摘要 目的：探討舒肺壓方單煎、合煎成分特征及對肺動脈高壓的改善作用。方法：通過超高效液相色譜－質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）對舒肺壓方單煎及合煎的成分進行定性、定量分析，明確不同煎煮法對舒肺壓方成分特征的影響，并基于野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓，觀察舒肺壓方單煎及合煎對肺動脈高壓的改善作用。結(jié)果：舒肺壓方單煎液及合煎液中均檢出707種成分，單煎液與合煎液成分種類一致；其中644種成分含量無明顯差異，63種成分含量具有顯著差異；與單煎液比較，合煎液中有46種成分含量明顯上調(diào)，17種成分含量明顯下調(diào)；舒肺壓方合煎較單煎可明顯降低大鼠平均肺動脈壓，改善肺部組織病理學(xué)損傷。結(jié)論：舒肺壓方不同煎煮方式可影響其成分特征，合煎較單煎對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓的改善作用更顯著。

關(guān)鍵詞 肺動脈高壓；舒肺壓方；單煎；合煎；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.12.005

Effects of Shufeiya Decoction on Pulmonary Hypertension

JIA Zhuangzhuang， WANG Xianliang， MAO Jingyuan， WANG Shuai， CAO Yawen， WANG Lin， ZHANG Zeyu， WANG Ci

First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300381， China

Corresponding Author MAO Jingyuan， E－mail： jymao@126.com

Abstract Objective：To investigate the effects of Shufeiya single decoction and combined decoction on pulmonary hypertension.Methods：Qualitative and quantitative analyses of the components of Shufeiya decoction were performed by UPLC－MS/MS to clarify the effects of Shufeiya decoction different decoction methods on monocrotaline－induced pulmonary hypertension in rats.Results：Seven hundred and seven ingredients were detected in both Shufeiya single decoction and combined decoction，and the composition types of them were the same.The contents of 644 ingredients were not significantly different and the contents of 63 ingredients were significantly different.Compared with single decoction，the contents of 46 ingredients were significantly up－regulated and 17 ingredients were significantly down－regulated in combined decoction.Shufeiya combined decoction significantly reduced the mean pulmonary artery of pulmonary hypertension rats compared with that by single decoction，and combined decoction could significantly improved the histopathological damage of lung compared with the single decoction.Conclusion： Different decoction methods of Shufeiya decoction can affect the composition characteristics，and the combined decoction shows more significant effect on the improvement of pulmonary hypertension induced by monocrotaline in rats than that by the single decoction.

Keywords pulmonary hypertension; Shufeiya decoction; single decoction; combined decoction; pharmacodynamic material basis

肺動脈高壓以肺血管重構(gòu)、肺循環(huán)阻力增加和肺動脈壓升高（靜息時平均肺動脈壓≥25 mmHg）為特征，可導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡［1］，尤其是65歲以上人群具有較高的患病率及死亡風(fēng)險［2－4］。治療肺動脈高壓的藥物大多以舒張血管和抑制肺動脈平滑肌細胞增殖為主，其價格較貴，臨床依賴性較強［5］，中醫(yī)藥防治策略具有一定優(yōu)勢。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院毛靜遠教授根據(jù)多年臨床實踐，認為肺動脈高壓多為虛實夾雜、本虛標實，以氣陰不足為本，瘀阻肺心為標，治療當通補兼施，以養(yǎng)陰活血化瘀通脈為法，總結(jié)出臨床治療的有效方劑舒肺壓方。舒肺壓方由桔梗、丹參、紅花、山茱萸4味中藥組成，具有宣肺化瘀、養(yǎng)陰通脈之效。前期研究表明，舒肺壓方可通過調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶3（SIRT3）/叉頭蛋白O3a（FOXO3a）及其下游磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K/AKT/eNOS）、肉瘤蛋白（Ras）/胞外信號調(diào)控激酶（ERK）信號通路降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠氧化應(yīng)激水平，改善肺動脈血管重塑［6－7］，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚需進一步研究。

傳統(tǒng)中藥湯劑是體現(xiàn)中藥方劑優(yōu)勢特色的主要載體，復(fù)方中藥合煎的過程中可融合中藥的四氣五味，從而發(fā)揮復(fù)方中藥的配伍作用。復(fù)方中藥單煎與合煎在煎煮過程中成分溶出率是否有差別、是否有新物質(zhì)產(chǎn)生以及是否等效一直存在爭議［8－10］。中藥的藥用活性成分多來源于次生代謝產(chǎn)物，是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)［11］。超高效液相色譜－質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）具有專屬性強、靈敏度高及分析速度快的特點，在中藥次生代謝產(chǎn)物檢測中具有較強的優(yōu)勢［12］。本研究采用UPLC－MS/MS技術(shù)對舒肺壓方次生代謝產(chǎn)物成分進行定性、定量分析，探討舒肺壓方單煎、合煎析出成分特征及對肺動脈高壓的改善作用差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器

