【摘" "要】" "EBS和SHL是植物特有的一類染色質(zhì)閱讀器蛋白，通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合兩類功能相互拮抗的組蛋白修飾調(diào)控靶基因表達(dá)和相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，但目前未見(jiàn)有關(guān)翻譯后修飾調(diào)控其蛋白功能的報(bào)道。利用大腸桿菌SUMO化修飾重建體系發(fā)現(xiàn)，EBS和SHL都存在SUMO化修飾，且不論以哪種SUMO分子亞型為供體都只有一條SUMO化條帶，根據(jù)SUMO化條帶和與本底蛋白分子量差值推測(cè)均為單位點(diǎn)的單SUMO化修飾。進(jìn)一步利用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，K216是EBS唯一且關(guān)鍵的SUMO化位點(diǎn)，而SHL的SUMO化位點(diǎn)有待繼續(xù)研究，但至少可以排除K111、K178和K220三個(gè)位點(diǎn)，為下一步探討SUMO化修飾調(diào)控EBS和SHL的蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】" "染色質(zhì)閱讀器蛋白；EBS；SHL；SUMO化修飾；SUMO

【Abstract】" " EBS and SHL are plant-specific chromatin reader proteins， which regulate target gene expression and related biological processes by specifically recognizing and binding to two antagonistic histone modifications. However， there have been no reports on the regulation of their protein functions by post-translational modifications. In this study， after the E. coli SUMOylation reconstruction system is used， it is found that both EBS and SHL have SUMOylation， and there is only one SUMOylation band， no matter which SUMO molecular subtype is used as the donor. According to the difference of molecular weight between the SUMOylation band and the background protein band， it is inferred that both EBS and SHL are single-site single SUMOylation. Further site-directed mutagenesis experiments confirm that K216 is the single critical SUMOylation site for EBS， while the SUMOylation site for SHL remains to be further explored， but at least K111， K178， and K220 can be excluded. This study lays a foundation for further exploration of the regulation of EBS and SHL protein functions by SUMOylation modification.

【Key words】" " "chromatin reader; EBS; SHL; SUMOylation; SUMO

〔中圖分類號(hào)〕 Q943" " " " " " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕" A

〔文章編號(hào)〕 1674 - 3229（2024）04 - 0041 - 08" " " " " " " " " " " "DOI：10.20218/j.cnki.1674-3229.2024.04.006

0" " "引言

SUMO化修飾（SUMOylation）是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在真核生物中廣泛存在，該修飾與泛素化修飾的過(guò)程類似，依次需要 E1 激活酶、E2 偶聯(lián)酶、E3 連接酶順序催化，最終將活性 SUMO （Small Ubiquitin-like Modifier，小泛素樣修飾蛋白）分子共價(jià)連接到底物蛋白特定賴氨酸殘基（Lys，K）側(cè)鏈的ε-NH2上，通過(guò)影響底物蛋白的活性、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白復(fù)合體的形成或解離等，最終影響底物蛋白的生物功能及其參與的生物學(xué)過(guò)程［1-5］。在泛素化修飾中，底物蛋白泛素化的特異性往往由數(shù)量龐大的泛素E3連接酶決定，且泛素化通常導(dǎo)致底物蛋白降解［6］。與泛素化不同的是，底物蛋白SUMO化的特異性不是由SUMO E3連接酶決定，且SUMO化通常不會(huì)直接誘導(dǎo)底物蛋白降解，另外SUMO化有時(shí)候不需要SUMO E3連接酶參與也能完成，E3只是增強(qiáng)了SUMO化的效率［2，6-7］。

SUMO化修飾以SUMO分子為供體，新翻譯出來(lái)的SUMO分子一般以前體的形式存在，此時(shí)還沒(méi)有活性，不能直接作為SUMO化底物的供體［1-3］。SUMO蛋白酶利用其內(nèi)肽酶的活性切掉前體SUMO分子C末端一小段序列后暴露出兩個(gè)連續(xù)的甘氨酸序列（GG），此時(shí)才形成成熟有活性的SUMO分子［1-3］。SUMO分子在不同物種中通常存在多種亞型和差異性的時(shí)空表達(dá)模式，因此不同SUMO分子亞型在SUMO化形成和功能發(fā)揮上會(huì)呈現(xiàn)一定的差異性和特異性。比如在哺乳動(dòng)物中據(jù)報(bào)道有4個(gè)SUMO分子亞型，在擬南芥中則有9個(gè)亞型，但這9個(gè)亞型中確定存在轉(zhuǎn)錄本的只有4個(gè)，即SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO5［1-2］。

