摘要：為探究耿馬酸肉加工過程中生物胺和致病菌的變化，將傳統(tǒng)耿馬酸肉在25 ℃下發(fā)酵，取0，2，4，6 d樣品檢測(cè)生物胺、致病菌、主要理化指標(biāo)和游離氨基酸，分析生物胺與各指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，耿馬酸肉中共檢測(cè)出組胺、尸胺、腐胺、酪胺、苯乙胺、精胺、亞精胺和色胺8種生物胺，在發(fā)酵第6天時(shí)，生物胺總量為310.50 mg/kg，大約是限量值的1/3，酪胺含量最高，為118.14 mg/kg，已超過推薦的安全值（100 mg/kg），尸胺次之，為85.55 mg/kg。在整個(gè)發(fā)酵過程中均檢測(cè)到大腸菌群，最高為5.28 lg CFU/g；金黃色葡萄球菌均小于10 CFU/g；沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均未檢出。大腸菌群、亞硝酸鹽殘留量、pH和NaCl含量與大多數(shù)生物胺具有顯著相關(guān)性；腐胺、尸胺、酪胺、精胺、生物胺總量與多種游離氨基酸呈極顯著正相關(guān)。生食耿馬酸肉可能存在大腸菌群和酪胺中毒的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：耿馬酸肉；生物胺；致病菌；理化指標(biāo)；游離氨基酸

中圖分類號(hào)：TS251.7 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)：1000-9973（2024）09-0023-06

Changes of Biogenic Amines and Pathogenic Bacteria in

Fermentation Process of Gengma Sour Meat

WU Chun-xia1， YANG Yan1，2， CHEN Tao1*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，

China; 2.School of Tourism， Kunming University， Kunming 650214， China）

Abstract： To explore the changes of biogenic amines and pathogenic bacteria during processing of Gengma sour meat， traditional Gengma sour meat is fermented at 25 ℃， 0， 2， 4， 6 d samples are taken to detect biogenic amines， pathogenic bacteria， main physicochemical indexes and free amino acids， and the correlation between biogenic amines and various indexes is analyzed. The results show that a total of eight biogenic amines are detected in Gengma sour meat， including histamine， cadaverine， putrescine， tyramine， phenethylamine， spermine， spermidine and tryptamine.On the 6th day of fermentation， the total content of biogenic amines is 310.50 mg/kg， about 1/3 of the limit value， and tyramine content is the highest of 118.14 mg/kg， exceeding the recommended safety value （100 mg/kg）， followed by cadaverine， which is 85.55 mg/kg. Coliforms is detected in the whole fermentation process， and the highest content is 5.28 lg CFU/g.The content of Staphylococcus aureus is all less than 10 CFU/g. Salmonella and Listeria monocytogenes are not detected. Coliforms， nitrite residue amount， pH and NaCl content are significantly correlated with most biogenic amines." There is a highly significant positive correlation between putrescine， cadaverine， tyramine， spermine， the total content of biogenic amines and a variety of free amino acids. Eating raw Gengma sour meat may pose a risk of Coliforms and tyramine poisoning.

Key words： Gengma sour meat; biogenic amines; pathogenic baccteria; physicochemical indexes; free amino acids

收稿日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研發(fā)展基金項(xiàng)目（KX900127000）

作者簡(jiǎn)介：吳春霞（1998—），女，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工與品質(zhì)控制。

