摘 要 ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）在種子油脂積累和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但是目前亞麻ACL（LuACL）在這些過程中的功能尚不明確。以‘隴亞10號’為材料克隆 "LuACL-1全長編碼序列并轉(zhuǎn)化擬南芥，分析其在種子油脂積累和非生物脅迫響應(yīng)中的功能。結(jié)果表明，在擬南芥野生型背景下異源表達(dá) "LuACL-1使種子變大，種子質(zhì)量增加，同時通過正調(diào)控與油脂合成相關(guān)基因 "AtPKp-α、 "AtKASⅢ、 "AtFAE1和 "AtGPAT1的表達(dá)促進(jìn)種子油脂積累。此外，在NaCl和甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)率顯著高于野生型，其 "AtNCED3、 "AtEM1和 "AtEM6的表達(dá)量均顯著低于野生型；同時，超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性顯著升高，過氧化氫、超氧陰離子和丙二醛含量降低。綜上所述， "LuACL-1不僅可以通過上調(diào)油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)種子油脂積累，還可以通過提高活性氧清除能力、減輕細(xì)胞膜損傷，調(diào)控ABA合成和信號響應(yīng)基因的表達(dá)增強擬南芥對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受能力。

關(guān)鍵詞 亞麻；ATP-檸檬酸裂解酶；脂肪酸；NaCl脅迫；甘露醇脅迫

亞麻（Linum usitatissimum L.）是中國的主要經(jīng)濟作物之一。油用亞麻又稱為胡麻，廣泛種植于中國西北、華北等旱作農(nóng)業(yè)區(qū)^[1]。亞麻籽含油量在37%～49%，主要由軟脂酸（Palmitic acid，PA，約為6%）、硬脂酸（Stearic" acid，SA，約為 2.5%）、油酸（Oleic acid，OA，約為19%）、亞油酸（Linoleic acid，LA，約為13%）和α-亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA，約為55%）組成，是 α-亞麻酸含量最高的油料作物^[2]。α-亞麻酸為人體必需的脂肪酸，具有降血脂、血壓、膽固醇，預(yù)防心腦血管疾病等功效^[3]。由于其豐富的營養(yǎng)功效，亞麻已經(jīng)成為醫(yī)療和食品等領(lǐng)域的關(guān)注焦點。近年來，中國亞麻種植面積、產(chǎn)量有所提高，但是中國亞麻籽仍依賴進(jìn)口。因此，為滿足中國對亞麻籽的需求，如何擴大亞麻種植面積、提高亞麻單產(chǎn)水平以及亞麻籽油產(chǎn)量應(yīng)為當(dāng)前研究重點。

植物油脂合成涉及多種酶催化反應(yīng)途徑，是由遺傳、生化和轉(zhuǎn)錄共同控制的復(fù)雜過程。油脂合成的第一步是乙酰輔酶A作為前體物質(zhì)，經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶催化形成丙二酰輔酶A，該步驟是脂肪酸合成途徑的第一個限速步驟^[4]。因此，油脂合成過程中，乙酰輔酶A的供應(yīng)量是脂肪酸合成過程的重要影響因素。不論來自糖還是脂肪分解，乙酰輔酶A都是在線粒體中形成的，而乙酰輔酶A作為前體物質(zhì)合成脂肪酸需要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。乙酰輔酶A不能透過線粒體膜，要與草酰乙酸合成檸檬酸，再通過檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。之后檸檬酸在ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）作用下產(chǎn)生乙酰輔酶A，可用于脂肪酸合成、碳鏈延伸等，ACL是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶^[5]。在植物中，直至2002年才從羽扇豆中克隆出ACL基因^[6]。研究表明，植物ACL是異源四聚體酶，由不同的基因編碼形成的2個亞基組成^[7]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtACLA由 "AtACLA-1、 "AtACLA-2和 "AtACLA-3基因編碼，且都位于第1染色體上；AtACLB則由 "AtACLB-1和 "AtACLB-2基因編碼，前者位于第3而后者位于第5染色體上；擬南芥AtACL定位在細(xì)胞質(zhì)中，是一種A₄B₄結(jié)構(gòu)的異源八聚體蛋白^[8]。研究表明，ACL參與油脂代謝、植物抗逆性、程序性死亡與有性生殖調(diào)節(jié)等過程^[9]。在擬南芥中反義抑制 "AtACLA-1，植株出現(xiàn)器官微型化、細(xì)胞體積縮小、質(zhì)體畸形等表型，并且種子脂肪酸含量降低^[10]。在擬南芥中異源反義表達(dá)油菜ACLA亞基基因，除了造成植株矮化、葉片變小、果莢縮短等表型變化以外，種子和葉片脂肪酸含量也降低^[11]。在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)ACL可增加種子含油量^[12]。比較不同油棕中ACL的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)油棕的ACL表達(dá)水平顯著高于低產(chǎn)油棕^[13]。此外，在植物體內(nèi)脂肪酸及其衍生物不僅是重要能源貯藏物質(zhì)的主要組成成分，也被認(rèn)為是細(xì)胞膜、信號分子和激素分子的重要組成成分，參與種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成，并廣泛參與調(diào)控植物體基礎(chǔ)免疫、效應(yīng)子誘導(dǎo)抗性及系統(tǒng)抗性等多種防御途徑，從而提高植物對脅迫的抗性保護植物免受生物或者非生物脅迫影響^[14]。許多研究表明ACL對提高油料作物產(chǎn)油量和抗逆性具有重要作用，但目前亞麻ACL的功能尚不清楚。因此，本研究以亞麻品種‘隴亞10號’為試驗材料，克隆獲得一個亞麻ACL基因的全長編碼序列（Coding domain sequence，CDS）并在擬南芥中初步分析其在種子油脂積累和逆境脅迫過程中的調(diào)控作用，為提高油料作物產(chǎn)油量、增強作物抗逆性，從而可為中國旱區(qū)作物提高作物產(chǎn)量提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