SUMO化修飾的位點(diǎn)在底物蛋白特定序列的K上，這些特定序列存在一定的規(guī)律性和保守性，故而被稱為“共有基序”，最經(jīng)典的共有基序?yàn)椤埃郐罚?［K］-［x］-［α］”，其中Ψ為疏水氨基酸，x為任意氨基酸，α為天冬氨酸（Asp，D）或谷氨酸（Glu，E）［1-2］。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，SUMO化有時(shí)候也發(fā)生在一些不完整的共有基序中，如“［K］-［x］-［α］”，或者是反向的，如“［α］-［x］-［K］-［Ψ］”［8-9］?？梢?jiàn)，SUMO 化基序不是單一的，存在一定的變異性，具有多樣化的傾向。

擬南芥 EBS（Early Bolting in Short Days）和 SHL（Short Life）是兩個(gè)高度同源的染色質(zhì)閱讀器蛋白，存在一定的功能冗余，已被證實(shí)共同參與調(diào)控?cái)M南芥的開(kāi)花時(shí)間［10-12］、種子休眠與萌發(fā)［13］、高溫介導(dǎo)的萌發(fā)抑制［14］、根的發(fā)育［15］等過(guò)程。EBS和SHL都含有N端BAH和C端PHD兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，BAH結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別并結(jié)合抑制性組蛋白修飾H3K27me2/3，PHD結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別并結(jié)合激活型組蛋白修飾H3K4me2/3，BAH-H3K27me2/3和PHD-H3K4me2/3這兩種相互作用模塊是獨(dú)立發(fā)生的事件，而且是相互排斥的［10-11，16］。EBS和SHL一旦結(jié)合H3K27me2/3或H3K4me2/3后，就能夠招募其他表觀遺傳組分或轉(zhuǎn)錄因子等形成轉(zhuǎn)錄抑制或激活復(fù)合物，進(jìn)而抑制或激活靶基因或靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控相關(guān)生物學(xué)過(guò)程［10-11，14-16］。

目前有關(guān)EBS和SHL功能與機(jī)制的報(bào)道均未涉及翻譯后修飾的調(diào)控。前人通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)批量篩選發(fā)現(xiàn)，SHL與SUMO E2偶聯(lián)酶SCE1（SUMO conjugating enzyme1）能夠直接結(jié)合［17］，暗示SHL可能存在SUMO化修飾。因此，本研究利用大腸桿菌體外SUMO化重建體系［18］和生化手段，檢測(cè) SHL及其同源蛋白EBS是否存在SUMO化修飾，并尋找其可能的SUMO化位點(diǎn)，為探討SUMO化調(diào)控EBS和SHL的蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

1" " "材料與方法

1.1" "菌種與載體

基因克隆用的是大腸桿菌DH5α菌株，蛋白原核表達(dá)用的是大腸桿菌BL21（DE3）菌株，載體構(gòu)建進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)用的是改造的商品化pET28a載體（Novagen），即在N端6×His標(biāo)簽之后引入了兩個(gè)連續(xù)的FLAG標(biāo)簽（2×FLAG），改造成pET28a-6×His-2×FLAG，簡(jiǎn)寫為pET28a-FLAG，引入FLAG標(biāo)簽的目的是方便后續(xù)蛋白免疫印跡檢測(cè)。大腸桿菌體外SUMO化修飾重建體系由編碼3個(gè)不同抗性基因的原核表達(dá)載體組成：pCDFDuet、pACYCDuet以及改造的pET28a-FLAG。pCDFDuet載體含有壯觀霉素抗性基因（Spe+），引入了SUMO分子和SUMO E2偶聯(lián)酶SCE1的全長(zhǎng)蛋白編碼序列，使得SUMO分子和E2分別帶有N端6×His標(biāo)簽和C端S-Tag標(biāo)簽；pACYCDuet載體含有氯霉素抗性基因（Chl+），引入了組成SUMO E1激活酶全酶的兩個(gè)亞基SAE1和SAE2的全長(zhǎng)蛋白編碼序列，使得SAE1、SAE2分別帶有C端S-Tag標(biāo)簽和N端6×His標(biāo)簽；pET28a-FLAG含有卡那霉素抗性基因（Kan+），可引入待檢測(cè)蛋白的全長(zhǎng)或部分編碼序列，如EBS和SHL，使其N端帶有2×FLAG標(biāo)簽。

