摘要：目的：通過響應曲面法優(yōu)化生草烏干熱抑菌工藝條件。方法：以成品制劑微生物（細菌、霉菌）數(shù)量和烏頭類雙酯型生物堿轉(zhuǎn)移率為評價指標，選取加熱溫度、加熱時間、鋪盤厚度為考察因素，利用響應曲面法優(yōu)選生草烏抑菌最佳工藝。結(jié)果：生草烏最佳抑菌工藝條件：加熱溫度為106 ℃，加熱時間為10 h，鋪盤厚度為3 cm。結(jié)論：此工藝條件經(jīng)工藝驗證試驗，干熱后選用生草烏入藥的制劑成品微生物指標可達到《中國藥典》2020年版要求，重復性好，且干熱前后烏頭類雙酯型生物堿轉(zhuǎn)移率較高。

關(guān)鍵詞：響應面優(yōu)化；烏頭類雙酯型生物堿轉(zhuǎn)移率；干熱抑菌

草烏屬于烏頭屬植物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解熱等藥理作用，作為常用的中藥臨床用藥［1］。國內(nèi)外專家學者已從烏頭屬植物中分離鑒定了許多種生物堿類化合物，其中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿（hypaconitine），這3種生物堿在烏頭屬植物中最常見，且含量最高，也是該類植物中主要的藥效成分［2］，因此，生藥入藥在生產(chǎn)工藝中，控制烏頭類雙酯型生物堿的轉(zhuǎn)化程度就顯得尤為重要。

1儀器與材料

1.1儀器

CTC2熱風循環(huán)烘箱，江蘇省范群干燥設(shè)備廠有限公司；Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)（配2996PAD檢測器，Empower 3分析軟件），美國Waters公司，minitab statistical software 2010版。

1.2試藥

甲醇，分析純，太倉滬試試劑有限公司；乙腈，色譜純，德國默克集團（Merck KGaA）；純化水，屈臣氏集團；其他試劑均為分析純，太倉滬試試劑有限公司。

生草烏：桂林三金藥業(yè)股份有限公司211108批生草烏，水分7%，粒度≤1.5 cm。

2方法與結(jié)果

2.1干熱方法

每次將生草烏按設(shè)定的不同裝量裝平鋪至設(shè)備配套的不銹鋼托盤，放置在干燥架上，推入熱風循環(huán)烘箱中，在設(shè)定溫度下加熱不同時間。

2.2檢驗方法

（1） 微生物檢測按《中國藥典》2020年版微生物計數(shù)法和控制菌檢查法檢查。

（2） 含量檢測方法參照《中國藥典》2020年版高效液相色譜法測定，并計算轉(zhuǎn)移率=滅菌后飲片的含量/滅菌前飲片的含量×100%。

2.3干熱工藝條件的選擇

影響生草烏干熱抑菌效果的因素有設(shè)備循環(huán)風量、烘箱熱分布均一性、生草烏水分、藥材粒徑大小、加熱溫度、加熱時長、鋪盤厚度。其中設(shè)備性能、生草水分和粒徑波動不大，故不作為本次實驗的考查對象。

干熱抑菌是通過氧化作用使微生物死亡。有趙斌秀，王妍彥等專家學者研究得出在干熱條件下100 ℃作用60 min、120 ℃作用15 min、140 ℃作用10 min可使載體上的大腸桿菌全部滅活。當溫度超過120 ℃時會使微生物表面的有機物碳化［3］。為避免有機成分“碳化”，采用120 ℃以下的溫度作為設(shè)計考察；飲片中存在大量的水分、纖維結(jié)構(gòu)、復雜有機物，需要延長加熱時間。另根據(jù)滅菌柜設(shè)備性能確認，滿載時物料4 h方達到100 ℃穩(wěn)態(tài)溫度，最終選擇干熱溫度100 ℃、105 ℃、110 ℃，干熱時長9 h、10 h、11 h進行響應面工藝優(yōu)化。鋪盤厚度2 cm、3 cm和4 cm三個水平進行響應面優(yōu)化。

2.4中心組合設(shè)計實驗及結(jié)果分析

2.4.1因素和水平的篩選

響應優(yōu)化法以烏頭類雙酯型生物堿轉(zhuǎn)移率為響應值，以鋪盤厚度（A）、加熱溫度（B）、加熱時長（C）為考察因素，選擇minitab軟件進行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)擬合。

2.4.2Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，設(shè)計了3因素3水平共15次實驗點的響應面分析實驗，測定雙酯型生物堿含量，并計算轉(zhuǎn)移率，同步檢測微生物限度。

