摘要：為探究SMAD 基因家族重要成員SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在小尾寒羊繁殖活動(dòng)中的生物學(xué)功能，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因的蛋白理化性質(zhì)、親疏水性和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白互作進(jìn)行預(yù)測(cè)及GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）的富集分析；然后以小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）確定SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白在卵巢組織中的表達(dá)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（western blot，WB）方法測(cè)定SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白在不同生理階段卵巢組織和不同直徑卵泡中表達(dá)水平。結(jié)果顯示，SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白為親水性蛋白，理論等電點(diǎn)分別為6.67、6.73和6.50，在不同生理階段卵巢組織中的陽性表達(dá)主要位于卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，且二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋和無規(guī)則卷曲的占比較高，其蛋白與FOXH1、ACVR1B、SMAD1、TGFβR1、TGFβR2、ZFYVE9、SKI、SKIL、TGIF1 和ENSOARP0000001869 蛋白存在互作關(guān)系。SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在TGF-β受體信號(hào)通路、TGF-β受體結(jié)合、TGF-β激活受體活性中發(fā)揮生物學(xué)功能，且在TGF-β信號(hào)通路富集。SMAD2和SMAD4蛋白在撤栓后42 h卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于撤栓后18 h，其mRNA表達(dá)趨勢(shì)及其編碼蛋白表達(dá)趨勢(shì)總體一致；而SMAD3 基因mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)量在不同生理階段卵巢組織中差異不顯著。SMAD3 基因mRNA及其編碼蛋白在中卵泡中的表達(dá)量顯著高于大卵泡；SMAD2 和SMAD4 基因表達(dá)量在不同直徑卵泡中差異不顯著。綜上所述，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在小尾寒羊卵巢周期性活動(dòng)中的生物學(xué)功能存在差異，SMAD2 和SMAD4 基因參與小尾寒羊發(fā)情初期至排卵前的卵巢生理變化，但不參與卵泡發(fā)育；而SMAD3 參與卵泡發(fā)育。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步探索SMAD 基因家族在小尾寒羊卵巢活動(dòng)中的分子機(jī)理提供理論參考。

關(guān)鍵詞：小尾寒羊；卵巢；卵泡；SMAD2；SMAD3；SMAD4

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.1118

中圖分類號(hào)：S826；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008?0864（2024）07?0069?11

小尾寒羊是中國乃至世界聞名的肉裘兼用型綿羊品種，具有早熟、多羔、生長(zhǎng)快、體格大、產(chǎn)肉多、裘皮好、遺傳性穩(wěn)定及適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被國家認(rèn)定為名畜良種，從而引起了國內(nèi)外養(yǎng)羊業(yè)的廣泛關(guān)注，其最早分布于河北、河南、山東、安徽和江蘇，現(xiàn)已推廣至全國近20 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），在養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中呈現(xiàn)出迅猛發(fā)展勢(shì)頭[1]。綿羊繁殖力受遺傳背景、飼養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)水平等多種因素的調(diào)控，其中排卵數(shù)對(duì)母羊的產(chǎn)羔數(shù)具有直接影響，同時(shí)排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)也是衡量母羊繁殖力最重要的2個(gè)指標(biāo)[2]。卵巢作為雌性哺乳動(dòng)物性腺，具有產(chǎn)生卵子、分泌雌激素和孕酮的功能，決定著雌性的第二性征。卵泡是卵巢基本功能單位，分布于卵巢皮質(zhì)部，由卵母細(xì)胞（oocyte）、顆粒細(xì)胞（granular cells，GCs）和卵泡膜細(xì)胞（thecalcells，TCs）組成，為卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供微環(huán)境，不同大小代表不同發(fā)育階段。因此，研究小尾寒羊卵巢中卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育過程有助于挖掘小尾寒羊高繁殖力性狀的遺傳機(jī)制，為其他綿羊品種提供理論參考。