1.2" "實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建和定點(diǎn)突變使用諾唯贊的試劑（Vazyme）。基因擴(kuò)增用的高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P505-d3），載體構(gòu)建使用一步法克隆試劑盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（C112-02），菌落PCR使用諾唯贊的2×Rapid Taq Master Mix（P222-04），定點(diǎn)突變用的是Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2（C214-02），質(zhì)粒提取試劑盒（DC201）和膠回收/DNA純化試劑盒（DC301）也都購(gòu)自諾唯贊，載體構(gòu)建用的限制性內(nèi)切酶如BamHI、StuI、EcoRI等購(gòu)自NEB和Thermo Fisher。

大腸桿菌生長(zhǎng)用的胰蛋白胨（Tryptone，LP0042）和酵母提取物（Yeast Extract，LP0021）購(gòu)自O(shè)XOID公司；蛋白誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)試劑IPTG （isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，I5502-10G）、PAGE膠促凝劑過(guò)硫酸銨（AP，A3678-100G）、蛋白還原劑DTT（DL-Dithiothreitol，D9163-25G）和蛋白酶抑制劑PMSF（P7626-5G）均購(gòu)自sigma公司；缺乏EDTA的蛋白酶抑制劑片劑Cocktail（4693132001）購(gòu)自Roche；Tween20（A600560-0500）、脫脂奶粉（A600669-0250）、NaCl（A501218-0001）等購(gòu)自上海生工；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自Biosharp（BL520A）和Thermo Fisher（SuperSignal West Atto 超敏化學(xué)發(fā)光底物，A38555）；PVDF膜（Immobilon? -P PVDF Membrane）購(gòu)自Millipore（IPVH00010）；其他常用的生化試劑和藥品主要購(gòu)自Sigma、Amresco、BBI、Solarbio、上海生工或上海國(guó)藥等公司。

壯觀霉素（Spectinomycin，S742-25G）、氯霉素（Chloramphenicol，C252-100G）、羧芐青霉素（Carbenicillin，C346-25G）、氨芐青霉素（Ampicillin，A116-25G）均購(gòu)自PhytoTechnology；硫酸卡那霉素（Kanamycin Sulfate，K9316）購(gòu)自lablead/蘭博利德。

鼠源FLAG抗體Anti-DYKDDDDK 單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司（M20008L）和Sigma公司（F1804）；山羊抗鼠的二抗Goat Anti-Mouse IgG-HRP（M21001L）購(gòu)自Abmart公司；帶HRP的抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體（HRP Conjugated Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody，CW0285M）購(gòu)自康為試劑；抗S-Tag標(biāo)簽的鼠多克隆抗體 S-Tag Monoclonal Antibody（3B3）（YM3017）購(gòu)自ImmunoWay。

1.3" "實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1" "原核表達(dá)載體的構(gòu)建

目的基因需要連接到改造的pET28a-FLAG載體上，使其帶有N端2×FLAG標(biāo)簽方便后續(xù)免疫印跡檢測(cè)。利用BamHI和StuI雙酶切使pET28a-FLAG載體線性化，將目的基因擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后與線性化的pET28a-FLAG載體用一步法重組克隆試劑盒（C112-02）重組，轉(zhuǎn)化卡那霉素抗性平板（LB，50 mg/L Kan+）篩選陽(yáng)性菌落，用2×Rapid Taq Master Mix（P222）進(jìn)行陽(yáng)性菌落鑒定，鑒定出來(lái)的陽(yáng)性克隆送測(cè)序，確保目的基因序列完全無(wú)誤且與FLAG標(biāo)簽正確融合。

載體構(gòu)建涉及到的引物合成和測(cè)序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，引物合成方式為tPAGE或hPAGE，引物序列及用途見(jiàn)表1。

1.3.2" "目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與提取

將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體pET28a-Target-FLAG轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)，在卡那霉素抗性平板上（LB，50 mg/L Kan+）篩選陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