超高效液相色譜（UPLC）（ExionLCTMAD）及串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）（Applied Biosystems 4500 QTRAP）；色譜柱（Agilent SB－C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；微量電子天平（Mettler，MS105DU）；微量低溫離心機（Thermo，MICRO21R）。

1.1.2 主要試劑及藥材

甲醇（Merck）、乙腈（Merck）、甲酸（Alddin）均為色譜純；舒肺壓方組方：桔梗20 g，丹參15 g，紅花15 g，山茱萸15 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量230～250 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證編號為SCXK（京）2019－0010，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，所有操作符合動物倫理要求，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，室內(nèi)溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥液制備

參照中華中醫(yī)藥學(xué)會《中藥湯劑煎煮規(guī)范》［13］，舒肺壓方合煎液需將組方4味中藥加水浸過藥面3 cm，浸泡30 min，一煎采用武火加熱至沸騰后改為文火慢煎30 min，二煎武火加熱至沸騰后改為文火慢煎20 min，藥液過濾后合并濾液，低溫濃縮至400 mL；單煎液采用相同方法分別煎煮后合并藥液。

1.2.2 樣品提取

分別將單煎液及合煎液各3例樣品渦旋10 s混勻；分別取樣本200 μL，加入到對應(yīng)編號的2.0 mL離心管中；加入200 μL 70%甲醇內(nèi)標提取液，渦旋3 min；12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min；移取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，保存于進樣瓶中，用于UPLC－MS/MS檢測。

1.2.3 色譜質(zhì)譜條件

液相條件，色譜柱：Agilent SB－C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95%1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V（正離子模式）/－4 500 V（負離子模式）；離子源氣體Ⅰ、氣體Ⅱ和氣簾氣分別設(shè)置為50、60和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。三重四級桿掃描使用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，碰撞氣體為氮氣，設(shè)置為中等。通過進一步的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）優(yōu)化，完成各個MRM離子對的DP和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個時期監(jiān)測一組特定的MRM離子對。

1.2.4 代謝物定性定量

基于自建數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進行物質(zhì)定性，分析時去除了同位素信號，含K＋、Na＋、NH4＋離子的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。代謝物定量是利用MRM分析完成，其中四級桿首先篩選目標物質(zhì)的前體離子（母離子），排除掉其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得不同樣本的次生代謝物圖譜分析數(shù)據(jù)，對所有物質(zhì)色譜峰進行峰面積積分，并對其中同一次生代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正，分別得到舒肺壓方單煎液及合煎液的主要次生代謝產(chǎn)物。

1.2.5 差異組分篩選

采用MultiQuant軟件進行色譜峰的積分和校正，采用偏最小二乘法判別分析（partial least squares－discriminant analysis，PLS－DA）使單煎液及合煎液組間區(qū)分最大化［14］，分析組間數(shù)據(jù)并繪制單煎液及合煎液的得分圖，獲得變量重要性投影（variable importance in projection，VIP），篩選出單煎液及合煎液間差異的

成分。

1.2.6 動物分組及干預(yù)

將大鼠隨機分為對照組（control group）、模型組（model group）、西地那非組（sildenafil group）、單煎組（single decoction group，SD）、合煎組（combined decoction group，CD），每組10只；模型組單次腹腔注射野百合堿（60 mg/kg），誘導(dǎo)14 d建立肺動脈高壓模型；各用藥組在模型組基礎(chǔ)上灌胃給藥，單煎組、合煎組按13.5 g生藥/kg劑量分別給予舒肺壓方單煎液或合煎液，西地那非組按25 mg/kg劑量西地那非給藥，每日1次，連續(xù)給藥14 d，對照及模型組給予等容積蒸餾水。

1.2.7 觀察指標及方法

各組大鼠給藥完成后，采用1.5%三溴乙醇（0.8 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，切開頸部右半側(cè)皮膚，然后剝離頸外靜脈，并結(jié)扎其遠心端。用眼科剪朝心室方向剪出一個2～3 mm的V形開口，插入導(dǎo)管，根據(jù)多導(dǎo)生理儀所示波形，判斷導(dǎo)管所在位置，檢測大鼠平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）的變化。大鼠麻醉處死后，取左肺中上葉，用生理鹽水漂洗固定于4%的多聚甲醛72 h，將標本沿肺門做厚度為5 μm的石蠟切片，進行常規(guī)蘇木素－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間采用one－way ANOVA檢驗；兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD－t）檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)