*通信作者：陳韜（1963—），男，教授，博士，研究方向：畜產(chǎn)品加工與品質(zhì)控制。

中國(guó)傳統(tǒng)酸肉流行于我國(guó)貴州、重慶、云南、廣西、湖南等少數(shù)民族地區(qū)，是一種距今已有兩千多年歷史的民間傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品[1]。耿馬酸肉是云南省臨滄市耿馬傣族佤族自治縣傳統(tǒng)特色肉制品，由新鮮的豬瘦肉、熟豬皮條、檽米飯、硝酸鹽、食鹽、味精混勻后用柊葉包裹發(fā)酵2～6 d而成，常以生食為主，也可加熱后食用。耿馬酸肉可常年進(jìn)行加工，發(fā)酵溫度較高，一般冬季8～23 ℃，夏季20～29 ℃。與耿馬傣族佤族自治縣相鄰的老撾和泰國(guó)也有類似的產(chǎn)品，如老撾的“Som Mou”[2]、泰國(guó)的“Nham”[3]和“Mhom”[4]。近年來，酸肉中的生物胺和致病菌備受關(guān)注。在30 ℃下發(fā)酵5 d的Nham，生物胺總量和酪胺含量分別為669.12，102.66 mg/kg[5]。李廷任等[6]測(cè)定了市售的4種酸肉，發(fā)現(xiàn)生物胺總量最高為4 687.37 mg/kg，酪胺含量最高為110.33 mg/kg，組胺含量為83.30 mg/kg。有學(xué)者認(rèn)為酸肉中的組胺可接受范圍為≤50 mg/kg[7]，酪胺含量和生物胺總量的可接受范圍分別為≤100 mg/kg和≤1 000 mg/kg[5]。目前，有關(guān)傳統(tǒng)耿馬酸肉在發(fā)酵過程中生物胺和致病菌的變化鮮有報(bào)道。因此，本文以傳統(tǒng)耿馬酸肉為研究對(duì)象，初步探究耿馬酸肉在整個(gè)發(fā)酵階段生物胺的變化，以及生物胺與游離氨基酸、大腸菌群和主要理化指標(biāo)之間的關(guān)系，旨在闡明影響生物胺形成的因素，以期進(jìn)一步開發(fā)耿馬酸肉并提高其安全性。

1 材料和方法

1.1 材料

耿馬酸肉樣品取自云南省臨滄市耿馬縣最具代表性的手工作坊。將新鮮的豬瘦肉剁碎，熟豬皮切成條，加入適量的糯米飯、硝酸鹽、味精、食鹽，混勻后用柊葉包裹，每包大約200 g（20 cm×4 cm×2 cm），放入裝有干冰的泡沫箱中運(yùn)到學(xué)校。于25 ℃下發(fā)酵，并分別在第0，2，4，6天取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，樣品重復(fù)數(shù)為4。

1.2 試劑

組胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、色胺、酪胺（純度均≥98%）：南通飛宇生物科技有限公司；天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸（純度均≥99%）：美國(guó)Sigma公司；衍生試劑盒：美國(guó)Waters公司；甲醇、乙晴、甲酸、磺基水楊酸、檸檬酸三鈉（均為分析純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；鹽酸（分析純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、賴氨酸脫酸酶肉湯培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂基礎(chǔ)2號(hào)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LB1、LB2增菌肉湯培養(yǎng)基、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Vanquish超高壓液相色譜儀、Q Exactive質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；5430R低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Tissuelyser-48組織破碎儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Biochrom 30+氨基酸自動(dòng)分析儀 英國(guó)Biochrom公司；HD-3A智能水分活度測(cè)定儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；A60紫外可見分光光度計(jì) 翱藝儀器（上海）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 主要理化指標(biāo)

亞硝酸鹽的測(cè)定：參照GB 5009.33—2016中的分光光度法；pH值的測(cè)定：參照GB 5009.237—2016中的方法；水分活度（activity of water，Aw）的測(cè)定：參照GB 5009.238—2016中的水分活度儀擴(kuò)散法；NaCl的測(cè)定：參照GB 5009.44—2016中的電位滴定法；水分的測(cè)定：參照GB 5009.3—2016中的直接干燥法。

1.4.2 致病菌

大腸菌群的測(cè)定：參照GB 4789.3—2016中的大腸菌群平板計(jì)數(shù)法；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的測(cè)定：參照GB 4789.30—2016中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)；金黃色葡萄球菌的測(cè)定：參照GB 4789.10—2016中的金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法；沙門氏菌的測(cè)定：參照GB 4789.4—2016中的方法。