本研究植物材料包括擬南芥哥倫比亞野生型（Col-0）、通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得的T₃代轉(zhuǎn)基因株系 （ Col-0 35S：LuACL-1-6HA#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7）、亞麻品種‘隴亞10號’。所有植物材料均種植于培養(yǎng)室，植物生長的溫度設(shè)置為 22 ℃，光照強度為160 μmol·m^-2·s^-1，每天光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h。

1.2 蛋白序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用擬南芥數(shù)據(jù)庫Tair網(wǎng)站獲得擬南芥AtACLA-1、AtACLA-2、AtACLA-3的蛋白質(zhì)序列，通過Phytozome網(wǎng)站中的Protein Blast將上述3個序列進(jìn)行比對得到亞麻中同源序列。

使用MUSCLE程序（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）對這些序列進(jìn)行多序列比對。

1.3 RNA提取與cDNA第一鏈合成

使用SteadyPure植物RNA提取試劑盒（Accurate Biotechnology，Code：AG21019）提取亞麻各組織、擬南芥葉片與開花后第10、12和14天發(fā)育種子的總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000測定總RNA的濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen，Code：AE311-02）合成cDNA，儲存于 -20 ℃供后續(xù)試驗使用。

1.4 基因克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取 "LuACL-1的無終止密碼子的全長編碼序列，利用NCBI中的Primer-BLAST程序設(shè)計特異性引物。以‘隴亞10號’幼嫩葉片cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶（TaKaRa，Code：R045Q）通過PCR技術(shù)擴增獲得目的基因。PCR反應(yīng)程序如下：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。切膠，使用通用型DNA純化回收試劑盒（TIANGEN，Code：DP214）進(jìn)行純化回收。利用限制性內(nèi)切酶XmaⅠ對純化后的目的片段以及載體pGreen-6 hemagglutinin進(jìn)行酶切處理，使用重組酶（Vazyme，Code：C112-01）將酶切后的目的片段與載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，隨機篩選5個陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。這5個陽性克隆間的測序結(jié)果完全一致，并與目標(biāo)序列完全一致，表明從‘隴亞10號’中成功獲得 "LuACL-1基因的CDS序列，并成功構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體35S：LuACL-1-6HA。

1.5 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的篩選與鑒定

將35S：LuACL-1-6HA載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Agrobacterium tumefaciens GV3101），隨后在LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL^-1硫酸卡那霉素和25 μg·mL^-1利發(fā)霉素）上隨機挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。使用農(nóng)桿菌花序侵染法^[15]轉(zhuǎn)染擬南芥野生型，并將收獲的種子均勻撒在營養(yǎng)土上，待長出2片真葉后，連續(xù)噴施草銨膦除草劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的Basta），至篩選出仍能繼續(xù)生長的抗性苗并將其移至新的營養(yǎng)土上，單株進(jìn)行DNA和RNA水平鑒定。確定是否成功轉(zhuǎn)入目的基因，選擇鑒定正確且轉(zhuǎn)錄水平高的株系為T₁代，繼續(xù)培養(yǎng)至成熟，單株收獲種子，用于后續(xù)試驗。將轉(zhuǎn)基因株系T₂代種子播于MS培養(yǎng)基[含10 μg·mL^-1草銨膦（Glufosinate-ammonium）]上繼續(xù)篩選培養(yǎng)，最終得到純合T₃代種子，供后續(xù)試驗使用。

1.6 種子表型分析與脂肪酸含量測定

隨機選取野生型和T₃代純合體種子，用體視顯微鏡（Olympus SZ 61，日本）觀察種子大小、顏色并拍照。用電子天平（BSA124S-CW，中國）測定種子質(zhì)量。依據(jù)先前報道方法^[16]測定種子的脂肪酸含量。利用氣相色譜儀（島津GC-2010 plus，日本）分析種子脂肪酸含量，Supelco wax-10色譜柱（30 m （length）×0.25 mm （inner diameter）×0.5" μm （liquid membrane thickness）），起始溫度為160 ℃，保持1 min，隨后以 4 ℃·min^-1的速率升溫至240 ℃，保持16 min。使用面積歸積法計算各脂肪酸含量，種子含油量為各脂肪酸含量的總和。

1.7 鹽及滲透脅迫下擬南芥種子萌發(fā)率分析

將清洗干凈的100粒T₃代純合種子分別鋪在含有150 mmol·L^-1" NaCl、300" mmol·L^-1甘露醇和1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃黑暗條件同步化培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)并每天對種子萌發(fā)情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計各個條件下的種子發(fā)芽率（以胚根突破種皮2 mm定義為種子萌發(fā)），該試驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.8 O-2、H₂O₂、MDA、SOD、POD的測定

