和0.32，表明‘WL525HQ’品種的耐鈣性最強(qiáng)，其次是‘WL440HQ’，而‘WL656HQ’品種的耐鈣性最弱，其次是‘WXWL003’。

2.7 不同紫花苜蓿品種間抗鈣性聚類分析

聚類分析廣泛應(yīng)用于植物生長的抗逆性研究。本研究以14份紫花苜蓿品種隸屬值作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，將14個紫花苜蓿品種劃分成五個抗鈣等級類群（圖1）。第一類：抗鈣能力最弱的有1個紫花苜蓿品種，‘WL656HQ’；第二類：抗鈣能力較弱的紫花苜蓿品種3個，分別為‘WXWL003’‘30°N’和‘普拉圖’；第三類：抗鈣能力中等的紫花苜蓿品種7個，分別為‘WL363HQ’‘WL358HQ’‘WL354HQ’‘WL343HQ’‘WL 319HQ’‘WL168HQ’和‘WL298HQ’；第四類：抗鈣能力較強(qiáng)的有2個紫花苜蓿品種，‘WL440HQ’和‘WL712’；第五類：抗鈣能力最強(qiáng)的紫花苜蓿品種1個，為‘WL525HQ’。

3 討論

鈣植物體所是必需的礦質(zhì)元素，對植物生長發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用，其含量的高低影響到植物的種子發(fā)芽率和成苗率。植物種子在萌發(fā)過程中遭受高鈣脅迫，往往會造就種子細(xì)胞內(nèi)外存在水勢差異，導(dǎo)致種子失水和水分利用困難，對植物生長有顯著抑制作用，濃度越高對植物迫害作用越大。本研究供試的14種紫花苜蓿種子在不同鈣水平的處理液培養(yǎng)10 d后，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整體上紫花苜蓿發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨著鈣濃度增加呈現(xiàn)不同變化趨勢。在鈣濃度為0.4～4 mmol?L-1條件下，種子各項萌發(fā)指標(biāo)生長表現(xiàn)較好；但隨著鈣濃度的增加，各項萌發(fā)指標(biāo)隨之出現(xiàn)下降趨勢，尤其在120 mmol?L-1鈣水平下降表現(xiàn)最為明顯（Plt;0.05），在鈣濃度達(dá)到240 mmol?L-1時，所有的紫花苜蓿種子均未發(fā)芽，說明該鈣濃度已超出種子耐鈣忍受范圍。這些結(jié)果表明在低濃度鈣水平下能促進(jìn)紫花苜蓿種子萌發(fā)，而在高濃度鈣水平種子萌發(fā)受到抑制甚至產(chǎn)生毒害作用，這與賈慧慧等［27］、孫杭［28］在鈣脅迫對植物萌發(fā)生長的影響，隨鈣脅迫濃度增加顯著降低的研究結(jié)果較為一致。

過高水平的鈣誘導(dǎo)往往會降低植株的生長速度，致使葉片面積的減小進(jìn)而影響到植株的光合能力，直觀表現(xiàn)為植物株高和生物量的降低［29］。當(dāng)植物遭受鈣脅迫時，往往會通過一系列調(diào)控機(jī)制來應(yīng)對，如植物具有通過富集鈣離子的方式來抵抗鈣離子脅迫的機(jī)制，一方面，植物細(xì)胞可將胞液中的鈣離子運輸?shù)揭号?、?nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體和細(xì)胞壁，并通過Ca2+/H+逆向運轉(zhuǎn)蛋白和Ca2+-ATPases將鈣離子儲存起來［30］；另一方面，植物通過抑制子葉生長，減小單株葉片面積等措施來保持細(xì)胞內(nèi)的水分，保證植株的正常生理功能，一旦超過了自我調(diào)節(jié)的閾值，植株最終表現(xiàn)為失水現(xiàn)象，其生長受到抑制［31-32］。本研究結(jié)果表明，在低鈣濃度下植株能正常生長，較高的鈣濃度所有紫花苜蓿的胚芽長、胚根長、鮮重、干重均呈降低趨勢，尤其在高鈣水平下顯著降低（Plt;0.05）。隨著鈣濃度的增加，紫花苜蓿的葉片隨之減小，且鈣濃度越高種苗葉片減小的越明顯，同時其胚芽長、胚根長的生長受抑制影響更顯著，這些結(jié)果與茶曉飛等［33-35］的研究結(jié)果具有一致性。除此之外，紫花苜蓿胚根長相比胚芽長受到鈣脅迫的影響更大，總體上看胚根長隨鈣濃度的增加下降的幅度大于胚芽長，這與宮文龍［22］、崔雪雯［25］的研究結(jié)果一致。生物量是衡量植物生長好壞的標(biāo)準(zhǔn)之一，紫花苜蓿萌發(fā)期個體生長較小，生物量以整株計算，研究結(jié)果表明所有紫花苜蓿的生物量在較高鈣濃度下均呈下降趨勢，與彭博等［36］的研究結(jié)果一致。

