摘要：該研究以赤小豆為原料，采用超聲輔酶法和水提醇沉工藝提取赤小豆胞內(nèi)多糖，優(yōu)化提取工藝，并通過超聲波對其進行改性。研究改性前后赤小豆胞內(nèi)多糖的抗氧化特性以及對果蔬的冷藏保鮮作用，以拓展其應用領域。研究結果表明，赤小豆多糖提取的最佳工藝條件為超聲時間50 min、水提溫度70 ℃、水提時間200 min、復合酶處理溫度47 ℃，在此條件下，多糖提取率可達4.33%。赤小豆多糖體外抗氧化試驗結果表明，改性赤小豆多糖對·OH、DPPH·、ABTS+·的清除率分別為88.35%、83.67%、58.82%，比改性前分別提高了18.1%、17.4%、14.87%。多糖改性前后對草莓的冷藏保鮮試驗結果顯示，其保鮮能力排序為3%改性赤小豆多糖組＞1%改性赤小豆多糖組＞3%赤小豆多糖組＞1%赤小豆多糖組。因此，該研究采用的提取工藝對赤小豆多糖的提取率較高，改性后的多糖對自由基的清除率明顯高于改性前。改性前后的赤小豆多糖對草莓均具有保鮮效果，而改性后赤小豆多糖的保鮮效果優(yōu)于改性前。

關鍵詞：多糖；赤小豆；提取工藝；抗氧化活性；果蔬保鮮

中圖分類號：TS201.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）09-0015-08

Study on Extraction Technology， Modification and Characteristics of

Polysaccharides from Vigna umbellata

PEI Xiao-qian1， ZHANG Yun-zhe1， LI Zi-kun2， XU Hui3， LI Dong-xiao4， ZHANG Wei1，5，6*

（1.College of Food Science and Technology， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China;

2.Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China; 3.Department of Science and

Engineering， Hebei Agricultural University， Cangzhou 061100， China; 4.College of

Agronomy， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China; 5.College of

Life Sciences， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China;

6.Hebei Key Laboratory of Analysis and Control for Zoonotic

Pathogenic Microorganism， Baoding 071001， China）

Abstract： In this study， with Vigna umbellata as the raw material， intracellular polysaccharides are extracted from Vigna umbellata by ultrasonic-assisted enzymatic method and water extraction and ethanol precipitation technology. The extraction technology is optimized， and the polysaccharides are modified" through ultrasonic wave. In order to expand the application fields， the antioxidant properties of" intracellular polysaccharides

from Vigna umbellata and their refrigerated preservation effects on fruits and vegetables before and after modification are studied. The results show that the optimal technology conditions for the extraction of polysaccharides from Vigna umbellata are ultrasonic time of" 50 min， water extraction temperature of 70 ℃， water extraction time of 200 min and compound enzyme treatment temperature of 47 ℃. Under such conditions， the extraction rate of polysaccharides is 4.33%. The results of antioxidation test in vitro show that the scavenging rates of modified Vigna umbellata polysaccharides on ·OH， DPPH·， ABTS+ · are 88.35%， 83.67%， 58.82% respectively， which are 18.1%， 17.4%， 14.87% higher than those before modification respectively. The results of cold storage preservation test of polysaccharides on strawberries before and after modification show that the order of their preservation ability is 3% modified Vigna umbellata polysaccharides groupgt;1% modified Vigna umbellata polysaccharides groupgt;3%" Vigna umbellata polysaccharides groupgt;1% Vigna umbellata polysaccharides group. Therefore， the extraction rate of Vigna umbellata polysaccharides is relatively high by using the extraction technology in this study， and the free radical scavenging rates of modified polysaccharides are significantly higher than those before modification. The Vigna umbellata polysaccharides before and after modification both have preservation effect on strawberries， and the preservation effect of modified Vigna umbellata polysaccharides is better than that before modification.