1.4.3 游離氨基酸

參考Zhong 等[8]的方法并稍作修改。取2 g耿馬酸肉，加純水均質(zhì)后移至50 mL容量瓶中，加純水定容至刻度，混勻，于4 ℃靜置24 h。取20 mL上清液于50 mL離心管中，加入20 mL 5%磺基水楊酸溶液，混勻，于4 ℃、6 000 r/min下離心10 min，取20 mL上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液溶解后用0.45 μm濾膜過濾，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.4.4 生物胺

參考Guba等[9]和Armenta等[10]的方法并稍作修改。取0.1 g耿馬酸肉于離心管中，加入0.5 mL 0.1 mol/L鹽酸，渦旋混勻，室溫下提取1 h；于4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液，稀釋3倍；取10 μL樣品于2 mL EP管中，加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate緩沖液和20 μL AccQ·Tag試劑，混勻；將混合物于55 ℃金屬加熱器上加熱10 min，冷卻至室溫，用超高壓液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。儀器參數(shù)：Water BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm×1.7 μm），柱溫55 ℃；進(jìn)樣量1 μL，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相A：超純水（含0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈（含0.1%甲酸），洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），鞘氣40 arb；輔助氣10 arb；離子噴霧電壓3 000 V；溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；掃描模式為全掃描，掃描方式為正離子，掃描范圍為150～700 Da。

生物胺的梯度洗脫程序見表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0進(jìn)行方差分析和皮爾遜相關(guān)性分析，采用Origin 2021進(jìn)行繪圖，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 主要理化指標(biāo)和致病菌

由圖1中A可知，NaCl含量呈顯著上升趨勢(shì)，水分含量呈顯著下降趨勢(shì)，這是由于NaCl使細(xì)胞脫水，汁液外泄[11]。由圖1中B可知，耿馬酸肉的pH與Aw均逐漸降低，pH的降低主要與乳酸菌利用碳水化合物（糯米飯）產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸有關(guān)；Aw的下降與pH的降低有關(guān)，低pH導(dǎo)致肌肉蛋白凝膠化，從而降低了耿馬酸肉的持水能力[12]，耿馬酸肉中pH和Aw的變化趨勢(shì)與Lyu等[13]的研究結(jié)果一致。由圖1中C可知，亞硝酸鹽殘留量呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵第4天時(shí)達(dá)到最大值12.33 mg/kg，低于國(guó)標(biāo)GB 5009.33—2016中的限定范圍30 mg/kg，表明耿馬酸肉中殘留的亞硝酸鹽不存在食用安全風(fēng)險(xiǎn)。

由表2可知，在耿馬酸肉發(fā)酵過程中，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌數(shù)量均符合地方標(biāo)準(zhǔn)DB 31/2004—2012中致病菌的限量要求。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸菌群呈先上升后下降的趨勢(shì)，第4天時(shí)達(dá)到最高值5.28 lg CFU/g。這可能是由于發(fā)酵前4 d蛋白質(zhì)在微生物的作用下發(fā)生降解，為大腸菌群的生長(zhǎng)繁殖提供了充足養(yǎng)料，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，水分含量、pH、Aw降低，NaCl濃度上升，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，大腸菌群生長(zhǎng)速率受到抑制，其數(shù)量逐漸減少[11]。湘西酸肉在15～20 ℃下發(fā)酵60 d內(nèi)均能檢測(cè)到大腸菌群，且在發(fā)酵第0天時(shí)數(shù)量最高，為3.50 lg CFU/g[14]。在Mhom中檢測(cè)到金黃色葡萄球菌3.52～6.43 lg CFU/g和大腸菌群2.34～2.79 lg CFU/g，并建議Mhom應(yīng)充分加熱后再食用[4]。耿馬酸肉中的大腸菌群數(shù)量高于上述報(bào)道中，也高于發(fā)酵肉制品標(biāo)準(zhǔn)Q/BY 0015 S—2020的最大限量（3 lg CFU/g），所以生食耿馬酸肉存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 游離氨基酸含量