1995 年，Sekelsky 等[3]在果蠅中首次鑒定出SMAD蛋白家族。SMAD蛋白可以分為3類，受體調(diào)節(jié)的SMAD 蛋白（R-SMAD）、公共SMAD 蛋白（CoSMAD、SMAD4） 和抑制性SMAD 蛋白（SMAD6/7）。R-SMAD 蛋白中包含SMAD2/3，其作為TGF-β/SMAD 信號(hào)途徑中的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，磷酸化能夠促進(jìn)TGF- β 信號(hào)傳遞[4?5]；公共SMAD 蛋白中的SMAD4 作為TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)中的中心介質(zhì)，不僅可以與SMAD3發(fā)揮協(xié)同作用，還可以與SMAD2發(fā)揮協(xié)同作用以介導(dǎo)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)[6?7]。有關(guān)SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在不同品種、不同組織及不同細(xì)胞類型中的生物學(xué)功能報(bào)道較多。廖火城等[8]發(fā)現(xiàn)，敲低SMAD2基因表達(dá)與過表達(dá)SMAD7 基因能降低大鼠心肌纖維化。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SMAD3 基因可調(diào)控肌生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN），從而抑制綿羊成肌細(xì)胞肌源性分化。張秉芬等[10]發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β/SMAD3信號(hào)通路激活會(huì)對(duì)大鼠肺纖維化產(chǎn)生保護(hù)作用。范李靜等[11]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SMAD4 基因表達(dá)會(huì)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（human endometrial stromal cell，hESC）增殖和纖維化。此外，關(guān)于SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因與生殖活動(dòng)相關(guān)的研究報(bào)道也越來越多。在TGF-β/SMAD 信號(hào)通路中，SMAD 作為下游信號(hào)分子通過自分泌/旁分泌途徑發(fā)出信號(hào)，調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)，影響著卵巢發(fā)育[12]；SMAD 信號(hào)分子還可以調(diào)節(jié)雄激素和雌激素的形成，從而介導(dǎo) BMP4 的作用[13]。2000 年，在人卵母細(xì)胞中也檢測(cè)到SMAD2 和SMAD3 基因的表達(dá)[14]。在牛早期胚胎發(fā)生過程中SMAD3 基因是關(guān)鍵影響基因，并且卵泡抑素（follistatin，F(xiàn)S）要依賴于SMAD2/3信號(hào)共同轉(zhuǎn)導(dǎo)，才能夠發(fā)揮出特異性促胚胎發(fā)育的作用[15]。Gueripel等[16]研究顯示，促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體素（luteinizing hormone，LH）能夠增加TGF-BMP 通路相關(guān)基因表達(dá)量，其中SMAD4 基因起橋梁作用。Pangas 等[17]在小鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)，干擾SMAD4 基因會(huì)破壞卵巢顆粒細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞過早黃體化，最終導(dǎo)致卵巢過早衰竭，繁殖力降低，從而出現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)顯著減少和超排后卵子數(shù)量減少的現(xiàn)象；被活化的SMAD2蛋白也可作為底物，與SMAD4形成聚合體，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)，促進(jìn)小型有腔卵泡的早熟，促進(jìn)卵泡的釋放[18]。綜上所述，SMAD 基因家族參與哺乳動(dòng)物繁殖活動(dòng)，特別是在雌性動(dòng)物繁殖活動(dòng)中的生物學(xué)功能仍然是目前研究的熱點(diǎn)；然而有關(guān)SMAD 基因在小尾寒羊卵巢周期性活動(dòng)中的研究報(bào)道還較少。

基于以上研究背景，本研究欲利用生物信息學(xué)分析SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白，然后采集同期發(fā)情后的雌性小尾寒羊不同生理階段的卵巢組織，通過免疫組織化學(xué)確定SMAD2/3/4蛋白在卵巢組織中的陽性表達(dá)，并利用RT-qPCR 和Western blot 方法測(cè)定SMAD2、SMAD3 和SMAD4基因及其編碼蛋白在小尾寒羊卵巢組織中的表達(dá)水平；同時(shí)在屠宰場(chǎng)隨機(jī)采集小尾寒羊卵巢，分離出不同直徑的卵泡，利用相同方法測(cè)定SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá)水平，初探SMAD2、SMAD3和SMAD4 基因在小尾寒羊卵巢周期性活動(dòng)中的生物學(xué)功能，挖掘小尾寒羊高繁殖力潛在的遺傳機(jī)理，為深入研究SMAD 基因家族在小尾寒羊繁殖活動(dòng)中的調(diào)控機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)羊只處理及樣品采集

