陳小軍+邢銀花+陳其章+王紅娟

【摘要】 目的 探討法舒地爾對(duì)肺動(dòng)脈高壓（PAH）血管重塑中ROCK及內(nèi)皮素-1（ET-1）活性的干預(yù)作用。方法 42只大鼠， 隨機(jī)分為空白對(duì)照組（C組， 7只）、PAH模型組（P組， 7只）、生理鹽水組（NS組， 14只）、法舒地爾組（ROCK組， 14只）。注射野百合堿建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型， ROCK組于第28天開(kāi)始注射法舒地爾， 治療4周；P組無(wú)干預(yù)；NS組注射生理鹽水。干預(yù)結(jié)束后測(cè)量、觀(guān)察各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果 ROCK組和指標(biāo)與其他組相比， 干預(yù)效果明顯較好（P<0.05）。結(jié)論 法舒地爾在肺動(dòng)脈高壓血管收縮和重建中可有效抑制ROCK， 并降低ET-1活性， 有效降低肺動(dòng)脈壓力。

【關(guān)鍵詞】 法舒地爾；肺動(dòng)脈高壓；血管重塑

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.21.159

PAH是心血管常見(jiàn)疾病之一， 是因?yàn)榉窝艿脑錾爸貥?gòu)導(dǎo)致肺血管阻力進(jìn)行性增高的致命性疾病。以往研究證明ROCK信號(hào)通路參與了肺血管的收縮和重建， 但是PAH確切的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。本研究力求進(jìn)一步明晰法舒地爾在肺血管的收縮和重建中的作用和作用機(jī)理， 提高對(duì)肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的理解， 希望能為預(yù)防和治療肺動(dòng)脈高壓提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料 清潔級(jí)健康雄性Sprague—DaWley大鼠42只， 體重180～248 g， 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后， 隨機(jī)分為C組7只、P組7只、NS組14只、ROCK組14只。

1. 2 肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的建立及干預(yù) 將野百合堿（Sigma公司， 美國(guó)）溶解于1 mol/L稀鹽酸溶液， 以1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至pH7.2， 最后用生理鹽水配制成1%溶液， 在大鼠頭頸部皮下一次性注射野百合堿50 mg/kg。4周后野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型建立成功， 即P組；C組給予普通飼料喂養(yǎng)， 自由進(jìn)食飲水。NS組于腹腔注射等體積生理鹽水， 直至第8周末；ROCK組于第28天開(kāi)始腹腔注射法舒地爾（日本旭化成制藥株式會(huì)社， 國(guó)藥準(zhǔn)字H20050331， 產(chǎn)品生產(chǎn)批號(hào)：ERSllMM）15 mg/（kg·d）至第8周末。