挑取陽(yáng)性單克隆過(guò)夜搖培，搖培起來(lái)的菌液按照體積比1：200進(jìn)行二次搖培，兩次搖培的條件均為37 ℃，200 r/min。待二次搖培菌液的OD600值在 0.6～0.8 范圍時(shí)，加入終濃度為0.5 mM 的IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為22 ℃，220 r/m，誘導(dǎo)12～18 h。收集添加和不添加 IPTG 的菌液各100 μL，離心收集菌體后加入100 μL蛋白提取裂解液（50 mM Tris-HCl（pH 7.6），150 mM NaCl，5 mM MgCl2，10%甘油，0.5 mM DTT，1 mM PMSF）重懸菌體，接著加入100 μL 蛋白上樣緩沖液（2×SDS loading buffer），混合均勻后在100 ℃的金屬浴中變性5～10 min，期間顛倒混勻幾次，使細(xì)菌裂解充分。變性后的蛋白在冰上靜置 5 min，使用4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)于12000 r/min條件下離心 10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，然后進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)（Western blot，WB）和考馬斯亮藍(lán)染色（Coomassie Brilliant Blue，CBB）。

1.3.3" "蛋白電泳與WB檢測(cè)

制備合適濃度的SDS-PAGE蛋白膠，濃度大小根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小而定，一般為8%或10%。待分離膠充分凝固后制備4%的濃縮膠，選取上樣量適宜的制膠梳子，一般為10孔或15孔。待濃縮膠充分凝固后拔掉梳子，將制備好的蛋白膠置于含有1×蛋白電泳緩沖液的電泳槽中，清理干凈濃縮膠膠孔中的殘膠后上樣。

樣品在濃縮膠中首先以80 V的電壓電泳，使所有樣品濃縮成整齊的一條線，電泳約30 min待所有樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳，之后的電泳時(shí)長(zhǎng)依據(jù)目的蛋白分子量大小決定。電泳結(jié)束后，用半干轉(zhuǎn)膜儀選擇合適的電壓和時(shí)長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜，一般為22 V，20～50 min，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)依據(jù)目的蛋白分子量大小決定。轉(zhuǎn)膜時(shí)需要注意PVDF膜需要提前用甲醇浸泡約1 min后才能使用，轉(zhuǎn)膜時(shí)從下到上的順序?yàn)椋汉駷V紙-PVDF膜-蛋白膠-厚濾紙，各層之間不能有氣泡。

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5% 的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間至少1 h。封閉結(jié)束后，用1×PBST漂洗3次，每次5 min，然后加入適當(dāng)稀釋濃度的一抗（如FLAG抗體，1：5000稀釋）于4 ℃孵育過(guò)夜或室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后回收一抗以備后續(xù)重復(fù)使用，然后用 1×PBST 漂洗PVDF膜3次，每次10 min。漂洗結(jié)束后加入二抗，于室溫繼續(xù)孵育30～60 min，孵育結(jié)束后回收二抗備用，然后用1×PBST漂洗PVDF膜3～5次，每次5 min。漂洗結(jié)束后，將混合好的ECL發(fā)光底物均勻涂抹在PVDF膜上，在凝膠成像儀下掃描WB結(jié)果。

1.3.4" "大腸桿菌SUMO化修飾體系的介紹及改進(jìn)

大腸桿菌SUMO化修飾體系主要包含有三個(gè)載體。

（1） pCDFDute-AtSUMO1/2/3/5 GG （AA）-AtSCE1∶

該載體含有擬南芥SUMO化發(fā)生的必備組分AtSUMO1/2/3/5和SUMO E2結(jié)合酶AtSCE1。GG代表有活性的SUMO分子，其C端帶有兩個(gè)連續(xù)的甘氨酸基序。當(dāng)兩個(gè)連續(xù)的甘氨酸（GG）都突變?yōu)楸彼幔ˋA）后，相應(yīng)SUMO分子的活性就完全喪失。同理，E2的活性位點(diǎn)為第94位的半胱氨酸（C94），當(dāng)突變?yōu)榻z氨酸（C94S）后E2活性喪失。

（2） pACYCDute-AtSAE1-AtSAE2∶該載體含有構(gòu)成擬南芥SUMO E1激活酶全酶的兩個(gè)亞基SAE1和SAE2。

（3） pET28a-His-Target：該載體含有待檢測(cè)的目的基因，其N端含有6×His標(biāo)簽。為了方便后續(xù)WB檢測(cè)，將其改造為pET28a-FLAG-Target。