1.1.1 試驗(yàn)羊只的處理及卵巢樣品的采集

試驗(yàn)羊只來自甘肅省臨夏市興華牧業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)，選取飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件一致，2～3歲健康純種雌性小尾寒羊8只，在其陰道放置孕酮陰道栓（300 mg孕酮，新西蘭Bioniche Animal Health Pty 公司）處理12 d，實(shí)施同期發(fā)情。在孕酮栓塞撤除后的18和42 h各屠宰4只母羊，解剖分離出兩側(cè)卵巢，然后用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffer saline，PBS）沖洗。將分離出的左側(cè)卵巢放置于凍存管投于液氮中冷凍保存，右側(cè)卵巢放置于4%多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 卵泡樣品的采集

在臨夏市康泰屠宰場(chǎng)采集小尾寒羊母羊卵巢，使用剪刀、鑷子等器械分離出卵泡，用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵泡直徑。參考Jing等[19] 方法，將獲得的卵泡分為小卵泡（直徑≤2 mm）、中卵泡（3.5 mm≤直徑≤4.5 mm）和大卵泡（直徑≥6 mm）。將測(cè)量后的卵泡置于凍存管于液氮中冷凍保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

從NCBI 網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫獲取SMAD2（XP_027816688.1）、SMAD3（XP_042108005.1）和SMAD4（XP_027816484）的蛋白序列。利用ExPASy-ProtParam tool在線工具對(duì)編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用ProtScale在線工具分析SMAD 蛋白的親疏水性；參考Chou等[20]的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；通過在線網(wǎng)站SOPMA預(yù)測(cè)SMAD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；最后，利用在線網(wǎng)站STRING預(yù)測(cè)SMAD蛋白的互作及GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopediaof genes and genomes）富集分析。

1.2.2 免疫印跡（western blot）分析

用RIPA 組織裂解液（G2002，Servicebio）提取卵巢組織和卵泡的蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒（PC0020，索萊寶）進(jìn)行蛋白定量。用30 μL 5×上樣緩沖液（G2013，Servicebio）與120 μL 蛋白樣本混合于200 μL的離心管中，于PCR儀上98 ℃煮沸5 min后，迅速插入冰上，冰浴5 min；重復(fù)3 次，置于?80 ℃?zhèn)溆?。?80 ℃中取出變性蛋白樣品，于PCR 儀上95 ℃變性3 min，每孔上樣30 μg，以GAPDH（YM3215，ImmunoWay）為內(nèi)參，12％的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecylsulfate polyacryl-amide gelelectrophoresis，SDS-PAG）進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，取PVDF膜（RVH00010，Millipore）置于用脫脂奶粉（D8340，索萊寶公司）配置的5% 脫脂奶封閉液中，室溫?fù)u1.5 h；將PVDF膜按照目的蛋白所處位置裁成長(zhǎng)條，分別將其置于用5%脫脂奶封閉液配置的一抗稀釋液中，4 ℃慢搖，孵育過夜。用1×TBS和0.1% Tween-20（T8220，索萊寶公司）配置TBST洗膜，室溫5×6 min 搖洗。加入山羊抗IgG（1∶6000）（RS0002，ImmunoWay），室溫1 h；TBST 洗膜，室溫5×6 min搖洗。用 ECL 發(fā)光液（G2020-2，Servicebio）顯影曝光，并觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 總RNA提取及cDNA合成

將卵巢組織和卵泡在RNA isolater里勻漿或在液氮里研碎，按照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 試劑盒（R401-01，諾唯贊）使用說明提取卵巢組織和卵泡的總RNA。