測定O-2含量試劑盒購于武漢塞維爾生物科技有限公司，根據(jù)植物超氧陰離子染色液法（Nitroblue tetrazolium，NBT）對植株中的O-2染色。

過氧化氫（H₂O₂）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）測定方法參考所使用試劑盒說明書進(jìn)行。使用超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（Solarbi，Beijing，China）測定SOD活性，單位為U·g^-1。使用過氧化物酶（POD）活性檢測試劑盒（Solarbio，Beijing，China）[JP2]測定POD活性，單位為U·g^-1。使用丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（Solarbio，Beijing，China）測定MDA含量，單位為nmol·g^-1。使用過氧化氫（H₂O₂）含量檢測試劑盒（Solarbio，Beijing，China）測定H₂O₂含量，單位為μmol·g^-1。

1.9 基因表達(dá)分析

利用實時熒光定量RT-qPCR技術(shù)檢測基因相對表達(dá)水平。參照SYBR" Premix" Ex" Taq^TMⅡ試劑盒（TaKaRa，Code：DRR 820A）說明書配置反應(yīng)體系并在ABI QuantStudio^TM" 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國）上設(shè)置反應(yīng)程序，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸 5 min；12 ℃保存。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)，以擬南芥和亞麻管家基因 "AtEF1αA4和LuActin作為內(nèi)參基因，使用 -2^△△Ct法^[17]對各個基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻LuACL-1序列分析

利用擬南芥數(shù)據(jù)庫Tair網(wǎng)站獲得擬南芥AtACLA-1、AtACLA-2、AtACLA-3的蛋白質(zhì)序列，通過Phytozome網(wǎng)站中的Protein Blast將上述3個序列進(jìn)行比對得到亞麻中兩個同源率最高的同源基因，分別命名為 "LuACL-1（Lus10013032）和 "LuACL-2（Lus10030897）。蛋白多序列比對結(jié)果表明LuACL-1與擬南芥AtACLA-1、AtACLA-2、AtACLA-3" 3個亞基蛋白具有更高的氨基酸序列同源率，分別為85%、85%和83%（圖1）。因此，亞麻LuACL-1與擬南芥AtACLA可能具有類似的生物學(xué)功能。

2.2 亞麻LuACL-1的表達(dá)模式分析

為了初步了解 "LuACL-1基因的功能，用RT-qPCR分析 "LuACL-1在亞麻品種‘隴亞10號’中不同組織的時空表達(dá)模式。如圖2所示，該基因在亞麻的各個營養(yǎng)器官（根、莖、葉和花）以及發(fā)育中的種子均有表達(dá)。

2.3 亞麻LuACL-1基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的篩選與鑒定

為了探究亞麻 "LuACL-1在種子油脂積累及響應(yīng)非生物脅迫過程中的功能，將植物過表達(dá)載體35S：LuACL-1-6HA轉(zhuǎn)入野生型擬南芥（Col-0）中（圖3-A）。通過草銨膦除草劑篩選獲得了10株T₁代擬南芥轉(zhuǎn)基因株系，隨后利用特異性引物對 "LuACL-1的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)一步PCR鑒定，最終本試驗獲得7個獨立的T₃代純合 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA轉(zhuǎn)基因株系（圖3-B）。同時利用RT-qPCR技術(shù)檢測每個轉(zhuǎn)基因株系中 "LuACL-1的表達(dá)量，根據(jù)表達(dá)量從中選取 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA #1、 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA#2、 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA #3和 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA #4四個表達(dá)量較高的株系用于后續(xù)試驗（圖3-C）。

2.4 亞麻LuACL-1基因參與調(diào)控擬南芥種子油脂積累過程

2.4.1 亞麻LuACL-1促進(jìn)擬南芥種子油脂積累 [HT]許多研究表明，ACL對種子油脂積累有重要作用。為了明晰 "LuACL-1對種子油脂的積累，利用色譜測定并分析了野生型Col-0和T₃代純合轉(zhuǎn)基因株系 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA成熟種子的總脂肪酸含量和各組分脂肪酸含量，結(jié)果表明，過表達(dá) "LuACL-1基因能顯著提高種子總脂肪酸含量而各組分所占的比例（摩爾百分比）沒有發(fā)生顯著變化（圖4-D、4-E）。此外，與野生型相比，T₃代純合轉(zhuǎn)基因株系種子大小、質(zhì)量增加，顏色無明顯差異（圖4-A、4-B、4-C）。以上結(jié)果說明 "LuACL-1促進(jìn)擬南芥種子脂肪酸積累。