本研究以發(fā)芽率作為評估紫花苜蓿各品種間耐鈣水平的主要指標(biāo)，結(jié)果表明供試的14個紫花苜蓿品種中，發(fā)芽最適宜的鈣濃度范圍在0.4～4 mmol?L-1；在40 mmol?L-1鈣濃度下種苗表現(xiàn)出形態(tài)指標(biāo)和生物量呈現(xiàn)降低趨勢；當(dāng)鈣濃度水平達(dá)到120 mmol?L-1時發(fā)芽率已經(jīng)產(chǎn)生顯著的差異性，植株的抗逆性逐漸下降，從而推測該鈣濃度是紫花苜蓿自我調(diào)節(jié)的閾值。因此，紫花苜蓿對鈣脅迫表現(xiàn)出抗逆性并能生存生長的鈣濃度范圍為40～120 mmol?L-1；隨著鈣濃度增加，各項萌發(fā)指標(biāo)差異性更大。在160 mmol?L-1鈣水平以下，所有紫花苜蓿品種均能發(fā)芽，當(dāng)鈣水平達(dá)到200 mmol?L-1時，除‘WL656HQ’‘WL168HQ’和‘WL358HQ’這3個品種未能發(fā)芽外，其余11個品種仍能發(fā)芽，其中有7個品種發(fā)芽率均低于10%；當(dāng)鈣濃度達(dá)到240 mmol?L-1水平下，所有品種均不能正常發(fā)芽。因此，推測240 mmol?L-1鈣水平是所有供試紫花苜蓿種子萌發(fā)致死濃度。通過耐鈣閾值計算得出，所有供試紫花苜蓿品種發(fā)芽率降低到對照組一半時的理論鈣離子濃度范圍（X50%）在111.45～213.68 mmol?L-1，變幅102.23，平均值162.57，且品種間的X50%差異變化大，均顯著高于典型喀斯特地區(qū)土壤交換性鈣含量3.61g?kg-1（換算90.25 mmol?kg-1）。以鈣離子作為影響因子來看，表明供試紫花苜蓿品種萌發(fā)率（50%以上）理論上均能在巖溶地區(qū)推廣使用（X50%≥90.25 mmol?kg-1），但巖溶地區(qū)土壤生境異質(zhì)性高和發(fā)展畜牧養(yǎng)殖業(yè)牧草產(chǎn)量的角度出發(fā)，更要兼顧出苗率和生物量。

本研究通過隸屬函數(shù)法綜合評價篩選出耐鈣能力最強(qiáng)的紫花苜蓿品種‘WL525HQ’和最弱品種‘WL656HQ’。兩者在發(fā)芽情況、形態(tài)、生物量積累等都存在較大差異（Plt;0.05）。由兩組各項指標(biāo)數(shù)據(jù)對比可知，‘WL525HQ’品種相對‘WL656HQ’品種在種子萌發(fā)期對鈣濃度的適應(yīng)范圍更高，達(dá)到200 mmol?L-1，且X50%為213.68 mmol?L-1；而‘WL656HQ’發(fā)芽最高耐鈣濃度在160 mmol?L-1，且X50%為128.68 mmol?L-1，兩者X50%相差85個單位。就發(fā)芽率而言，在產(chǎn)生顯著差異的120 mmol?L-1鈣濃度水平下，‘WL525HQ’品種發(fā)芽率仍保持96.67%，而‘WL656HQ’品種發(fā)芽率僅48.33%，前者是‘WL656HQ’發(fā)芽率的2倍。鮮重和干重主要受胚芽長和胚根長的影響，‘WL525HQ’品種數(shù)值均高于‘WL656HQ’品種。植物應(yīng)對環(huán)境脅迫時不僅在形態(tài)上發(fā)生變化，植株體內(nèi)部也會通過調(diào)節(jié)光合作用、積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、提高超氧化物歧化酶和過氧化物酶等抗氧化酶系統(tǒng)、激素調(diào)控、基因表達(dá)等一系列調(diào)控來響應(yīng)環(huán)境脅迫并以此來降低環(huán)境脅迫對植物造成的迫害?！甒L525HQ’和‘WL656HQ’盡管品種間在發(fā)芽率、胚根和胚芽長、生物量等表現(xiàn)出顯著差異（Plt;0.05），但其響應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以明確兩者間萌發(fā)差異的作用機(jī)理為選育耐鈣紫花苜蓿品種提供科學(xué)依據(jù)。本研究僅從種子萌發(fā)期來探討供試的14份紫花苜蓿品種在不同鈣水平下的萌發(fā)特性差異，考慮到不同植物、不同品種在不同鈣生境下表現(xiàn)出不同的耐鈣能力和適應(yīng)策略，這將為后期研究不同品種不同生長發(fā)育階段下耐鈣機(jī)理和調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

低鈣水平可促使種子發(fā)芽生長，高鈣水平抑制種子萌發(fā)甚至毒害。在0.4～4 mmol?L-1鈣水平下最適宜萌發(fā)生長；在40 mmol?L-1鈣水平下開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象；在120 mmol?L-1鈣水平下各品種間發(fā)芽率產(chǎn)生顯著差異，可視作為的拐點濃度；在120～160 mmol?L-1鈣水平下，大多數(shù)品種發(fā)芽率顯著低于對照一半以上且植株極小，可視作種子萌發(fā)半致死濃度；在160～200 mmol?L-1鈣水平下發(fā)芽數(shù)量極少，且鈣濃度超過200 mmol?L-1以上，種子未能正常發(fā)芽，可視作種子萌發(fā)致死濃度。根據(jù)一元二次回歸方程擬合耐鈣閾值得出，所有供試紫花苜蓿品種發(fā)芽率降低到對照組一半時的理論鈣離子濃度范圍（X50%）在111.45～213.68 mmol?L-1，變幅102.23，平均值162.57，且品種間的X50%差異變化大，均顯著高于典型喀斯特地區(qū)土壤交換性鈣含量3.61g?kg-1（換算90.25 mmol?kg-1）。通過對各項生長指標(biāo)進(jìn)行聚類分析得出5個耐鈣敏感等級；隸屬函數(shù)權(quán)值綜合評價分析得出，‘WL525HQ’為耐鈣品種，‘WL656HQ’為鈣敏感品種。研究結(jié)果表明紫花苜蓿‘WL525HQ’品種在高鈣脅迫下具有較強(qiáng)的耐鈣性和生存能力，建議將該品種作為巖溶區(qū)紫花苜蓿牧草種植推廣的首選品種。

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