1. 3 方法 ①大鼠肺動(dòng)脈平均壓（mPAP）的測(cè)定：注射野百合堿后第4、8周末各自停止用藥2 d， 以10%水合氯醛30 ml/kg

腹腔內(nèi)注射麻醉， 采用右心導(dǎo)管測(cè)壓方法經(jīng)右頸外靜脈插管至肺動(dòng)脈和右心室， 肝素化后用RM-6240B/C多導(dǎo)電生理記錄儀（成都儀器廠(chǎng)）測(cè)定mPAP；②組織學(xué)觀(guān)察：留取肺組織， 備提取蛋白。固定于10%中性福爾馬林溶液中2 d， 常規(guī)處理， 備用于HE染色和ROCK蛋白免疫組化。測(cè)定直徑75～150 μm的肺動(dòng)脈血管壁厚度占血管外徑的百分比（WT%）及管壁面積占血管總面積的百分比（WA%）；③免疫組化分析肺組織中ROCK蛋白表達(dá)；④提取蛋白及免疫印跡（Western blot）半定量分析ROCK-1、pMYPT-1及MYPT-1蛋白表達(dá)；⑤半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)mRNA表達(dá)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①大鼠基本情況：大鼠于注射野百合堿后第21天左右逐漸出現(xiàn)進(jìn)食、飲水減少、毛發(fā)枯燥、體質(zhì)下降、活動(dòng)減少等癥狀， 至第8周末情況更加嚴(yán)重， 甚至出現(xiàn)右心衰竭和死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， C組、P組大鼠均存活， NS組存活4只（4/14）， ROCK組存活11只（11/14）。ROCK組與NS組相比， 動(dòng)物死亡比率較低（P<0.05）， 大鼠基本情況明顯較好。②mPAP：注射野百合堿后第4周末， C組為（20.3±1.8）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）， P組為（36.2±2.4）mm Hg， P組顯著高于C組（P<0.05）， 表明肺動(dòng)脈高壓建模成功。第8周末， NS組為（39.7±1.8）mm Hg， ROCK組為（26.2±2.3）mm Hg， NS組進(jìn)一步高于P組， 但ROCK組顯著低于NS組（P<0.05）。③大鼠肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀(guān)察：C組、P組、NS組、ROCK組WT%分別為（13.3±3.4）%、（25.6±5.3）%、（28.2±4.4）%、（15.6±2.8）%；WA%分別為（38.4± 2.8）%、（60.3±2.5）%、（68.8±1.6）%、（40.3±2.8）%。C組大鼠肺小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)、均勻的分布， 大小一致， 厚薄一致， 血管壁沒(méi)有增厚， 血管腔沒(méi)有狹窄。P組內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性變差， 中層平滑肌細(xì)胞肥大、排列混亂， 血管腔狹窄明顯， WT%與WA%明顯高于C組， NS組進(jìn)一步高于C組， ROCK組明顯低于NS組（P<0.05）， 病變較輕。④ROCK-l蛋白表達(dá)水平：C組陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)（7.2±0.1）， P組為（17.4±0.2）， NS組為（20.6±0.2）， ROCK組為（12.3±0.1）。P組和NS組ROCK-l蛋白表達(dá)水平明顯高于C組， 但ROCK組表達(dá)水平明顯低于NS組（P<0.05）。⑤mRNA表達(dá)：C組mRNA表達(dá)量為（1.1±0.2）， P組為（1.6±0.1）， P組顯著高于C組， NS組為（1.6±0.3）， ROCK組為（1.2±0.1）， ROCK組顯著低于NS組（P<0.05）。⑥ET-1活性：C組、P組、NS組、ROCK組ET-1分別為（1.1±0.3）、（1.8±0.2）、（2.3±0.6）、（1.9±0.3）， P組較C組明顯升高， NS組進(jìn)一步高于P組， 但ROCK組較NS組顯著下降。

3 討論

野百合堿可引發(fā)肺血管重構(gòu)和內(nèi)膜損傷， 導(dǎo)致PAH， 與人類(lèi)PAH發(fā)病機(jī)制相似， 由其引發(fā)的PAH大鼠是比較理想的動(dòng)物模型。野百合堿誘發(fā)的PAH大鼠ROCK-1蛋白表達(dá)顯著增多， 且比肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)要多， 血管壁厚度增加， 管腔更狹窄， 本研究發(fā)現(xiàn)， 法舒地爾治療肺動(dòng)脈高壓可使大鼠mPAP 降低， 右心室肥厚減輕， ROCK-l蛋白表達(dá)水平下降， 通過(guò)抑制ROCK-l活性， 平衡內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌ET-1水平， 進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)皮介導(dǎo)的血管重建效應(yīng)， 改善血管持續(xù)收縮， 改善PAH癥狀。

綜上所述， 法舒地爾在PAH血管收縮和重建中可抑制ROCK， 并降低ET-1活性， 有效降低肺動(dòng)脈壓力， ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究將成為PAH發(fā)病機(jī)制研究的新方向。

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[收稿日期：2016-04-28]