摘 要：本文采用高效液相色譜-柱后衍生法中光化學衍生測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量。結(jié)果表明，樣品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量分別為（0.873±0.039） μg·kg-1、（0.227±0.011） μg·kg-1、（0.811±0.054） μg·kg-1和（0.214±0.014） μg·kg-1，（k=2）。通過系統(tǒng)分析整個測定過程的影響因素，評估不確定度來源，對各個不確定度分量進行評定，可以看出對測量結(jié)果影響較大的是測量重復(fù)性、標準溶液配制引入的不確定度，而對測量結(jié)果影響較小的是樣品稱量、樣品處理后所定容的體積和標準曲線的擬合。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）；不確定度；黃曲霉毒素；食品

Uncertainty Evaluation for The Measurement of Aflatoxins in Foods Using High Performance Liquid Chromatography with Post Column Photochemical Derivatization

LI Junwei， LU Dixun， SU Junmei， YANG Jing， CHEN Hanfeng， LIU Chunli*

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： High performance liquid chromatography （HPLC）-post column photochemical derivatization was used to determine the content of aflatoxins B1， B2， G1， G2 in food. The results indicate that when the contents of aflatoxins B1， B2， G1 and G2 in the test samples are （0.873±0.039） μg·kg-1， （0.227±0.011） μg·kg-1，（0.811±0.054） μg·kg-1 and

（0.214±0.014） μg·kg-1， （k=2）， respectively. By systematically analyzing the influencing factors throughout the determination process， assessing the sources of uncertainty， and evaluating each component of uncertainty， it was found that the measurement repeatability and the uncertainty introduced by the preparation of standard solutions have a significant impact on the measurement results， while the impact of sample weighing， the volume after sample treatment and final volume， and the fitting of the standard curve on the measurement results is relatively minor.

Keywords： high performance liquid chromatography （HPLC）; uncertainty; aflatoxins; food

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是一類具有相似結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的真菌次級代謝產(chǎn)物，它們是自然界中發(fā)現(xiàn)的理化性質(zhì)較穩(wěn)定的一類霉菌毒素。它們的分子量在312～346，熔點在200～300 ℃。黃曲霉毒素在水中、乙醚、己烷和石油醚中難以溶解，但易溶于甲醇、乙醇、乙腈和氯仿等有機溶劑。黃曲霉毒素對光、熱和酸穩(wěn)定，具有耐熱性，因此傳統(tǒng)的加熱處理對其破壞很小，其只在熔點溫度下才會分解。黃曲霉毒素在中性溶液、弱酸性溶液中非常穩(wěn)定，在pH值為1～3的酸性溶液中略有分解，在pH值為9～10的堿性溶液中會迅速分解，成為接近無毒的鹽，但這種分解反應(yīng)是可逆的，即在酸性條件下可以復(fù)原[1]。

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌代謝產(chǎn)生的一類強效生物毒素，它們會對人類健康構(gòu)成嚴重威脅，特別是對肝臟和腎臟的損害尤為顯著。黃曲霉毒素常見類型根據(jù)毒性大小排列依次為B1、M1、G1、B2和G2，其中B1被國際癌癥研究機構(gòu)分類為I類致癌物。黃曲霉毒素可以在農(nóng)作物生長、收獲、干燥、加工和儲存中的任何階段污染食物，因此大豆、花生、大米、玉米和食用植物油等農(nóng)產(chǎn)品很容易被黃曲霉毒素污染，從而直接進入食物鏈。人們食用被黃曲霉毒素污染的食品可導(dǎo)致急性中毒，引起肝臟壞死和出血，長期慢性中毒可誘發(fā)肝癌。由于黃曲霉毒素的高毒性和穩(wěn)定性，它們在全球食品安全和人類健康領(lǐng)域被重點關(guān)注[2-3]。

測量不確定度是表征測量結(jié)果可信程度的一個參數(shù)，它反映了測量結(jié)果的可變性或分散性。評定測量結(jié)果的不確定度，有助于發(fā)現(xiàn)測量過程中的主要誤差來源，進而可以采取適當?shù)拇胧?，以提升測量的準確性和可信度。本實驗按照《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》