2.4.2 亞麻LuACL-1促進(jìn)擬南芥種子油脂合成相關(guān)基因的表達(dá) [HT]根據(jù)轉(zhuǎn)基因株系總脂肪酸含量檢測結(jié)果，本研究選取 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA #1和 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA #4轉(zhuǎn)基因株系深入探究亞麻 "LuACL-1影響種子油脂積累的分子機制。本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測授粉后10、12、14 d種子中油脂合成積累相關(guān)基因 "AtPKp-α（Plastidial PK）、 "AtFAE1（Fatty acid elongase1）、AtBCCP1（Biotin carboxyl carrier protein1）、 "AtKASⅢ（β-ketoacyl-acyl carrier protein Ⅲ）、AtKASⅠ（β-ketoacyl-acyl carrier proteinⅠ）、 "AtFAD2（Fatty acid desaturase2）、 "AtFAD3（Fatty acid desaturase 3）、 "AtGPAT1（Glycerol-3-phosphate acyltransferase1）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在授粉10、12、 14 d，轉(zhuǎn)基因株系中 "AtPKp-α、 "AtKASⅢ、 "AtFAE1和 "AtGPAT1基因的表達(dá)水平顯著高于野生型（圖5）。 "AtPKp-α合成丙酮酸和ATP，可為質(zhì)體脂肪酸合成提供底物^[18]； "AtKASⅢ催化乙酰輔酶A與丙二酰ACP生成3-丁酮酰-ACP從而啟動種子中脂肪酸從頭合成的碳鏈延伸循環(huán)^[19]； "AtFAE1促進(jìn)超長脂肪酸鏈的合成^[20]； "AtGPAT1將質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的各種?；鵆oA與甘油-3-磷酸（G3P）作為反應(yīng)底物，在G3P的sn-1位置上，酯化產(chǎn)生溶血磷脂酸，促進(jìn)三酰甘油的產(chǎn)生^[21]。以上4個基因的表達(dá)水平顯著提高說明亞麻通過 "LuACL-1上調(diào)種子油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控種子油脂積累。

2.5 亞麻LuACL-1在不同非生物脅迫下對種子萌發(fā)的影響

2.5.1 亞麻LuACL-1在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式

研究表明，ACL能提高植物在非生物脅迫下的抗逆性。為了了解 "LuACL-1在非生物脅迫下對種子萌發(fā)的影響，本研究利用RT-qPCR檢測300 mmol·L^-1甘露醇和150 mmol·L^-1 NaCl處理12 h后的亞麻種子中 "LuACL-1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著增加（圖6）。

2.5.2 亞麻LuACL-1在不同非生物脅迫下提高擬南芥種子萌發(fā)率

為了探究 "LuACL-1在非生物脅迫下對擬南芥種子萌發(fā)率的影響，統(tǒng)計分析了野生型Col-0和T₃代純合轉(zhuǎn)基因株系 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA在300 mmol·L^-1甘露醇和150 mmol·L^-1 NaCl脅迫下的種子萌發(fā)率。結(jié)果顯示，在正常條件下，二者萌發(fā)速率相近，均可全部萌發(fā)；而在300 mmol·L^-1甘露醇和150 mmol·L^-1 NaCl脅迫下T₃代純合轉(zhuǎn)基因株系 "Col-0 35S：LuACL-1-6HA種子萌發(fā)率顯著高于野生型（圖7）。綜上所述，亞麻 "LuACL-1可提高擬南芥種子萌發(fā)階段對滲透脅迫和鹽脅迫的耐受能力。

2.5.3 亞麻LuACL-1在非生物脅迫下對擬南芥萌發(fā)種子中脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步探究 "LuACL-1在非生物脅迫下響應(yīng)逆境的分子機制，利用RT-qPCR技術(shù)檢測與ABA合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵基因 "AtNCED3（9-Cis-epoxycarotenoid dioxygenase 3）、 AtABI3 （Abscisic acid insensitive3）、 AtABI5（Abscisic acid insensitive5）、 "AtEM1（ Class I" late embryogenesis abundant protein 1）、 "AtEM6（ Class I late embryogenesis abundant protein 6）表達(dá)情況，其中脅迫處理后T₃代純合轉(zhuǎn)基因株系中 "AtNCED3、 "AtEM1和 "AtEM6表達(dá)量顯著低于野生型（圖8）。 "AtNCED3催化順式環(huán)氧類胡蘿卜素氧化裂解，為ABA合成提供前體物質(zhì)，促進(jìn)ABA合成^[22]； "AtEM1和 "AtEM6編碼晚期胚胎發(fā)生蛋白，該基因表達(dá)增強ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程^[23-24]。綜上所述， "LuACL-1可以通過減少ABA合成、減弱ABA信號響應(yīng)途徑提升種子 對鹽脅迫及滲透脅迫的耐受力，從而促進(jìn)種子 萌發(fā)。

2.5.4 脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)O-2、H₂O₂、MDA的含量以及SOD、POD活性

活性氧物質(zhì)含量、活性氧清除酶系統(tǒng)活性（如SOD、POD等）、MDA含量是植物在抗逆條件下的重要生理指標(biāo)。試驗結(jié)果表明，脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系的O-2、H₂O₂、MDA含量與野生型相比顯著降低（圖9-A、9-B、9-C），POD、SOD活性與野生型相比顯著提高（圖9-D、9-E）。

3 討" 論

檸檬酸在ACL作用下產(chǎn)生乙酰輔酶A進(jìn)而合成脂肪酸，因此ACL是植物體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，可以顯著影響油脂合成速率^[25-27]。此外也有研究報道ACL基因可以提高植物的抗逆性^[28-29]。但是亞麻ACL基因在調(diào)控種子油脂代謝和響應(yīng)逆境方面的作用尚不清楚。