意義。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定性考察

通過質(zhì)控（quality control，QC）樣本考察單煎液及合煎液在相同的處理方法下研究過程的重復(fù)性。QC樣本由各樣本提取物混合制備而成，質(zhì)譜檢測分析總離子流圖（total ions current，TIC）重疊展示，結(jié)果顯示，次生代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時間和峰強度均一致，表明質(zhì)譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩(wěn)定性較好，單煎、合煎藥液及研究過程具有較高的穩(wěn)定性及重復(fù)性。詳見圖1。

2.2 總成分分析

基于UPLC－MS/MS平臺及本地代謝數(shù)據(jù)庫，對單煎液及合煎液的代謝物進行質(zhì)譜定性定量分析，通過MRM代謝物多峰圖展示單煎液及合煎液中能夠檢測到的物質(zhì)，每個不同顏色的色譜峰代表檢測到的一個代謝物成分，每個色譜峰的峰面積代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量。結(jié)果顯示，單煎液檢出707種成分，合煎液檢出707種成分，單煎液及合煎液中成分種類一致；其中，黃酮類225種（31.82%），如紅花素、表兒茶素、槲皮素等；酚酸類212種（29.99%），如丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸等；生物堿類89種（12.59%），如N－阿魏酰五羥色胺、吲哚－2－甲酸、葫蘆巴堿等；萜類48種（6.79%）；木質(zhì)素和香豆素46種（6.51%），如香豆素、東莨菪內(nèi)酯、傘形酮等；醌類27種（3.82%），如丹參二醇B、羥基紅花黃色素C、隱丹參酮等；其他成分60種（8.49%），如水楊?；咸擒账?、3－甲基苯甲醛、羥苯基丁酮等。詳見圖2。舒肺壓方單煎及合煎液所含成分類別相同，但各個成分含量不同；與單煎液相比，合煎液中并無新化合物產(chǎn)生。

2.3 單煎及合煎差異成分分析

2.3.1 差異成分篩選

單煎液及合煎液差異成分篩選結(jié)果表明，各煎液組內(nèi)比較成分相對穩(wěn)定，單煎液及合煎液組間比較具有顯著差異；舒肺壓方單煎及合煎液中含有的707種成分中，644種組分無明顯差異，63種組分具有顯著差異；與單煎液比較，合煎液中有46種成分含量明顯上調(diào)，17種成分含量明顯下調(diào)。詳見圖3。

2.3.2 差異成分分析

與舒肺壓方單煎液比較，合煎液中46種上調(diào)的成分主要包括黃酮類20種、酚酸類8種、生物堿4種、木質(zhì)素和香豆素4種、醌類1種以及其他類9種，萜類成分未出現(xiàn)上調(diào)。詳見表1。合煎液中17種下調(diào)的成分包括醌類7種、黃酮類3種、酚酸類3種、萜類2種、生物堿2種，木質(zhì)素和香豆素未出現(xiàn)下調(diào)。詳見表2。

2.4 舒肺壓方單煎及合煎劑對肺動脈高壓大鼠的影響

對照組大鼠mPAP水平未見升高，肺部動脈管壁的結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)構(gòu)正常；與對照組比較，模型組mPAP明顯升高（P＜0.01），肺部動脈管壁增厚，管腔狹窄明顯；與模型組比較，西地那非組、舒肺壓單煎組及合煎組mPAP均明顯降低（P＜0.01），肺動脈管壁厚度、血管腔狹窄程度較模型組得到明顯改善，且合煎組改善程度優(yōu)于單煎組（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)沒有明確記載肺動脈高壓的病名，根據(jù)中醫(yī)運用理法方藥對類似癥狀、疾病預(yù)后的記載及胸悶、氣促、乏力、呼吸困難等臨床表現(xiàn)，多將其歸屬為“喘證”“肺脹”“咳嗽”等范疇，大多以“肺脹”立論。中藥具有多組分、多靶點、多機制的作用優(yōu)勢，其處方整體及其組分的差異效應(yīng)逐漸受到關(guān)注。肺動脈高壓基本病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛以氣陰不足為主，肺氣虛是其根本；標實以痰濁、水飲、血瘀等為主，痰濁、血瘀是其發(fā)展的主要病理產(chǎn)物，易阻塞肺絡(luò)，引起氣血運行不暢，肺循環(huán)受阻，導(dǎo)致肺絡(luò)結(jié)構(gòu)功能發(fā)生相應(yīng)改變，表現(xiàn)出血管痙攣、收縮、重構(gòu)等病理特征。舒肺壓方中桔梗宣肺祛痰，丹參活血祛瘀，紅花活血通經(jīng)，山茱萸補益肝腎，諸藥共奏宣肺化瘀、養(yǎng)陰通脈之效，可有效改善肺動脈高壓病人的臨床癥狀。丹參包含的二萜類和酚酸類化合物具有較強的抗氧化及抗炎活性［15－19］，可改善肺動脈高壓炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷；桔?？梢种坡詺獾罁p傷，降低肺泡隔厚度，改善心肺的多種病理變化［20］；紅花中的紅花色素、紅花苷，可上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制丙二醛（MDA）及活性氧（ROS）積累，調(diào)控一氧化氮（NO）水平，改善血管舒縮功能［21－23］；山茱萸中的有機酸及其相應(yīng)有機酯類、五環(huán)三萜酸及鞣質(zhì)等，可調(diào)控Ras、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p－ERK1/2）及核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）信號通路，增加過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）及谷胱甘肽（glutathione，GSH）的活性，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）水平［24－25］。