（GB 5009.22—2016）[4]第三法高效液相色譜-柱后衍生法中光化學衍生測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量，遵循《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]的方法程序，對檢測過程中的測量不確定度進行評估，旨在提升測量結(jié)果的可信度與準確性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈，均為色譜純，德國默克公司；氯化鈉、氯化鉀，均為分析純，廣州化學試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、吐溫-20，均為分析純，德國默克公司；黃曲霉毒素混合標準溶液，美國羅默實驗室公司；水符合《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》（GB/T 6682—2008）中規(guī)定的一級水。

Waters Premier 2475高效液相色譜儀配熒光檢測器，美國沃特世公司；液相色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國安捷倫公司；XP205 Mettler Toledo分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；Pribolab KRC光化學衍生器，青島普瑞邦生物工程有限公司；IKA LAB DANCER S25渦旋混合器，德國艾卡公司；Milli-Q? IQ 7000超純水系統(tǒng)，德國默克公司；QSC-12T氮吹儀，上海雙旭電子有限公司；Agela Technologies BAC09001-3-X免疫親和柱，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

根據(jù)《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）第三法高效液相色譜-柱后衍生法中的前處理要求進行。

1.2.2 色譜條件

流動相：A相為水（68%）；B相為甲醇-乙腈（50+50）（32%），等度洗脫；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：50 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.2.3 數(shù)學模型

樣品中黃曲霉毒素的計算公式為

（1）

式中：Xi為樣品中黃曲霉B1、B2、G1或G2的含量，μg·kg-1；P為樣品中黃曲霉B1、B2、G1和G2根據(jù)外標法在標準曲線中對應(yīng)的濃度，ng·mL-1；V1為試樣提取液體積，mL；V2為樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，mL；V3為用于免疫親和柱的分取樣品體積，mL；V4為濾液的定容體積，mL；

V5為用于定容的提取液體積，mL；m為樣品稱樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線擬合和標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度

2.1.1 標準溶液濃度和峰面積擬合標準曲線引入的標準不確定度

配制不同濃度的系列標準溶液，并分別通過色譜儀進樣分析后得到對應(yīng)峰面積，用最小二乘法對數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，擬合得到直線方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

校準曲線為A=bc+a，則標準曲線擬合引入的標準不確定度計算公式為

（2）

（3）

式中：s為標準溶液峰面積的殘差的標準差；b為回歸直線方程的斜率；a為回歸直線方程的截距；n為標準溶液的測定次數(shù)；p為用于計算樣品溶液濃度c0的測定次數(shù)；c0為由擬合校準曲線求得的樣品溶液的平均濃度，ng·mL-1；Aj為校準時第j次的標準溶液峰面積；cj為校準時第j次的標準溶液濃度，ng·mL-1；為標準工作液的平均濃度，ng·mL-1。

由AFTB1校準曲線計算得出6次樣品平均濃度為c0=1.133 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標準曲線得出s=6 722.15；=72.6；b=1 204 497.64；a=-1 686.152，則AFTB1 c0引入的標準不確定度為

AFTB1 c0引入的相對標準不確定度為

根據(jù)AFTB2校準曲線計算得出6次樣品平均濃度為c0=0.294 4 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標準曲線得出s=6 050.48；=4.6；b=2 474 866.22；a=4 550.51，則AFTB2 c0引入的標準不確定度為

AFTB2 c0引入的相對標準不確定度為

根據(jù)AFTG1校準曲線計算得出6次樣品平均濃度為c0=1.052 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標準曲線得出s=3 208.32；=73.3；b=434 189.25；a=

2 287.88，則AFTG1 c0引入的標準不確定度為

AFTG1 c0引入的相對標準不確定度為

根據(jù)AFTG2校準曲線計算得出6次樣品平均濃度為c0=0.277 4 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標準曲線得出s=3 677.58；=4.6；b=1 152 564.81；a=3 135.37，則AFTG2 c0引入的標準不確定度為