以上3種質(zhì)粒分別帶有壯觀霉素（Spe+）抗性基因、氯霉素（Chl+）抗性基因和卡那霉素（Kan+）抗性基因，便于后期轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)后利用抗生素篩選陽(yáng)性克隆。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)非常困難，為了提高轉(zhuǎn)化效率，本研究使用了分步轉(zhuǎn)化策略。首先將pACYDute-AtSAE1-AtSAE2轉(zhuǎn)入BL21（DE3），并制備成感受態(tài)細(xì)胞，命名為E1-BL21；接著將pCDFDute-AtSUMO-AtSCE1、pCDFDute-AtSUMO（GG-AA）-AtSCE1、pCDFDute-

AtSUMO-AtSCE1（C94S）分別轉(zhuǎn)入E1-BL21感受態(tài)，并進(jìn)一步制備成新的感受態(tài)細(xì)胞，分別命名為E1-E2-SUMO-BL21、E1-E2-SUMO（AA）-BL21、E1-E2（C94S）-SUMO-BL21；最后將構(gòu)建有目的基因的pET28a-FLAG-Target轉(zhuǎn)入上述3種感受態(tài)細(xì)胞中，在同時(shí)含有3種不同抗性的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，之后進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和WB檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。

1.3.5" "潛在 SUMO 化修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

SUMO 化修飾的預(yù)測(cè)工具常用的有3個(gè)： GPS-SUMO、SUMOplot、JASSA，其對(duì)應(yīng)的網(wǎng)站依次為 http： //sumosp. biocuckoo. org/online.php/、 https：//www.abcepta.com/tools/、http：//www.jassa.fr/。3個(gè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果經(jīng)常不一致，多數(shù)情況下存在差異甚至相差甚遠(yuǎn)，其準(zhǔn)確性和可靠性都不是很高，只能作為參考，其預(yù)測(cè)位點(diǎn)是否精準(zhǔn)往往需要借助質(zhì)譜鑒定結(jié)合定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和分析。

2" " "實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1" "大腸桿菌 SUMO 化重建體系的驗(yàn)證

前人已經(jīng)在大腸桿菌中重建了擬南芥SUMO化修飾體系［18］（圖1A），為了驗(yàn)證其可靠性，本研究首先重復(fù)了前人的部分實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為擬南芥中已知的SUMO化修飾底物，AtMYB30能夠被正常誘導(dǎo)（圖1B），且不論以SUMO1、SUMO2還是SUMO3為供體，在AtMYB30本底蛋白上方均出現(xiàn)了一條高分子量的條帶，該條帶即為AtMYB30的SUMO化條帶（圖1C）。但當(dāng)E2活性位點(diǎn)突變后（C94S），高分子量的修飾條帶完全消失（圖1C）。證明AtMYB30的確存在SUMO化修飾，同時(shí)也驗(yàn)證了大腸桿菌SUMO化修飾重建體系的特異性和可靠性。

2.2" "EBS和SHL在大腸桿菌 SUMO 化體系中存在SUMO化修飾

前人以SUMO E2偶聯(lián)酶SCE1和SUMO蛋白酶ESD4（Early in Short Days4）為誘餌篩選酵母雙雜交文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)SHL能夠直接結(jié)合SCE1［17］，為SHL存在SUMO化修飾提供了線索和可能性。由于EBS與SHL高度同源，因此本研究用大腸桿菌 SUMO 化重建體系一起進(jìn)行了檢測(cè)。

將EBS和SHL分別構(gòu)建到pET28a-FLAG載體上，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和WB結(jié)果顯示， EBS和SHL都能夠正常表達(dá)，且分子量都略高于35 kDa，符合預(yù)期大?。▓D2A和圖3A）。將pET28a-EBS-FLAG和pET28a-SHL-FLAG分別導(dǎo)入同時(shí)含有E1、E2和不同亞型SUMO分子的大腸桿菌SUMO化體系中，發(fā)現(xiàn)在EBS和SHL本底蛋白上方均出現(xiàn)了一條高于本底蛋白的特異性條帶，分子量介于40～55 kDa之間（圖2B和圖3B），表明這些高分子量條帶很可能為EBS和SHL的SUMO化條帶。為了確定高分子量條帶為EBS和SHL的SUMO化條帶，將pET28a-EBS-FLAG和pET28a-SHL-FLAG分別導(dǎo)入含有SUMO分子活性缺失突變體（SUMO GG-AA）或E2活性缺失突變體（E2 C94S）中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高分子量SUMO化條帶在這些活性缺失突變體中都完全消失（圖2C、圖2D、圖3C、圖3D）。以上結(jié)果表明，EBS和SHL的確存在SUMO化修飾，同時(shí)也再次佐證了大腸桿菌SUMO化重建體系的特異性和可靠性。