Key words： polysaccharides; Vigna umbellata; extraction technology; antioxidant activity; preservation of fruits and vegetables

收稿日期：2024-03-05

基金項目：國家自然科學基金項目（32172288，31371772）；河北省自然科學基金重點項目（C2019204342）；河北省雜糧雜豆產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新團隊質量提升與品牌培育專項（HBCT2023050204）；中央引導地方科技發(fā)展資金項目（216Z5501G，226Z5503G，236Z5502G）；河北省外專百人計劃（360-0803-JSN-3YGS）；河北農(nóng)業(yè)大學食品加工學科群經(jīng)費資助（2021-06）；河北省重點研究開發(fā)計劃項目（18275501D）；河北省教育廳科研項目（QN2022073）；河北省自然科學基金項目（C2019204284）

作者簡介：裴肖茜（1999—），女，碩士研究生，研究方向：雜糧雜豆精細化。

*通信作者：張偉（1963—），男，教授，研究方向：食品安全。

赤小豆，也被稱為紅小豆，原產(chǎn)于中國，是雜糧中經(jīng)濟價值最高的作物[1]。赤小豆具有抗菌、抗氧化、降血糖等藥理作用[2]，含有豐富的蛋白質和碳水化合物，以及少量的礦物質和多種膳食纖維[3]，被列為藥食同源作物[4]。天然多糖由一系列具有不同理化性質和生理功能的組分組成，具有多種生理功效，除具有傳統(tǒng)的抗氧化活性外，還具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、防腐保鮮等功能，其優(yōu)異的功能特性已應用于食品和醫(yī)藥領域[5]，具有廣闊的應用前景[6]。

目前天然多糖的提取率普遍較低，且天然多糖結構組成復雜未知，因此對多糖提取工藝進行研究，對其進一步應用尤為關鍵。酶輔助提取法是一種常見的多糖提取方法，利用酶加速細胞壁或細胞膜結構的破壞，使多糖更好地溶出細胞，提高多糖提取率[7]，如Tang等[8]采用酶輔助法提取黃芪粗多糖的產(chǎn)率明顯高于其他提取方法[9]。超聲輔助提取法是通過在超聲過程中提高系統(tǒng)溫度和壓力，加速細胞破碎，加速細胞內(nèi)多糖溶解，提高多糖提取效率，耗時短，提取率高。目前多糖提取應用較廣泛的是采用超聲法和酶法輔助提取多糖，王慶等[10]采用熱水浸提法、超聲輔助提取法和酶法3種方法提取天麻多糖，結果表明，酶法和超聲輔助提取法的多糖提取率較高，且抗氧化性強于熱水提取法。

由于天然多糖的生物活性相對較差，常采用多糖改性的方法來增強其生物活性[11]。采用超聲波改性多糖，通過多糖顆粒附近的壓力梯度，利用其剪切力破壞其結構[12]，與其他降解方法相比，超聲處理具有綠色、快速、節(jié)能和環(huán)保的優(yōu)勢[13]，如Xu等[14]采用超聲波改性的靈芝天然多糖表現(xiàn)出更均勻的顆粒結構，抗氧化活性顯著提高。

目前研究人員已經(jīng)從植物中提取得到了多種天然多糖，具有良好的抗氧化性，發(fā)展?jié)摿^大。目前關于赤小豆多糖提取和特性研究的文獻未見報道，為充分開發(fā)赤小豆多糖這一資源，本研究擬采用超聲復合酶法結合水提醇沉法提取赤小豆多糖，并利用超聲波對其進行改性。進一步研究赤小豆多糖改性前后的體外抗氧化活性以及對草莓的保鮮能力，以評估其功能特性和作用，旨在找到一種綠色高效的赤小豆多糖提取和改性工藝，以期獲得功能特性更佳的赤小豆多糖，并拓展其應用領域，為未來赤小豆多糖的應用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤小豆、草莓：市售;丙酮、石油醚、蒽酮、無水乙醇、氯仿、D-葡萄糖、濃硫酸、鹽酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、VC、淀粉酶（gt;350 U/mg）、纖維素酶（gt;600 U/mg） （均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT，分析純）;羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基清除能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

WH-861旋渦混合器 太倉市科教器材廠；H2500R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SPX-250B-Z酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司；KQ2200超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；ESJ30-5A電子天平 沈陽神宇龍騰天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赤小豆多糖的提取