使用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNAClean for qPCR試劑盒（AG11728，艾科瑞）去除卵巢組織和卵泡總RNA 中的DNA 后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。獲得的cDNA產(chǎn)物于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索綿羊SMAD2（XM_027960887.2）、SMAD3（XM_042252073.1）、SMAD4 基因（NM_001267886.1）和內(nèi)參GAPDH 基因（NM_001190390.1）的mRNA序列，利用Primer Premier 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），并進(jìn)行BLAST檢測(cè)后，將引物序列信息發(fā)送至楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）技術(shù)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，USA）檢測(cè)卵巢組織和卵泡中SMAD2/3/4 mRNA的表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參。PCR 體系包括10 μL 2×SYBR? Green PremiｘPro Taq HS qPCR Kit（AG11720，艾科瑞），上、下游引物各0.4 μL，7.2 μLddH2O，2 μL cDNA， 3次重復(fù)。PCR程序?yàn)?5 ℃3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30ｓ，72 ℃ 30 s， 40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。按照梁維煒等[21]方法對(duì)RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)Western blot 結(jié)果，使用GraphPad Prism8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白的理化性質(zhì)

ExPASy-ProtParam tool 在線工具分析發(fā)現(xiàn)，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白分子式分別為C2 168H3 368N602O649S22、C2 133H3 298N594O626S25和C2 675 H4 140-N764O802S23，原子總數(shù)為6 809、6 676和8 404，氨基酸數(shù)量為437、425和553，蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為48 955.56、48 080.75 和60 572.32 kDa，理論等電點(diǎn)為6.67、6.73 和6.50，脂肪族指數(shù)為75.58、74.52 和76.06，平均親水性指數(shù)為? 0.437、?0.447 和?0.389，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為54.84、53.26和50.95。

2.2 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白的親疏水性

由圖1可知，高峰值（正值）區(qū)域表示疏水，而負(fù)值的“ 低谷”區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)域，總體來看，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白的親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸，均屬于親水性蛋白。

2.3 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，SMAD2蛋白主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞核；MAD3蛋白主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；SMAD4蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

2.4 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

通過在線網(wǎng)站SOPMA 對(duì)SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）表明，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白中α 螺旋（alpha helix）的占比分別為24.03%、23.53% 和24.41%，有105、100 和135 個(gè)氨基酸；延伸鏈（extended strand）的占比分別為16.93%、18.12%和15.55%，有74、77和86個(gè)氨基酸；β-折疊結(jié)構(gòu)（beta turn） 的占比分別為3.89%、3.76%和6.69%，有17、16和37個(gè)氨基酸；無規(guī)線團(tuán)（random coil）的占比分別為55.15%、54.59%和53.35%，有241、232和295個(gè)氨基酸。

2.5 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白互作的GO 和KEGG 富集分析

由圖3可知，與 SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白互作的蛋白共有10個(gè)（FOXH1、ACVR1B、SMAD1、TGFβR1、TGFβR2、ZFYVE9、SKI、SKIL、TGIF1、ENSOARP0000001869），存在52條互作關(guān)系。

SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因的GO 的功能條目主要有TGF-β受體信號(hào)通路（GO∶0007179）、TGF-β受體結(jié)合（GO∶0005160）、TGF-β激活受體活性（GO∶0005024）（表2），在KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因主要富集于TGF-β信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路等信號(hào)通路（表3）。這些都可能與卵巢發(fā)育有關(guān)。

2.6 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白在不同生理狀態(tài)卵巢組織中的陽性表達(dá)

免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白在撤栓后18和42 h的卵巢組織中均有陽性表達(dá)；且主要位于卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞。

2.7 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在不同生理狀態(tài)卵巢組織中的表達(dá)

采用RT-qPCR 和Western blot技術(shù)檢測(cè)撤栓后18 和42 h 的卵巢組織中SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白表達(dá)水平，結(jié)果（圖5）表明，在撤栓后18和42 h的卵巢組織中均能檢測(cè)到SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因與蛋白的表達(dá)，且在撤栓后42 h卵巢組織中mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)量均高于18 h，其中，SMAD2 和SMAD4蛋白在撤栓后42 h卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于18 h，而mRNA表達(dá)差異不顯著；SMAD3基因及其編碼蛋白在撤栓后18和42 h間差異均不顯著。