AFTG2 c0引入的相對標準不確定度為

2.1.2 標準工作溶液配制引入的標準不確定度

（1）標準物質(zhì)引入的不確定度評定。黃曲霉毒素標準品濃度及擴展不確定度如表2所示。其中，包含因子k=2，為B類評定，各組分標準工作溶液配制引入的標準不確定度為

AFTB1：

AFTB1：

AFTG1：

AFTG2：

根據(jù)各組分濃度，得到標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度為

AFTB1：

AFTB2：

AFTG1：

AFTG2：

表2 黃曲霉毒素標準品濃度及擴展不確定度

組分 濃度/（μg·mL-1） 擴展不確定度/（μg·mL-1）

AFTB1 2.00 0.03

AFTB2 0.504 0.007

AFTG1 2.01 0.03

AFTG2 0.504 0.007

（2）標準工作液配制過程量器校準引入的標準不確定度。①標準工作液配制中使用了50 mL單標線容量瓶，準確度A級，按照《常用玻璃量器》（JJG196—2006）[6]的要求，容量允差為±0.050 mL，依照三角分布考慮，k=，計算容量允差引入的標準不確定度為u（V1）=0.020 4 mL，則容量允差引入的相對標準不確定度為urel（V1）=0.000 408。②使用0.5 mL移液器，根據(jù)移液器的校準證書，擴展不確定度為0.003（k=2），則移液器引入的相對標準不確定度為urel（V2）=0.001 5。量器校準引入的相對標準不確定度為

（3）標準工作液配制過程溫度變化引入的標準不確定度[7]。溫差變化會導(dǎo)致測量結(jié)果不準確。從量具生產(chǎn)商提供的信息可知，該量具在20 ℃處有校準，實驗室的溫度變化在±3 ℃，要想估算溫差對不確定度的影響，需要考慮溫度范圍和體積膨脹系數(shù)。乙腈的體積膨脹系數(shù)是1.37×10-3 ℃-1，按照溫度變化是矩形分布的設(shè)定來計算標準不確定度。根據(jù)表3數(shù)據(jù)計算，標準工作液配制過程溫度變化引入的相對標準不確定度為

綜上，AFTB1標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度為

AFTB2標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度為

AFTG1標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度為

AFTG2標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度為

2.2 樣品稱量m引入的相對標準不確定度

分析天平供應(yīng)商提供的稱量誤差為±0.08 mg，假設(shè)是矩形分布，樣品稱量引入的標準不確定度為

樣品的稱重m=5 000 mg，則樣品稱量引入的相對標準不確定度為

2.3 樣品處理后的總體積V引入的相對標準不確定度

2.3.1 體積校準引入的相對標準不確定度

樣品稱取后加入40 mL乙腈水溶液振蕩提取，過濾后取10 mL定容至50 mL。再取20 mL過免疫親和柱，氮吹至干后加入0.4 mL定容液復(fù)溶。根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG196—2006），同時容量瓶按三角分布考慮，移液管按矩形分布考慮，由此估算體積校準引入的相對標準不確定度分量，見表4。

2.3.2 溫度變化引入的相對標準不確定度

從量具生產(chǎn)商提供的信息可知，量具在20 ℃處有校準，實驗室的溫度變化在±3℃。乙腈的體積膨脹系數(shù)是1.37×10-3 ℃-1，按照溫度變化是矩形分布的設(shè)定來計算相對標準不確定度，見表5。

綜上，樣品處理后黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的總體積引入的相對標準不確定度均為

2.4 測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度

實驗結(jié)果的重現(xiàn)性主要取決于實驗人員在樣品處理上的統(tǒng)一性，樣品自身的均勻性和儀器的性能。這類不確定度歸類為A類，通過同一樣品重復(fù)測試進行評估。黃曲霉毒素重復(fù)性檢測見表6。