由于一個(gè)成熟SUMO分子的分子量大約為11～12 kDa，從SUMO化條帶與本底蛋白的分子量差值推斷，EBS和SHL的SUMO化很可能都是單位點(diǎn)的單SUMO化修飾。接下來(lái)就需要尋找EBS和SHL具體的SUMO化位點(diǎn)。

2.3" "EBS和SHL 的蛋白結(jié)構(gòu)與SUMO化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

EBS和SHL隸屬于染色質(zhì)閱讀器蛋白家族成員，都有N端BAH和C端PHD兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，BAH和PHD分別特異性識(shí)別并結(jié)合抑制型組蛋白修飾H3K27me2/3和激活型組蛋白修飾H3K4me2/3［10-11，16］。EBS和SHL都存在不同的轉(zhuǎn)錄本，但不同轉(zhuǎn)錄本的蛋白編碼產(chǎn)物都包括完整的BAH和PHD兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。EBS和SHL主要轉(zhuǎn)錄本的蛋白編碼產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別為224aa和228aa，EBS和SHL的蛋白結(jié)構(gòu)和各結(jié)構(gòu)域大小和位置如圖4A所示。

常用的SUMO化預(yù)測(cè)工具有3個(gè)，即GPS-SUMO、SUMOplot和JASSA。將EBS和SHL的全長(zhǎng)蛋白序列分別用這3個(gè)SUMO化預(yù)測(cè)工具綜合分析發(fā)現(xiàn)，EBS和SHL都存在SUMO化修飾，且最有可能發(fā)生SUMO化的位點(diǎn)也都各有3個(gè)：EBS是K150、K185和K216，SHL是K111、K178和K220（圖4B）。在EBS 3個(gè)可能的SUMO化位點(diǎn)中，K150和K185均位于EBS的PHD結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，K216則位于PHD結(jié)構(gòu)域后面的區(qū)域（圖4B）。在SHL的3個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)中，K111位于SHL的BAH結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，K178位于SHL的PHD結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，K220則位于其PHD結(jié)構(gòu)域后面的區(qū)域（圖4B）。所有這些位點(diǎn)中到底哪個(gè)是真實(shí)的SUMO化位點(diǎn)需要定點(diǎn)突變結(jié)合WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和分析。

2.4" "K216是 EBS唯一的SUMO化修飾位點(diǎn)

為探究EBS的SUMO化位點(diǎn)，將K150、K185和K216 3個(gè)精氨酸殘基分別定點(diǎn)突變?yōu)橘嚢彼釟埢?，即分別突變?yōu)镵150R、K185R和K216R，以模擬這些位點(diǎn)的SUMO化修飾缺失突變體，然后利用大腸桿菌SUMO化重建體系進(jìn)行分析。

首先以SUMO1為供體進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)K150和K185分別點(diǎn)突變后，在EBS本底蛋白上方仍然存在一條特異性高分子量SUMO化條帶，位置和大小與無(wú)突變的EBS對(duì)照完全一致， 而K216R的點(diǎn)突變使得EBS本底蛋白上方的高分子量條帶消失（圖5A），可見(jiàn)K150R和K185R的點(diǎn)突變不影響EBS的SUMO化修飾，K216R的點(diǎn)突變導(dǎo)致EBS的SUMO化修飾喪失。結(jié)果表明，K150和K185都不是EBS真實(shí)的SUMO化位點(diǎn)，而K216則可能是EBS的關(guān)鍵SUMO化位點(diǎn)。接著以SUMO2和SUMO3分別為供體開(kāi)展類似實(shí)驗(yàn)，得到與以SUMO1為供體類似的結(jié)果，即只有K216R能夠造成EBS的SUMO化條帶消失，其他兩個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變則不影響（圖5B、圖5C）。最后，將K150R和K185R同時(shí)引入EBS，構(gòu)建成EBS-2KR的雙點(diǎn)突變（K150R/K185R），以無(wú)突變的EBS和K216R點(diǎn)突變的EBS為對(duì)照，利用大腸桿菌SUMO化重建體系重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2KR也不影響EBS的SUMO化修飾帶型和強(qiáng)弱，只有K216R能夠造成EBS的SUMO化條帶消失（圖5D）。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，K216是EBS唯一且關(guān)鍵的SUMO化位點(diǎn)。