將赤小豆研磨、過篩（100目），依次浸泡在丙酮、石油醚和乙醇中，烘干得到赤小豆粉。取適量赤小豆粉按比例（赤小豆粉∶蒸餾水為1∶20）配制成赤小豆勻漿，放入100 W超聲波清洗機中超聲30 min，向赤小豆勻漿中加入復合酶（淀粉酶∶纖維素酶為1∶1），在40 ℃水浴條件下處理1 h后，放入85 ℃水浴鍋中3 h，過濾濃縮后采用Sevage法去除蛋白質。經(jīng)多次離心后，將無水乙醇加入到最終得到的上清液中，得到乙醇濃度為80%的溶液，將沉淀物溶解凍干后即為赤小豆多糖。

1.3.2 蒽酮-硫酸法測定多糖含量

配制蒽酮硫酸試劑，測定葡萄糖含量，結合酶聯(lián)免疫檢測器，得到標準曲線，測定赤小豆多糖中的總糖含量。

1.3.3 單因素試驗

采用預試驗確定部分因素條件：超聲時間30，40，50，60，70，80 min，水提溫度40，50，60，70，80，90 ℃，水提時間140，160，180，200，220，240 min，復合酶處理溫度20，30，40，50，60，70 ℃。

1.3.4 響應面試驗

以4個因素作為自變量，以多糖提取率為響應值，四因素三水平響應面試驗因素及水平為超聲時間40，50，60 min，水提溫度60，70，80 ℃，水提時間180，200，220 min，復合酶處理溫度30，40，50 ℃。

1.3.5 超聲改性赤小豆多糖

將赤小豆多糖配制成0.1 g/mL的多糖溶液，在冰水浴條件下放入300 W超聲波清洗機中超聲20 min，占空比為50%（超聲5 s，暫停5 s）。

1.3.6 ·OH清除能力測定

利用Fenton反應原理[15]，結合酶聯(lián)免疫檢測器，計算赤小豆多糖對羥基自由基的清除能力。

1.3.7 DPPH·清除能力測定

結合酶聯(lián)免疫檢測器，計算多糖對DPPH自由基的清除能力。

1.3.8 ABTS+·清除能力測定

結合酶聯(lián)免疫檢測器，在抗氧化劑作用下，ABTS+被還原成ABTS，通過在734 nm處的吸光度值測定赤小豆多糖的抗氧化能力。

1.3.9 草莓樣品處理

將新鮮草莓分成6組，每組200 g左右，分別用質量濃度為1%和3%的赤小豆多糖水溶液、1%和3%的改性赤小豆多糖水溶液浸泡1 min，然后取出瀝干10 min，剩余2組分別作為對照組，用蒸餾水作相同處理，其余1組為不處理的空白對照組，放入4 ℃冰箱中貯存7 d，每隔1～2 d觀察草莓的腐爛程度。

1.3.10 草莓腐敗率測定

將7組樣品每隔1～2 d觀察測定一次草莓的腐敗率，計算公式如下：

腐敗率（%）=∑（X1×S1）X×S×100%。（1）

式中：X1為腐爛級別；S1為該腐爛級別果數(shù)；X為腐爛最高級別；S為總果數(shù)。

草莓腐爛級別：0級：無腐爛；1級：0～1/4面積腐爛；2級：1/4～1/2面積腐爛；3級：1/2～3/4面積腐爛；4級：3/4～1面積腐爛。

1.3.11 草莓失重率測定

采用差重法測定草莓的失重率，多糖處理7 d，每隔1～2 d稱量一次樣品的質量。草莓失重率計算公式如下：

失重率（%）=M1－M2M1×100%。 （2）

式中：M1為貯藏前質量（g）；M2為貯藏后質量（g）。

1.3.12 草莓VC測定

將VC溶于HCl中，在蒸餾水中等量稀釋，在324 nm處用比色法檢測吸光度，測定吸光度值，繪制標準曲線[16]。得到線性回歸方程：Y=0.057 2X+0.251，R2=0.998 4gt;0.99。

1.3.13 草莓MDA含量測定

將草莓用三氯乙酸研磨均勻后稱取提取液的體積，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液搖勻，水浴10 min后離心，收集上清液，在532，600，450 nm處測量其吸光度值[17]。草莓中MDA含量計算公式[18]如下：

MDA含量=[6.452×（D532 nm－D600 nm）－0.559×D450 nm]×VVs×m。

（3）

式中：V為提取液總體積（mL）；Vs為測定用提取液體積（mL）；m為草莓鮮重（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結果均取3次結果的平均值，響應面數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件處理，采用Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 總糖含量測定結果