中藥煎出成分是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥復(fù)方合煎是中藥方劑臨床的常規(guī)煎煮法，將復(fù)方中的不同藥味分別單煎混合，其煎出成分是否相同是中醫(yī)藥研究關(guān)注的問題之一。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，不同成分在共煎過程中可能產(chǎn)生多種相互作用，使得合煎時成分的量效并不是單煎時各成分的簡單疊加［26－28］。中藥在共同煎煮時可能相互之間的溶解度發(fā)生變化，使得有效成分的溶出率產(chǎn)生差異，從而影響復(fù)方中藥的臨床療效［29］。此外，共同煎煮也可能因藥物之間相互作用發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生新的化合物。

本研究結(jié)果表明，舒肺壓方單煎液及合煎液中均含有707種次成分，合煎液中未見新化合物產(chǎn)生，說明舒肺壓方單煎液與合煎液在整體化學(xué)成分組成上無明顯差異；與單煎液相比，舒肺壓方合煎時有46種成分明顯上調(diào)，如山柰酚－7－O－鼠李糖苷、紅花素、鞣質(zhì)等；17種成分明顯下調(diào)，如丹參酮Ⅰ、丹酚酸G等，其中鞣質(zhì)含量明顯上調(diào)可能是在合煎過程中加速了酚酸及其衍生物與葡萄糖或多元醇通過甙鍵或酯鍵而導(dǎo)致；而合煎時醌類化合物含量明顯下降，如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、5－羥基－2－羧基蒽醌等，因醌類化合物在酸性條件下易水解，生成苷元和糖，苷元不溶或難溶于水，而舒肺壓方合煎時，山茱萸中富含的沒食子酸、蘋果酸、酒石酸等有機酸可能加劇醌類化合物水解及轉(zhuǎn)化［30］。煎煮方式不同不僅造成舒肺壓方成分特征發(fā)生改變，其藥效也表現(xiàn)出差異，合煎液對肺動脈高壓具有更顯著的改善作用，可明顯降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的mPAP水平，改善肺部組織病理學(xué)變化。

中藥復(fù)方單煎與合煎析出成分的差異，不能簡單地以某些指標性成分的溶出率而論，而應(yīng)該從復(fù)方整體藥效學(xué)等相關(guān)資料，綜合評價單煎及合煎的成分特征及作用效果。中藥復(fù)方由多種不同的中藥組成，各味中藥及其組分之間的相互作用亦不一，故不可依據(jù)特定組方下單煎與合煎的異同代表中藥復(fù)方煎煮法對析出成分及臨床療效的影響。本研究通過UPLC－MS/MS技術(shù)對舒肺壓方單煎液及合煎液中成分進行定性、定量分析，并分別干預(yù)野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠，表明舒肺壓方不同煎煮方式可影響其成分特征及藥效，舒肺壓方合煎對肺動脈高壓的改善作用優(yōu)于單煎，為其臨床合理應(yīng)用及進一步研究提供了參考，同時也為中藥復(fù)方的合理煎煮提供一定的科學(xué)依據(jù)，但不能整體說明單煎及合煎孰優(yōu)孰劣的問題。

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（收稿日期：2022－12－11）

（本文編輯王麗）

基金項目 國家中醫(yī)藥管理局2022年度中醫(yī)藥創(chuàng)新團隊及人才支持計劃項目（No.ZYYCXTD－C－202203）；天津市衛(wèi)生健康委員會、天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研項目（No.2021048）

通訊作者 毛靜遠，E－mail：jymao@126.com

引用信息 賈壯壯，王賢良，毛靜遠，等.舒肺壓方單煎與合煎的成分差異及對肺動脈高壓的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（12）：2142－2149.