2.8 SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在不同直徑卵泡中的表達(dá)

采用RT-qPCR 和Western blot技術(shù)檢測(cè)不同直徑卵泡中SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果（圖6）表明，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因及其蛋白在大、中、小卵泡中均表達(dá)。其中SMAD3 基因mRNA 及其編碼蛋白在中卵泡的表達(dá)量顯著高于大卵泡，然而大卵泡與小卵泡、中卵泡與小卵泡間差異不顯著。SMAD2 和SMAD4 基因及其蛋白在不同直徑卵泡中表達(dá)量差異均不顯著。

3 討論

TGF-β超家族信號(hào)通路對(duì)卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)以及顆粒細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用。SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因是SMAD 基因家族參與哺乳動(dòng)物TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的重要成員，但其在綿羊卵巢周期性活動(dòng)中的生物學(xué)功能尚不明確。本研究利用生物信息分析發(fā)現(xiàn)，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白均為親水性蛋白，理論等電點(diǎn)為6.67、6.73和6.50，可以與某些帶有電荷的基團(tuán)結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能；亞細(xì)胞定位分析顯示，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用，且二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋和無規(guī)卷曲的占比較高；與FOXH1、ACVR1B、SMAD1、TGFβR1、TGFβR2、ZFYVE9、SKI、SKIL、TGIF1和ENSOARP0000001869蛋白存在52條互作關(guān)系；GO分析表明，SMAD2、SMAD3和SMAD4 基因在TGF-β受體信號(hào)通路、TGF-β受體結(jié)合、TGF-β激活受體活性中發(fā)揮生物學(xué)功能，KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，SMAD2、SMAD3 和SMAD4基因在TGF-β信號(hào)通路富集，而TGF-β信號(hào)通路在卵巢中發(fā)揮著重要作用，因此，推測(cè)SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因與卵巢的周期性變化有關(guān)。

湯繼順[22]研究表明，實(shí)施同期發(fā)情后的小尾寒羊在撤栓后18 h開始發(fā)情，在36 h時(shí)發(fā)情率達(dá)到90%以上，在48 h時(shí)發(fā)情率達(dá)到100%；撤栓后48～52 h 卵母細(xì)胞排出。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在卵巢中的功能，本研究分別采集撤栓后18和42 h的卵巢組織，采用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞中均有SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白的陽性表達(dá)；RT-qPCR和WB也檢測(cè)到SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白在卵巢組織中表達(dá)，且SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白在42 h卵巢中的表達(dá)量高于18 h，其中SMAD2 和SMAD4 蛋白表達(dá)量差異顯著。蓋玉強(qiáng)等[23]研究表明，敖漢細(xì)毛羊在發(fā)情期中SMAD4 基因mRNA表達(dá)量顯著高于發(fā)情前期；He等[24]研究發(fā)現(xiàn)，SMAD2 基因在黃鰻卵巢發(fā)育過程中表達(dá)，且表達(dá)量持續(xù)增加，在卵黃形成早期達(dá)到峰值；苗竹林等[25]發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠卵巢的發(fā)育，SMAD4 基因的表達(dá)量也逐漸增加；與本研究結(jié)果一致，即SMAD2 和SMAD4 基因參與小尾寒羊發(fā)情初期至排卵這一過程中卵巢的生理變化。