采用蒽酮硫酸法得到的D-葡萄糖標準曲線見圖1。標準曲線的R2gt;0.99，說明結果真實可信。根據(jù)標準曲線計算得到赤小豆多糖的總糖含量為70.32%。

2.2 單因素試驗結果

由圖2～圖5可知，赤小豆多糖提取率先升高后降低。由圖2可知，隨著超聲時間的延長，細胞壁逐漸被破碎，胞內(nèi)多糖進一步溶解。但在超聲50 min后，多糖的主鏈和支鏈發(fā)生斷裂，多糖結構改變，多糖提取率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢[19]。

由圖3可知，隨著水提溫度的升高，多糖的溶解度逐漸增大，多糖的提取率逐漸提高。但在溫度超過70 ℃后，淀粉發(fā)生了糊化，糊化后的淀粉與水的接觸面積逐步減小，導致多糖的溶解速率降低，多糖提取率逐漸降低[20]。

由圖4可知，隨著水提時間的延長，細胞膜吸水破裂，胞內(nèi)多糖溶出率增加。但超過220 min后，多糖在高溫條件下發(fā)生了不同程度的降解，導致多糖提取率出現(xiàn)拐點[21]。

由圖5可知，隨著復合酶處理溫度的升高，逐漸達到復合酶的最適溫度，復合酶將植物細胞壁的淀粉和纖維素水解，使多糖提取率升高。但當溫度高于40 ℃時，復合酶逐漸出現(xiàn)失活降解，多糖提取率呈下降趨勢。

2.3 響應面試驗結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken軟件共設計29組試驗，結果見表1，并對其進行顯著性分析和方差分析，見表2。

利用軟件對試驗結果進行分析，得到赤小豆多糖提取過程的實際影響因素二次多項回歸模型方程：多糖提取率=3.99+0.15A+0.12B+0.033C+0.57D－0.015AB+0.036AC－0.14AD+0.022BC－0.060BD－0.038CD－0.23A2－0.74B2－0.068C2－0.40D2。

在此回歸模型方程中，二次項的系數(shù)均為負數(shù)，所以方程有一個最大值。

由表2可知，此回歸模型極顯著，失擬項的P=0.546 1，不顯著，說明模型與檢驗數(shù)據(jù)擬合較好。該模型的決定系數(shù)R2=0.948 7，與實際試驗擬合度為94.87%。該試驗設計模型可對赤小豆多糖提取工藝的優(yōu)化進行理論預測。

該模型的三維響應面圖見圖6～圖11，任意兩因素交互作用的三維圖均呈現(xiàn)較陡峭的坡度，且等高線圖幾乎全為橢圓形，結果表明兩兩因素之間存在一定的交互作用，多糖提取率存在最大值。

2.4 功能特性測定結果

2.4.1 ·OH清除能力測定結果

赤小豆多糖對羥基自由基的清除能力見圖12。多糖降解程度越高，抗氧化能力越強[22]。將兩種赤小豆多糖羥基自由基清除能力與市面上較普遍的食品天然抗氧化劑BHT進行對比。

由圖12可知，當質量濃度為0～5 mg/mL時，羥基自由基清除率與多糖質量濃度成正比。當質量濃度為5 mg/mL時，改性赤小豆多糖羥基自由基清除率可達88.35%，雖低于同濃度的BHT，但高于赤小豆多糖，且比改性前的赤小豆多糖提高了18.1%。

2.4.2 DPPH·清除能力測定結果

赤小豆多糖DPPH自由基的清除能力見圖13。

由圖13可知，當質量濃度為0～5 mg/mL時，多糖濃度與DPPH自由基清除率成正比。當質量濃度為5 mg/mL時，改性赤小豆多糖對DPPH自由基的清除率達到最高，為83.67%，雖明顯低于同濃度下的BHT，但高于赤小豆多糖，且比改性前的赤小豆多糖提高了17.4%。

2.4.3 ABTS+·清除能力測定結果

赤小豆多糖對ABTS自由基的清除能力見圖14。

由圖14可知，當質量濃度為0～5 mg/mL時，多糖濃度與ABTS自由基清除率成正比。當質量濃度為5 mg/mL時，改性赤小豆多糖對ABTS自由基的清除率為58.82%，雖明顯低于同濃度下的BHT，但高于赤小豆多糖，且比改性前的赤小豆多糖提高了14.87%。