本研究通過氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)亞麻LuACL-1與擬南芥AtACLA-1、AtACLA-2、AtACLA-3氨基酸序列同源率為83%～85%（圖1），相似度較高，因此筆者認(rèn)為亞麻LuACL-1和擬南芥AtACLA可能具有相似的生物學(xué)功能。在擬南芥野生型Col-0中過表達(dá) "LuACL-1能顯著提高種子含油量，但是脂肪酸各組分所占比例沒有發(fā)生改變（圖4-D）。前人研究表明，RNA干涉技術(shù)降低 "AtACLA-1表達(dá)導(dǎo)致種子脂肪酸含量降低^[10]。這些結(jié)果表明亞麻LuACL-1與擬南芥ACLA在調(diào)控種子油脂積累方面具有類似的調(diào)控功能。質(zhì)體丙酮酸激酶（Plastidial pyruvate kinase，PKp）催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸并釋放兩分子腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）^[30]。研究表明，PKp控制ATP和丙酮酸的供應(yīng)，用于質(zhì)體中的脂肪酸合成^[18]。 "AtPKp-α的表達(dá)量的提升說明其為脂肪酸合成提供更多所需的能量和物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸合成。生物素羧基載體蛋白（Biotin carboxylase carrier protein，BCCP）是構(gòu)成乙酰輔酶A羧化酶的亞基之一，該酶是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶^[31]。KASⅢ催化乙酰CoA與丙二酰ACP生成3-丁酮酰-ACP，從而啟動脂肪酸碳鏈的延伸循環(huán)， "AtKASⅢ表達(dá)量提升可促進(jìn)脂肪酸碳鏈的延伸循環(huán)，推動脂肪酸合成與積累^[19]。KASI是催化碳鏈從4：0-ACP到16：0-ACP的縮合，進(jìn)一步促進(jìn)碳鏈的延伸^[32]。 "AtFAE1是種子中合成超長鏈脂肪酸的必需基因，促使脂肪酸碳鏈延長^[20]。 "AtGPAT1編碼甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶，是三酰甘油合成過程中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)量提高有利于三酰甘油的合成，促進(jìn)脂肪酸積累^[21]。RT-qPCR結(jié)果顯示 "LuACL-1異源表達(dá)株系中油脂合成相關(guān)基因 "AtPKp-α、" AtKASⅢ、 "AtFAE1和 "AtGPAT1的表達(dá)上調(diào)，說明 "LuACL-1可能通過調(diào)控脂肪酸的從頭合成、 超長鏈脂肪酸的合成以及三酰甘油的合成從而促進(jìn)種子油脂的積累（圖4-D）。在本試驗中，筆者選用摩爾百分比來表示脂肪酸各組分含量，是指該組分在總脂肪酸含量中所占的比例，為一個相對含量。當(dāng)異源表達(dá)株系成熟種子中總脂肪酸的絕對含量和各組分脂肪酸的絕對含量以相同比例提高時，脂肪酸各組分的摩爾百分比不發(fā)生變化（圖4-E）。研究表明油酸脫氫酶合成基因 "AtFAD2和 "AtFAD3催化脂肪酸去飽和過程，其中， "AtFAD2催化油酸（C18：1）轉(zhuǎn)化為亞油酸（C18：2）， "AtFAD3催化亞油酸（C18：2）轉(zhuǎn)化為亞麻酸（C18：3）^[33]。在本研究試驗結(jié)果中， "AtFAD2和 "AtFAD3表達(dá)量無顯著變化，也可能是轉(zhuǎn)基因株系成熟種子中亞油酸、亞麻酸組分未發(fā)生顯著變化的原因之一（圖4-E）。此外，有研究表明植物種子大小的增加與種子內(nèi)脂肪酸含量增加有關(guān)^[34-35]。反義遺傳轉(zhuǎn)化 "AtACLA-1會導(dǎo)致擬南芥細(xì)胞變小，質(zhì)體畸形^[10]。因此筆者推測 "LuACL-1通過調(diào)控種子脂肪酸積累促進(jìn)種子變[CM（21]大以及質(zhì)量的增加（圖4-B、4-C）。綜上所述，""LuACL-1通過調(diào)控脂肪酸合成與積累多個關(guān)鍵基因表達(dá)而促進(jìn)脂肪酸的合成與積累。