瘦肉中含有大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶的共同作用下降解為小分子物質(zhì)，如游離氨基酸。耿馬酸肉在整個(gè)發(fā)酵過程中共檢測(cè)出17種游離氨基酸（見表3）。耿馬酸肉在發(fā)酵前4 d，游離氨基酸總量逐漸增加，發(fā)酵4 d后游離氨基酸總量開始減少。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前4 d較高的pH和較低的NaCl濃度可提高內(nèi)源酶和蛋白酶的活性，促進(jìn)肉中蛋白質(zhì)的降解，有利于游離氨基酸含量的增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，水分含量、Aw和pH降低以及NaCl濃度增大，抑制了蛋白酶和內(nèi)源酶的活性[15]，此外，游離氨基酸可作為氮源被微生物利用消耗[16]，導(dǎo)致發(fā)酵4 d后游離氨基酸總量呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵第6天時(shí)，耿馬酸肉中游離氨基酸含量最高的是谷氨酸（1.17 mg/g），其次是賴氨酸（1.04 mg/g）。趙珠蓮等[17]研究發(fā)現(xiàn)，酸豬肉在20 ℃下發(fā)酵180 d時(shí)，游離氨基酸中含量最高的是脯氨酸（422.42 mg/kg），其次是賴氨酸（319.36 mg/kg），脯氨酸的變化與本試驗(yàn)研究結(jié)果不一致，可能是由于原料、輔料、發(fā)酵時(shí)間和溫度等不同加工參數(shù)影響了蛋白酶和內(nèi)源酶的活性，進(jìn)而影響游離氨基酸的種類和含量[18]。

2.3 生物胺含量

由表4可知，耿馬酸肉中共檢測(cè)到組胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺、亞精胺、苯乙胺、色胺8種生物胺，其中苯乙胺呈先下降后上升的趨勢(shì)，下降可能是由于發(fā)酵體系中存在具有胺氧化酶的微生物，此類微生物將苯乙胺作為氮源和碳源利用，從而減少了苯乙胺的積累[19]，上升可能是因?yàn)楸揭野肥芾野穬?nèi)源性脫羧酶的調(diào)控，使苯乙胺在發(fā)酵2～6 d時(shí)與酪胺具有同步性[20]，導(dǎo)致苯乙胺含量上升。組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、生物胺總量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)。組胺被視為毒性最強(qiáng)的生物胺，在整個(gè)發(fā)酵過程中含量逐步增加，但均未超出可接受范圍50 mg/kg[7]，冉春霞等[21]報(bào)道10種市售渝東南地區(qū)傳統(tǒng)土家特色酸鲊肉中的組胺含量，其含量均在19.68～44.15 mg/kg之間。最近研究表明，酪胺比組胺具有更快、更強(qiáng)的細(xì)胞毒性[22]。耿馬酸肉在發(fā)酵第6天時(shí)酪胺含量為118.14 mg/kg，已超出可接受范圍100 mg/kg[5]，存在酪胺中毒風(fēng)險(xiǎn)。尸胺與腐胺可通過抑制胺氧化酶的活性增強(qiáng)組胺和酪胺的毒性作用[23]，此外，在亞硝酸鹽存在的環(huán)境下，尸胺和腐胺易形成強(qiáng)致癌物亞硝胺[24]，增加了生食耿馬酸肉中毒的風(fēng)險(xiǎn)。生物胺總量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，可能是因?yàn)槲⑸飻?shù)量增多，產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶增加，導(dǎo)致生物胺總量富集，成品中生物胺總量為310 mg/kg，大約是限量值的1/3。李廷任等[6]研究表明，自制酸肉在24 ℃下發(fā)酵30 d時(shí)生物胺總量高達(dá)1 938.68 mg/kg，是耿馬酸肉中生物胺總量的6倍，可能是原料肉的品質(zhì)、工藝條件、微生物的種類不同導(dǎo)致的[25]。