2.5" "探究SHL的SUMO化修飾位點(diǎn)

與探究EBS的SUMO化修飾位點(diǎn)類似，本研究也用同樣的手段探究了SHL可能的SUMO化位點(diǎn)。將K111R、K178R和K220R 3個(gè)點(diǎn)突變分別導(dǎo)入SHL，發(fā)現(xiàn)不論以哪種SUMO分子為供體，這些單點(diǎn)突變都不影響SHL的SUMO化修飾情況（圖6A、圖6B、圖6C），表明這些位點(diǎn)可能不是SHL真實(shí)的SUMO化位點(diǎn)。由于SUMO化可能存在修飾位點(diǎn)冗余，于是將這3個(gè)點(diǎn)突變?nèi)繉?dǎo)入SHL，構(gòu)建成SHL-3KR，即K111R/K178R/K220R。同時(shí)選取3個(gè)獨(dú)立的SHL-3KR單克隆一起進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)獨(dú)立的3KR單克隆都不影響SHL的SUMO化帶型和強(qiáng)弱（圖6D）。以上結(jié)果表明，K111、K178和K220都不是SHL的SUMO化位點(diǎn)，SHL的SUMO化位點(diǎn)有待繼續(xù)研究。

3" " "結(jié)論與討論

EBS和SHL是一類同時(shí)含有BAH和PHD結(jié)構(gòu)域的植物特有的染色質(zhì)閱讀器蛋白，通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合H3K27me2/3和H3K4me2/3這兩類功能相互拮抗的組蛋白修飾，參與調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間［10-12］、種子休眠與萌發(fā)［13］、高溫介導(dǎo)的萌發(fā)抑制［14］、植物根的發(fā)育［15］等重要生物學(xué)過(guò)程。這些重要功能和機(jī)制的解析主要基于EBS和SHL基因缺失突變體的發(fā)現(xiàn)與表型分析、遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)、生化分析、結(jié)構(gòu)解析、轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)免疫共沉淀偶聯(lián)的高通量測(cè)序（ChIP-seq）等組學(xué)數(shù)據(jù)分析等。目前有關(guān)EBS和SHL的報(bào)道都是基于基因缺失或功能結(jié)構(gòu)域存在缺陷的證據(jù)，未見(jiàn)有蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控其功能的報(bào)道。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾通過(guò)影響蛋白質(zhì)構(gòu)象、活性、穩(wěn)定性、相互作用、亞細(xì)胞定位等方式調(diào)控蛋白功能，EBS和SHL是否存在翻譯后修飾以及這些修飾是否影響、如何影響其功能未知。前人通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)高通量篩選發(fā)現(xiàn)，SUMO E2偶聯(lián)酶SCE1與SHL能夠直接結(jié)合［17］，為SHL可能存在SUMO化修飾提供了線索。

為了探究SHL及其同源蛋白EBS是否存在SUMO化修飾，利用大腸桿菌SUMO化重建體系［18］展開(kāi)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHL和EBS都存在SUMO化修飾，且都有一條特異性SUMO化條帶，根據(jù)分子量推測(cè)二者均為單位點(diǎn)的單SUMO化修飾。進(jìn)一步通過(guò)定點(diǎn)突變結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，K216R是EBS發(fā)生SUMO化修飾的唯一關(guān)鍵位點(diǎn)，而SHL的SUMO化位點(diǎn)有待進(jìn)一步研究，但至少可以排除K111、K178和K220這3個(gè)位點(diǎn)。未來(lái)需要借助質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合定點(diǎn)突變繼續(xù)研究SHL的SUMO化位點(diǎn)。

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責(zé)任編輯" "呂榮榮

［收稿日期］" " 2024-09-27

［基金項(xiàng)目］" "河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2022205017）；河北師范大學(xué)博士基金項(xiàng)目（L2019B23）

［作者簡(jiǎn)介］" "魏建（1994- ），男，河北師范大學(xué)碩士，研究方向：SUMO化修飾。

［通信作者］" "韓永峰（1982- ），男，博士，河北師范大學(xué)副教授，研究方向：SUMO化修飾。