雌性綿羊的卵母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂后一直被阻斷在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，直到發(fā)情時(shí)，才在垂體促性腺激素的調(diào)節(jié)下重新恢復(fù)減數(shù)分裂。與此同時(shí)，卵巢上的卵泡快速發(fā)育，隨著卵泡的不斷增大，雌激素分泌增多，從而引起性欲；在此期間，只有少數(shù)卵泡會(huì)變成優(yōu)勢(shì)卵泡破裂排卵，大多數(shù)卵泡會(huì)發(fā)生閉鎖；排卵后雌激素顯著減少，孕酮（progesterone，P4）快速增加，導(dǎo)致停止發(fā)情[26]。鄭健[27]研究發(fā)現(xiàn)，在湖羊垂體上調(diào)控SMAD2基因表達(dá)能夠影響垂體細(xì)胞的激素分泌，調(diào)節(jié)卵巢卵泡發(fā)生和排卵。李碧筠等[28]發(fā)現(xiàn)，抑制山羊卵巢中SMAD2 基因表達(dá)，會(huì)抑制TGF-β/SMAD信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制雌二醇（estradiol，E2）分泌，促進(jìn)孕酮的合成。Nomura等[29]發(fā)現(xiàn)，在人卵巢中SMAD2 基因可通過調(diào)控CYP19A1的表達(dá)，影響雌激素分泌。Yu等[30]在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 基因是LH刺激ERK1/2激活和排卵相關(guān)基因表達(dá)所必需的，敲除SMAD4基因會(huì)阻斷LH誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)張和卵泡破裂，還會(huì)降低Nppc 和Npr2 的表達(dá)，使其維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯的作用減弱。絕經(jīng)過渡期大鼠卵巢功能衰退與SMAD2基因表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，顆粒細(xì)胞中SMAD4 基因的表達(dá)下調(diào)也是其部分原因[31?32]?；谝陨涎芯?，推測(cè)SMAD2和SMAD4 基因能夠通過調(diào)控雌激素、孕激素分泌和阻斷LH的誘導(dǎo)作用來調(diào)控小尾寒羊發(fā)情初期至排卵前卵巢的生理變化。卵泡的發(fā)育及卵母細(xì)胞的成熟和排卵是雌性動(dòng)物發(fā)情周期的關(guān)鍵。伴隨著動(dòng)物發(fā)情，卵巢中的卵泡也不斷發(fā)育至成熟，SMAD2 和SMAD4 基因是否能夠參與卵泡發(fā)育的優(yōu)勢(shì)化過程，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

分離并采集不同直徑的卵泡，檢測(cè)大、中、小卵泡中SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMAD3 基因mRNA及其編碼蛋白在中卵泡中的表達(dá)量顯著高于大卵泡，在大卵泡與小卵泡、中卵泡與小卵泡間無顯著差異；SMAD2 和SMAD4 基因mRNA及其編碼蛋白在不同直徑的卵泡中的表達(dá)量均無顯著差異。綜上所述，SMAD2 和SMAD4 基因參與小尾寒羊發(fā)情過程中卵巢的生理變化，但不參與卵泡發(fā)育；而SMAD3 基因參與卵泡發(fā)育。研究表明，SMAD3 基因是合成卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，F(xiàn)SH）的必需基因[33]。Li 等[34] 發(fā)現(xiàn)，SMAD3 基因在大鼠不同階段卵泡中差異表達(dá)，過表達(dá)SMAD3 基因會(huì)促進(jìn)雌激素的產(chǎn)生和增殖，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育與閉鎖。Gry等[35]發(fā)現(xiàn)，人SMAD3 基因在卵泡生長(zhǎng)開始就參與了卵泡發(fā)育。Li等[36]發(fā)現(xiàn)，敲除SMAD3 基因會(huì)導(dǎo)致雌鼠的卵泡發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致卵泡閉鎖、生殖能力顯著下降。Zhou 等[37] 發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子microRNAlet-7可降低豬卵巢顆粒細(xì)胞中SMAD3蛋白磷酸化水平來促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖。本研究結(jié)果也表明，SMAD3 基因在卵泡發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用；然而該基因是否能夠通過調(diào)控小尾寒羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖或凋亡來影響卵泡發(fā)育，還需要進(jìn)一步研究。綜上所述，SMAD2、SMAD3 和SMAD4 基因在小尾寒羊卵巢周期性活動(dòng)中的生物學(xué)功能存在差異，SMAD2 和SMAD4 基因參與小尾寒羊發(fā)情初期至排卵前的卵巢生理變化，但不參與卵泡發(fā)育； SMAD3 基因參與卵泡發(fā)育。

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