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 生物胺與理化指標(biāo)、大腸菌群的相關(guān)性

目前研究認(rèn)為生物胺與一些理化指標(biāo)具有相關(guān)性。耿馬酸肉中生物胺與理化指標(biāo)和大腸菌群的相關(guān)性見表5。

由表5可知，色胺與所列指標(biāo)無顯著相關(guān)性。亞硝酸鹽殘留量與腐胺、尸胺、酪胺、精胺和生物胺總量均呈顯著正相關(guān)。pH與腐胺、尸胺、酪胺、精胺、苯乙胺和生物胺總量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與亞精胺呈顯著正相關(guān)，與組胺呈顯著負(fù)相關(guān)。馮杰等[26]報(bào)道，不同貯藏溫度（4 ℃和25 ℃）下大黃魚的pH與苯乙胺、腐胺、尸胺和組胺具有極顯著正相關(guān)，pH與生物胺的相關(guān)性與本試驗(yàn)結(jié)果相似。NaCl含量與亞精胺無顯著相關(guān)性，與其他生物胺呈極顯著正相關(guān)。大腸菌群與腐胺、尸胺、酪胺呈顯著正相關(guān)，與Yang等[27]研究的大腸菌群與生物胺的變化規(guī)律相似。

2.4.2 生物胺與游離氨基酸含量的相關(guān)性分析

游離氨基酸是形成生物胺的前體物質(zhì)，發(fā)酵食品中的游離氨基酸在微生物的作用下脫羧為相應(yīng)的生物胺，其中組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸分別脫羧轉(zhuǎn)化為組胺、苯乙胺、酪胺、尸胺，精氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為精胺和亞精胺[28]。精氨酸和異亮氨酸與所有生物胺無顯著相關(guān)性，見圖2。色胺與所有游離氨基酸均無顯著相關(guān)性。亞精胺與丙氨酸、纈氨酸具有顯著負(fù)相關(guān)，與其他游離氨基酸無顯著相關(guān)性。腐胺、尸胺、酪胺、精胺、生物胺總量與大多數(shù)游離氨基酸具有極顯著正相關(guān)。Dabadé等[29]報(bào)道比利時(shí)市售動(dòng)植物制品中的苯乙胺和苯丙氨酸之間具有顯著正相關(guān)，這與本試驗(yàn)中苯丙氨酸與苯乙胺的相關(guān)性研究結(jié)果相似。組氨酸與組胺、酪氨酸與酪胺、精氨酸與精胺和亞精胺之間不具有顯著相關(guān)性，主要原因可能是耿馬酸肉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的組氨酸（0.09～0.17 mg/g）、酪氨酸（0.12～0.19 mg/g）和精氨酸（0.04～0.06 mg/g）含量較低（見表3），使組胺、酪胺、精胺和亞精胺的合成受到抑制，所以相關(guān)性不顯著。由此可見，游離氨基酸的含量及種類在一定程度上會(huì)影響生物胺的合成。

3 結(jié)論

耿馬酸肉中多數(shù)生物胺隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第6天時(shí)生物胺總量較低，酪胺含量最高，為118.14 mg/kg，已超出推薦限量值100 mg/kg，尸胺次之，為85.55 mg/kg，組胺未達(dá)限量值。發(fā)酵過程中均檢測(cè)到大腸菌群，而且數(shù)量超出Q/BY 0015 S—2020中的限量值，其他致病菌符合地方標(biāo)準(zhǔn)DB 31/2004—2012中的限量值。NaCl、pH、游離氨基酸與多種生物胺具有極顯著相關(guān)性。綜上，耿馬酸肉成品中的酪胺、尸胺含量較高，大腸菌群數(shù)量較多，生食耿馬酸肉存在較高的安全風(fēng)險(xiǎn)，建議熟食。

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