AFTB1的單次測量結(jié)果的標準偏差按sx=

公式計算，sx=0.042 4。

AFTB1測量重復(fù)性引入的標準不確定度為

AFTB1測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為

AFTB2測量重復(fù)性引入的單次測量結(jié)果的標準偏差sx=0.011 8，則AFTB2測量重復(fù)性引入的標準不確定度為

AFTB2測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為

AFTG1的單次測量結(jié)果的標準偏差sx=0.062 7，AFTG1測量重復(fù)性引入的標準不確定度為

AFTG1測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為

AFTG2測量重復(fù)性引入的單次測量結(jié)果的標準偏差sx=0.015 5，AFTG2測量重復(fù)性引入的標準不確定度為

AFTG2測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為

2.5 合成標準不確定度評定

AFTB1的標準不確定度各分量匯總見表7，AFTB2、AFTG1、AFTG2標準不確定度各分量匯總方式和合成同AFTB1，下文不再贅述。

AFTB1的合成相對標準不確定度為

AFTB2的合成相對標準不確定度為

AFTG1的合成相對標準不確定度為

AFTG2的合成相對標準不確定度為

則合成標準不確定度為

AFTB1：uc（X）=urel（X）×=0.022 6×0.873=0.019 73 μg·kg-1

AFTB2：uc（X）=urel（X）×=0.024 1×0.227=0.005 471 μg·kg-1

AFTG1：uc（X）=urel（X）×=0.033 6×0.811=0.027 25 μg·kg-1

AFTG2：uc（X）=urel（X）×=0.032 0×0.214=0.006 848 μg·kg-1

2.6 擴展不確定度評定

將合成標準不確定度乘以包含因子得到擴展不確定度，依據(jù)統(tǒng)計學原理，當置信概率設(shè)定為95%，包含因子k=2，所以食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量測定的擴展不確定度為

AFTB1：U=uc（X）×k=0.019 73×2=0.039 μg·kg-1

AFTB2：U=uc（X）×k= 0.005 471×2=0.011 μg·kg-1

AFTG1：U=uc（X）×k=0.027 25×2=0.054 μg·kg-1

AFTG1：U=uc（X）×k= 0.006 848×2=0.014 μg·kg-1

2.7 測量不確定度結(jié)果

食品中AFTB1測量結(jié)果為（0.873±0.039） μg·kg-1，

k=2。

食品中AFTB2測量結(jié)果為（0.227±0.011） μg·kg-1，

k=2。

食品中AFTG1測量結(jié)果為（0.811±0.054） μg·kg-1，

k=2。

食品中AFTG2測量結(jié)果為（0.214±0.014） μg·kg-1，

k=2。

3 結(jié)論

應(yīng)用高效液相色譜-柱后衍生法中光化學衍生測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量，通過系統(tǒng)分析整個測定過程的影響因素，評估不確定度來源，對各個不確定度分量予以評定，發(fā)現(xiàn)對測量結(jié)果影響較大的是測量重復(fù)性、標準溶液的配制引入的不確定度，而對測量結(jié)果影響較不明顯的是樣品的稱量、樣品處理后所定容的體積、標準曲線的擬合。所以，在實驗過程中，可以通過適當增加平行實驗次數(shù)、充分混勻樣品、選用精度高且允差小的量具量器配制標準溶液等手段降低不確定度，提高測量結(jié)果的準確性和可信度。

參考文獻

[1]吳兆蕃.黃曲霉毒素的研究進展[J].甘肅科技，2010，26（18）：89-93.

[2]于澤，張凱淇，王毅，等.黃曲霉毒素的危害及預(yù)防[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2022（15）：76-78.

[3]勞文艷，林素珍.黃曲霉毒素對食品的污染及危害[J].北京聯(lián)合大學學報（自然科學版），2011，25（1）：64-69.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定：GB 5009.22—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJF1059.1—2012[S].北京：中國質(zhì)檢出版社，2012.

[6]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器：JJG196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

[7]陳夢，鄒小龍，范蕾，等.高效液相色譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1含量的不確定度評定[J].分析測試技術(shù)與儀器，2020，26（1）：71-75.