根據(jù)前期研究，確認生草烏細菌數(shù)、霉菌數(shù)在≤1×105 cfu/g時，就能保證成品微生物限度合格，因此微生物限度為標準。結(jié)果見表1。表1干熱工藝響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

序號鋪盤厚

度/cm加熱溫

度/℃加熱時

長/h細菌

/（cfu·g-1）霉菌

/（cfu·g-1）質(zhì)量分數(shù)

/（g·g-1）轉(zhuǎn)移率

/%12105935 0001 1000.1266.2241001036 0007100.1162.134105930 0002500.1370.743110926 0003000.1266.6531051036 0001 2000.1479.9621101022 0003500.1370.1721051134 0003000.1269.4831051034 0001 0000.1480.3931001137 0008000.1161.41021001036 0001 0000.155.41141051125 0001 5000.1374.91231101120 0001800.1266.91341101021 0002300.1370.7143100932 0001 3000.1161.41531051033 0001 6000.1478.7

干熱前生草烏細菌：3.6×105 cfu/g霉菌：1.6×105 cfu/g；烏頭類雙酯型生物堿含量：0.18%

根據(jù)實驗的結(jié)果可知，細菌數(shù)和霉菌數(shù)均符合≤1×105 cfu/g，符合抑菌設(shè)定要求，因此在各因素擬合回歸中，將以轉(zhuǎn)移率為響應值，得到回歸方程如下：

轉(zhuǎn)移率=-5 323+58.2鋪盤厚度+91.0加熱溫度+97.0加熱時長-4.42鋪盤厚度×鋪盤厚度-0.425 7加熱溫度×加熱溫度-4.92加熱時長×加熱時長-0.305鋪盤厚度×加熱溫度+0.25鋪盤厚度×加熱時長+0.015加熱溫度×加熱時長

回歸決定系數(shù)R-sq=96.2%，回歸模型P=0.005＜0.05，說明響應值擬合程度良好，失擬項0.072＞0.05，說明失擬情況可接受。從下表2中可以看出加熱溫度對烏頭類雙酯型生物堿的轉(zhuǎn)移率有顯著影響（P=0.004＜0.05），鋪盤厚度的二次效應、加熱溫度的二次效應、加熱時長的二次效應均對烏頭類雙酯型生物堿的轉(zhuǎn)移率有顯著影響（P＜0.05）。

響應曲線面圖是響應值針對實驗因素鋪盤厚度、加熱溫度、加熱時長所構(gòu)成的響應面圖形，可以直觀的看出各參數(shù)之間的關(guān)系。本實驗的響應面圖形分析如圖1所示。

圖1響應面優(yōu)化模型的等值線圖和曲面圖

2.4.3最佳工藝的優(yōu)化與放大工藝驗證試驗

運用響應曲面分析中的響應優(yōu)化器，以烏頭類雙酯型生物堿轉(zhuǎn)移率最大為目標，模型給出的最佳參數(shù)為：鋪盤厚度3.2 cm，加熱溫度105.9 ℃，加熱時長10.1 h。

為方便生產(chǎn)，實驗最佳參數(shù)調(diào)整為：鋪盤厚度3 cm，加熱溫度106 ℃，加熱時長10 h，取不同批次的生草烏各5 kg，驗證有效性。實驗結(jié)果烏頭類雙酯型生物堿的轉(zhuǎn)移率波動范圍72%～75%（n=10），RSD=4.2%（RSD＜5%），且位于95%預測區(qū)間，對生草烏的有效成分保留以及抑菌效果均能符合預期。工藝穩(wěn)定、可重復性好。

3討論

本實驗工藝參數(shù)：加熱溫度106 ℃，加熱時間10 h，鋪盤厚度3 cm。有效地保留了生草烏的烏頭類雙酯型生物堿，在生產(chǎn)前端有效抑制微生物數(shù)量，在后續(xù)的工藝步驟對微生物分級消殺，從而最終實現(xiàn)成品滿足微生物限度要求。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.247.

［2］宋東江，陸滿文，李漢青.烏頭堿類化合物毒理學研究概況［J］.中國藥理學通報，1989（5）：272274.

［3］趙斌秀，王妍彥，梁辰，等.脊髓灰質(zhì)炎病毒與大腸桿菌熱抗力的比較及有機物對熱抗力影響的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（3）：6162.

作者簡介：鄒贛昌，男.廣西桂林人，工程師，碩士，研究方向，藥物化學。

通訊作者：俸雅娟，女，廣西桂林人，工程師，本科，研究方向：制藥工程。