2.4.4 草莓腐敗率測定結果

隨著時間變化，赤小豆多糖對草莓腐敗率的影響見圖15。

由圖15可知，在貯藏第6天時，4個多糖組的防腐能力明顯提高，3%改性赤小豆多糖組的草莓腐敗率比空白對照組降低了15.16%，比3%赤小豆多糖組降低了9.12%，多糖處理組表現(xiàn)出了一定的防腐能力，此時多糖涂膜已經(jīng)在草莓表層形成保護層，可以隔絕外界空氣和微生物侵襲草莓，并且多糖中的活性物質可進一步減少草莓腐敗[23-24]。

2.4.5 草莓失重率測定結果

隨著時間變化，赤小豆多糖對草莓失重率的影響見圖16。

由圖16可知，在貯藏第6天時，4個多糖組的持水能力明顯提高，3%改性赤小豆多糖組的草莓失重率比空白對照組降低了2.76%，比3%赤小豆多糖組降低了1.12%，多糖處理組表現(xiàn)出了一定的持重能力，不同劑量改性前后的赤小豆多糖均表現(xiàn)出穩(wěn)定且較好的持重能力，3%改性赤小豆多糖對草莓的持重效果更佳，多糖利用自身的持水性來減緩草莓表層水分流失，由此可見，改性赤小豆多糖具有一定的保鮮性能，可延長草莓的貯藏期。

2.4.6 草莓VC測定結果

隨著時間變化，赤小豆多糖對草莓VC含量的影響見圖17。

由圖17可知，3%改性赤小豆多糖組呈現(xiàn)出最佳的草莓VC保留效果。在貯藏第2天時，4個多糖組的VC保留能力明顯提高，3%改性赤小豆多糖組的草莓VC含量比空白對照組增加18.42 mg/100 g，比3%赤小豆多糖組提高了8.13 mg/100 g，多糖處理組均對草莓中VC含量有不錯的保留功能，3%改性赤小豆多糖對草莓VC含量的保留效果更佳。

2.4.7 草莓MDA含量測定結果

MDA是脂質的過氧化產(chǎn)物之一，反映草莓脂質膜氧化后的老化程度。隨著時間變化，赤小豆多糖對草莓MDA含量的影響見圖18。

由圖18可知，在貯藏第4天時，4個多糖組的MDA抑制能力明顯提高，3%改性赤小豆多糖組的草莓MDA含量比空白對照組減少了0.55 μmol/（g·FW），比3%赤小豆多糖組減少了0.28 μmol/（g·FW），多糖處理組均對草莓中MDA含量有不錯的抑制能力，3%改性赤小豆多糖對草莓MDA含量的抑制效果更佳。

3 結論

本試驗采用超聲輔助水提醇沉法提取赤小豆多糖，復合酶法除去淀粉和纖維素雜質，Sevage法脫蛋白，得到赤小豆多糖。根據(jù)標準曲線計算得到赤小豆多糖的總糖含量為70.32%，采用單因素試驗分別選取4個因素的最佳工藝參數(shù)，然后做響應面試驗考察4個因素的交互作用，最終得到赤小豆多糖最優(yōu)提取條件為超聲時間50 min、水提溫度70 ℃、水提時間200 min、復合酶處理溫度47 ℃，在此條件下，赤小豆多糖的提取率達到4.33%。

將超聲改性后的赤小豆多糖進一步做功能特性分析，與赤小豆多糖進行對比，改性赤小豆多糖對羥基自由基的清除率最高，為88.35%，比改性前的赤小豆多糖提高了18.1%，對DPPH自由基的清除率達到最高，為83.67%，比改性前的赤小豆多糖提高了17.4%，對ABTS自由基的清除率達到最高，為58.82%，比改性前的赤小豆多糖提高了14.87%。將改性前后赤小豆多糖配制成1%和3%溶液浸泡處理草莓，經(jīng)多糖溶液處理后將草莓貯藏7 d，保鮮能力排序為3%改性赤小豆多糖組gt;1%改性赤小豆多糖組gt;3%赤小豆多糖組gt;1%赤小豆多糖組，對草莓的保鮮能力與多糖呈劑量依賴性，在相同多糖濃度下，改性赤小豆多糖的保鮮能力強于赤小豆多糖。

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