在NaCl脅迫和甘露醇脅迫下，亞麻中 "LuACL-1的表達(dá)量顯著提升，猜測該基因可能參與非生物脅迫調(diào)控過程（圖6）。隨后，測定NaCl脅迫和甘露醇脅迫轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)率發(fā)現(xiàn) "LuACL-1的轉(zhuǎn)基因株系對NaCl脅迫和甘露醇脅迫的耐受性更高（圖7-A、B）。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，會誘導(dǎo)體內(nèi)活性氧的積累，當(dāng)積累過度會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而產(chǎn)生有毒物質(zhì)。此時，為了防止機體損傷，植物會激活活性氧清除系統(tǒng)，如SOD、POD等，維持植物體內(nèi)動態(tài)平衡。而丙二醛含量代表膜脂過氧化程度，其含量過多會加劇細(xì)胞膜損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷^[36]。本研究結(jié)果表明，NaCl脅迫和甘露醇脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系的活性氧物質(zhì)、丙二醛含量均顯著低于野生型，SOD、POD活性相比于野生型顯著升高（圖9）。這些結(jié)果表明 "LuACL-1能夠通過增強NaCl脅迫和甘露醇脅迫下亞麻的抗氧化能力，激活活性氧清除系統(tǒng)，增強SOD、POD活性，減少ROS、MDA等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞膜受到的氧化損傷，從而增強抗逆性。植物內(nèi)源激素ABA抑制種子萌發(fā)并誘導(dǎo)種子休眠^[37]。RT-qPCR分析表明（圖8），在NaCl脅迫和甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系中 AtNCED3、 AtEM1、 AtEM6表達(dá)量均顯著降低。NCED是ABA生物合成過程中的關(guān)鍵限速酶，AtNCED催化順式環(huán)氧類胡蘿卜素氧化裂解，為ABA合成提供前體物質(zhì)，該表達(dá)量減少表明ABA合成積累較少。 ABI3、 ABI5是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明， AtABI3的表達(dá)可誘導(dǎo) AtEM1和 AtEM6的表達(dá)量上升， AtABI5也可與 AtEM1和 AtEM6的ABA響應(yīng)元件結(jié)合從而激活這兩個基因的表達(dá)，進(jìn)而響應(yīng)逆境脅迫^[38-39]。在本研究中，轉(zhuǎn)基因株系中 AtABI3、 AtABI5的表達(dá)量在脅迫處理后無明顯變化。 AtEM1和 AtEM6編碼晚期胚胎發(fā)生蛋白，參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程^{[23-24，40]}，表達(dá)量[JP2]減少說明種子萌發(fā)過程中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱（圖8）。以上結(jié)果表明過量表達(dá) "LuACL-1可抑制ABA的合成以及依靠不依賴ABI3、ABI5介導(dǎo)的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而提高脅迫條件下種子萌發(fā)率。綜上所述， "LuACL-1可通過提高活性氧清除能力、減輕細(xì)胞膜損傷，調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)基因表達(dá)等途徑增強擬南芥種子的耐受能力。

亞麻作為中國重要的油料作物之一，在中國具有悠久的栽培歷史，其籽粒富含人體必須的多不飽和脂肪酸α-亞麻酸、木酚素等營養(yǎng)物質(zhì)。本研究通過探究亞麻 "LuACL-1在提高種子油脂積累和抵御非生物脅迫方面的作用，不僅為培育高產(chǎn)、抗逆品種提供基因資源，也為提高油料作物產(chǎn)量、增強作物對非生物脅迫的抗性提供研究思路。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 羅俊杰，歐巧明，葉春雷，等.重要胡麻栽培品種的抗旱性綜合評價及指標(biāo)篩選[J].作物學(xué)報，2014，40（7）：1259-1273.

LUO J J，OU Q M，YE CH L，et al.Comprehensive valuation of drought resistance and screening of indices of important flax cultivars [J].Acta Agronomic Sinica，2014， 40（7）：1259-1273.

[2]HALL L M，BOOKER H，SILOTO R M P，et al.Chapter 6-Flax （Linum usitatissimum L.） Industrial Oil Crops[M].Newyork：AOCS Press，2016：157-194.

[3]王恒生，刁治民，陳克龍，等.胡麻經(jīng)濟價值、開發(fā)應(yīng)用前景及在青海種植現(xiàn)狀[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（7）：2093-2096.

WANG H SH，DIAO ZH M，CHEN K L，et al.The economic value and development application prospects and production of Linum usitatissmum in Qinghai province [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2014，42（7）：2093-2096.

[4]CHAPMAN K D，OHLROGGE J B.Compartmentation of triacylglycerol accumulation in plants [J].Journal of Biological Chemistry，2012，287（4）：2288-2294.

[5]SUH M C，YI S Y，LEE S，et al.Pathogen-induced expression of plant ATP：citrate lyase [J].FEBS Letters，2001，488（3）：211-212.

[6]LANGLADE N B，MESSERLI G，WEISSKOPF L，et al.ATP citrate lyase：cloning，heterologous expression and possible implication in root organic acid metabolism and excretion [J].Plant，Cell and Environment，2002，25（11）：1561-1569.

[7]KIM W，TABITA F R.Both subunits of ATP-citrate lyase from Chlorobium tepidum contribute to catalytic activity [J].Journal of Bacteriology，2006，188（18）：6544-6552.

[8]FATLAND B L，KE J，ANDERSON M D，et al.Molecular characterization of a heteromeric ATP-citrate lyase that generates cytosolic acetyl-coenzyme A in Arabidopsis [J].Plant Physiology，2002，130（2）：740-756.

[9]劉家儀，李楊瑞，楊麗濤.ATP-檸檬酸裂解酶研究進(jìn)展 [J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，45（2）：204-208.

LIU J Y，LI Y R，YANG L T.Advances in ATP-citrate lyase research [J].Journal of Southern Agriculture，2014，45（2）：204-208.

[10]FATLAND B L，NIKOLAU B J，WURTELE E S.Reverse genetic characterization of cytosolic acetyl-CoA generation by ATP-citrate lyase in Arabidopsis [J].The Plant Cell，2005，17（1）：182-203.

[11]童 晉.油菜檸檬酸合酶與檸檬酸裂解酶基因克隆及功能研究 [D].武漢：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

TONG J.Cloning and functional reasearch of citrate synthase and ATP-citrate lyase of" Brassica napus L [D].Wuhan：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2009.

[12]SHARMA N，ANDERSON M，KUMAR A，et al.Transgenic increases in seed oil content are associated with the differential expression of novel Brassica-specific transcripts [J].BMC Genomics，2008，9（1）：619.

[13]WONG Y C，TEH H F，MEBUS K，et al. Differential gene expression at different stages of mesocarp development in high- and low-yielding oil palm [J].BMC Genomics，2017，18（1）：470.

[14]劉文獻(xiàn)，劉志鵬，謝文剛，等.脂肪酸及其衍生物對植物逆境脅迫的響應(yīng) [J].草業(yè)科學(xué)，2014，31（8）：1556-1565.

LIU W X，LIU ZH P，XIE W G，et al.Responses of fatty acid and its derivatives to stress in plants [J].Pratacultural Science，2014，31（8）：1556-1565.

[15]YANG Y，LI R，QI M.In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves [J].The Plant Journal，2000，22（6）：543-551.

[16]CHEN M，DU X，ZHU Y，et al.Seed Fatty Acid Reducer acts downstream of gibberellin signalling pathway to lower seed fatty acid storage in Arabidopsis [J].Plant，Cell amp; Environment，2012，35（12）：2155-2169.

[17]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the -2^△△Ct method [J].Methods，2001，25：402-408.

[18]ANDRE C，F(xiàn)ROEHLICH J E，MOLL M R，et al.A heteromeric plastidic pyruvate kinase complex involved in seed oil biosynthesis in Arabidopsis [J].The Plant Cell，2007，19（6）：2006-2022.

[19]MENG Q，LIANG H，GAO H.Roles of multiple KASⅢ homologues of Shewanella oneidensis in initiation of fatty acid synthesis and in cerulenin resistance [J].Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Molecular and Cell Biology of Lipids，2018，1863（10）：1153-1163.

[20]JAMES D W，LIM E，KELLER J，et al.Directed tagging of the Arabidopsis FATTY ACID ELONGATION1 （FAE1） gene with the maize transposon activator [J].The Plant Cell，1995，7（3）：309-319.

[21]CHEN X，SNYDER C L，TRUKSA M，et al.sn-Glycerol-3-phosphate acyltransferases in plants [J].Plant Signaling amp; Behavior，2011，6（11）：1695-1699.

[22]IUCHI S，KOBAYASHI M，TAJI T，et al.Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis [J].The Plant Journal，2001， 27（4）：325-333.

[23]LI Y J，F(xiàn)ANG Y，F(xiàn)U Y R，et al.NFYA1 is involved in regulation of postgermination growth arrest under salt stress in Arabidopsis [J].PLoS One，2013，8（4）：e61289.

[24]MORRIS P C，KUMAR A，BOWLES D J，et al.Osmotic stress and abscisic acid induce expression of the wheat Em genes [J].European Journal of Biochemistry，1990， 190（3）：625-630.

[25]RATLEDGE C，BOWATER M D V，TAYLOR P N.Correlation of ATP/citrate lyase activity with lipid accumulation in developing seeds of Brassica napus L.[J].Lipids，1997，32（1）：7-12.

[26]KAETHNER T M，AP REES T.Intracellular location of ATP citrate lyase in leaves of Pisum sativum L [J].Planta，1985，163（2）：290-294.

[27]FRITSCH H，BEEVERS H.ATP citrate lyase from germinating castor bean endosperm：localization and some properties [J].Plant Physiology，1979，63（4）：687-691.

[28]李長寧，Manoj Kumar SRIVASTAVA，農(nóng) 倩，等.水分脅迫下外源ABA提高甘蔗抗旱性的作用機制 [J].作物學(xué)報，2010，36（5）：863-870.

LI CH N，SRIVASTAVA M K，NONG Q，et al. Mechanism of tolerance to drought in sugarcane plant enhanced by foliage dressing of abscisic acid under water stress [J].Acta Agronomica Sinica，2010，36（5）：863-870.

[29]SRIVASTAVA M K，LI CH N，NONG Q，et al. Effect of exogenous ABA application on chlorophyll fluorescence in sugarcane under water stress conditions [J].Guangxi Agricultural Sciences，2009，40：1411-1417.

[30]VALENTINI G，CHIARELLI L，F(xiàn)ORTIN R，et al. The allosteric regulation of pyruvate kinase：a site-directed mutagensis study [J].Journal of Biological Chemistry，2000，275（24）：18145-18152.

[31]THELEN J J，MEKHEDOV S，OHLROGGE J B.Brassicaceae express multiple isoforms of biotin carboxyl carrier protein in a tissue-specific manner [J].Plant" Physiology，2001，125：2016-2028.

[32]WU G Z，XUE H W.Arabidopsis β-ketoacyl-[acyl carrier protein] synthase I is crucial for fatty acid synthesis and plays a role in chloroplast division and embryo development [J].The Plant Cell，2010，22（11）：3726-3744.

[33]PUTTICK D，DAUK M，LOZINSKY S，et al.Overexpression of a FAD3 desaturase increases synthesis of a polymethylene-interrupted dienoic fatty acid in seeds of Arabidopsis thaliana L.[J].Lipids，2009，44：753-757.

[34]PANTHEE D R，PANTALONE V R，WEST D R，et al.Quantitative trait loci for seed protein and oil concentration，and seed size in soybean [J].Crop Science，2005， 45（5）：2015-2022.

[35]TIAN Y，LV X，XIE G，et al.Seed-specific overexpression of AtFAX1 increases seed oil content in Arabidopsis [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2018，500（2）：370-375.

[36]CHOUDHURY F K，RIVERO R M，BLUMWALD E，et al.Reactive oxygen species，abiotic stress and stress combination [J].The Plant Journal，2017，90（5）：856-867.

[37]IWASAKI M，PENFIELD S，LOPEZ-MOLINA L.Parental and environmental control of seed dormancy in Arabidopsis thaliana [J].Annual Review of Plant Biology，2022，73：355-378.

[38]LIU X，ZHANG H，ZHAO Y，et al.Auxin controls seed dormancy through stimulation of abscisic acid signaling by inducing ARF-mediated ABI3 activation in Arabidopsis [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110：15485-15490.

[39]BEDI S，SENGUPTA S，RAY A，et al.ABI3 mediates dehydration stress recovery response in Arabidopsis thaliana by regulating expression of downstream genes [J].Plant Science，2016，250：125-140.

[40]ZHAO X，DOU L，GONG Z，et al.BES1 hinders ABSCISIC ACID INSENSITIVE5 and promotes seed germination in Arabidopsis [J].New Phytologist，2019， 221（2）：908-918.

Effects of Flax "LuACL-1 Gene on Oil Accumulation and Stress Response in Arabidopsis" thaliana

LIU Jiajia，LI Yuxin，HE Mingyuan，CUI Xiaohui，MA Yunyun， LIU Zijin，CHEN Mingxun and GUO Yuan

（College of Agronomy， Northwest Aamp;F University， Yangling Shaanxi 712100，China）

Abstract ATP-citrate lyase （ACL） plays a crucial role in seed oil accumulation and stress response， however， the involvement of its homolog （LuACL） from flax （Linum usitatissimum L.）"" in these processes remains unclear. In this study， the full-length coding sequence of "LuACL-1 was cloned from" ‘Longya 10’nbsp; and transformed into Arabidopsis thaliana to analyze its function in seed oil accumulation and abiotic stress response. The results showed that heterologous expression of "LuACL-1 in Arabidopsis" wild-type background enhanced seed size and seed mass， and promoted seed oil accumulation by positively regulating the expression of oil biosynthesis related genes， including AtPKp-α， AtKASIII， AtFAE1 and AtGPAT1. In addition， under NaCl and mannitol stress， the germination rate of "LuACL-1 transgenic lines was significantly higher than that of wild-type，while the expression levels of AtNCED3， AtEM1 and AtEM6 were significantly lower.Consistently， the activities of superoxide dismutase and peroxidase significantly increased in "LuACL-1 transgenic lines， alongside decreased levels of hydrogen peroxide， superoxide anion， and malondialdehyde. In conclusion， the heterologous expression of "LuACL-1 in Arabidopsis not only promotes seed oil accumulation by upregulating the expression of genes related to oil biosynthesis but also enhances the" salt and osmotic stress tolerance by improving the active oxygen scavenging capacity， reducing membrane lipid damage， and regulating the expression of ABA synthesis and signaling response genes. The results of this study provide genetic resources and molecular references for improving future breeding of flax and other oil crops with high oil content and enhanced abiotic stress.

Key words Linum usitatissimum L.; ATP-citrate lyase; Fatty acids; NaCl stress; Mannitol stress

Received" 2024-03-25""" Returned 2024-05-20

Foundation item Sci-Tech Innovation 2030 （No.2022ZD04010）;the Scientific and Technological Innovation Team of Shaanxi Province （No.2024RS-CXTD-69）;the Fundamental Research Funds for the Central Universities （No.2452023090）.

First author LIU" Jiajia，female，master student. Research area：crop genetic improvement and germplasm innovation. E-mail：liu18235568734@163.com

Corresponding"" author GUO Yuan，female，Ph.D，lecturer，master supervisor. Research area：rapeseed genetics and breeding. E-mail：guoyuan2109@163.com

（責(zé)任編輯：成 敏 Responsible editor：CHENG" Min）

基金項目：國家科技創(chuàng)新2030（2022ZD04010）；陜西省科技創(chuàng)新團隊（2024RS-CXTD-69）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（2452023090）。

第一作者：劉佳佳，女，碩士研究生，研究方向為作物遺傳改良與遺傳種質(zhì)創(chuàng)新。E-mail：liu18235568734@163.com

通信作者：郭 媛，女，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，研究方向為油菜遺傳育種。E-mail：guoyuan2109@163.com