摘要：在微生物界，大腸桿菌作為常見的致病病原備受矚目。于動(dòng)物群體中，一旦流行病暴發(fā)，大腸桿菌極易引發(fā)繼發(fā)感染，其如同隱匿的破壞者，直接損害動(dòng)物機(jī)體，從而加劇損失，這無疑對(duì)養(yǎng)殖企業(yè)的正常生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。本研究針對(duì)廣東省展開，研究區(qū)域涵蓋清遠(yuǎn)市、佛山市、茂名市、江門市、云浮市、揭陽市六個(gè)地級(jí)市。從不同發(fā)病豬場(chǎng)采集到72份病料，從中成功分離出4株豬源大腸桿菌。為探究這些菌株的特性，研究采用紙片法測(cè)定分離菌株對(duì)各類抗菌藥物的耐藥性，同時(shí)運(yùn)用人工感染昆明小鼠的方式評(píng)估其中耐藥性最強(qiáng)菌株對(duì)小鼠的致病性。研究結(jié)果顯示，所分離出的4株大腸桿菌均呈現(xiàn)出對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性。其中，耐藥性最為復(fù)雜的一株大腸桿菌，可耐受25種抗菌藥物，其對(duì)小白鼠的半數(shù)致死量達(dá)3.29×107CFU，這一結(jié)果表明該菌株具有一定的臨床致病性。本研究的結(jié)果為廣東省大腸桿菌的耐藥性監(jiān)控提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：廣東?。回i源大腸桿菌；耐藥性；致病性

大腸桿菌（escherichia coli，E.coli）屬革蘭氏陰性菌，可通過糞口或直接接觸進(jìn)行傳播，致病性大腸桿菌主要危害新生及斷奶仔豬，使其發(fā)生傳染率與死亡率均極高的仔豬黃白痢病[1]，以及發(fā)病率低但致死率高的豬水腫病[2]。大腸桿菌可致不同年齡段不同性別的人均發(fā)生急性腹瀉，是導(dǎo)致人腹瀉脫水的最常見病原菌[3]。大腸桿菌作為人與動(dòng)物的常見機(jī)會(huì)致病菌，常伴隨著群體免疫力下降造成繼發(fā)感染，若不及時(shí)控制，容易直接造成患病豬只的大批量死亡。

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化發(fā)展，我國曾有一段時(shí)間大量使用抗生素來控制與治療包括大腸桿菌病在內(nèi)的各種細(xì)菌病[4]。大腸桿菌具有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移[5]、修飾抗生素作用靶位[6]、構(gòu)建外排泵[7]、產(chǎn)生滅活酶[8]等多種產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制，使得大腸桿菌耐藥性日趨增長，逐漸產(chǎn)生了對(duì)多種抗生素具有耐藥性的多重耐藥大腸桿菌[9]。這既使養(yǎng)殖業(yè)疫病的控制難度增大，又使人感染多重耐藥大腸桿菌時(shí)難以找到合適的藥物進(jìn)行治療[10]，因此更需要警惕。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)6周齡昆明小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：44007200120264。藥敏紙片購自常德比克曼生物科技有限公司；LB肉湯、LB瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PCR引物、Taq酶、DL2000 DNA Marker購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 樣品來源

2022年從廣東省的清遠(yuǎn)市、佛山市、茂名市、江門市、云浮市、揭陽市六個(gè)地級(jí)市的不同豬場(chǎng)采集72份病料，共分離出4株豬源大腸桿菌。

1.3 細(xì)菌鑒定

在無菌操作臺(tái)中將保存有大腸桿菌的瓷珠接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)24 h。以菌液為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA PCR檢測(cè)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]選取16s rRNA通用引物，送生工進(jìn)行測(cè)序。

1.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國國家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）頒布的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》2023版指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法（K-B法）測(cè)定4株大腸桿菌的藥物敏感性。按照2023版CLSI判讀標(biāo)準(zhǔn)，將所有大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果分為耐藥（R）中度敏感（I）和敏感（S）。

1.5 小鼠致病力試驗(yàn)

選擇12只健康昆明小鼠，雌雄隨機(jī)，體重30～34 g。隨機(jī)分為4組，每組3只小鼠，其中3組為試驗(yàn)組，1組為陰性對(duì)照組。調(diào)整菌液設(shè)置3個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度各注射一組小鼠。試驗(yàn)組中的小鼠每只腹腔注射0.2 mL菌液，陰性對(duì)照組小鼠每只注射0.2 mL滅菌PBS。每組小鼠隔離飼養(yǎng)，避免相互感染，連續(xù)觀察7 d，感染后每12 h記錄一次臨床癥狀、存活數(shù)以及體重變化。對(duì)死亡小鼠立即解剖，對(duì)病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，通過細(xì)菌形態(tài)觀察、PCR方法進(jìn)行鑒定，使用改良寇氏法計(jì)算小鼠的半數(shù)致死量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定結(jié)果

PCR結(jié)果出現(xiàn)大小約為1 500 bp的條帶，符合預(yù)期。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出同源性在97 %以上的菌株序列，結(jié)合菌落形態(tài)判斷，本研究共分離到4株豬源大腸桿菌，分別命名為E.coli-fs022-1、2、3、4（圖1）。

2.2 藥敏結(jié)果

對(duì)4株豬源大腸桿菌菌株進(jìn)行29種抗菌藥物的耐藥性試驗(yàn)。4株大腸桿菌均有多重耐藥現(xiàn)象，其中菌1耐25種藥，2耐18種藥，3耐19種藥，4耐13種藥（表1）。

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

選取耐藥性最高的E.coli-fs022-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)組小鼠在注射菌液后最早在4 h內(nèi)死亡，最晚在28 h內(nèi)死亡，28 h后無死亡情況，最低攻毒劑量組和陰性對(duì)照組的小鼠未死亡，半數(shù)致死量為3.29×107 CFU。攻毒后小鼠出現(xiàn)精神沉郁、抱團(tuán)、呼吸急促、食欲減退等癥狀，28 h后出現(xiàn)癥狀的小鼠逐漸恢復(fù)正常。攻毒后1 d內(nèi)小鼠體重出現(xiàn)下降，2 d后體重逐漸上升。說明該毒株有一定的致病性，在較大接毒劑量時(shí)可以迅速使小鼠致死。

經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)PCR鑒定，僅有對(duì)照組小鼠體內(nèi)未分離到豬源大腸桿菌。觀察到攻毒死亡的小鼠心臟、肝臟、脾臟等部位均發(fā)生了不同程度的淤血、腫大和出血，腸段松軟、腫脹充氣，腸系膜有不同程度出血。陰性對(duì)照組小鼠內(nèi)臟器官正常。以上結(jié)果說明致病菌為豬源大腸桿菌。

3 討論

在中國經(jīng)濟(jì)蓬勃發(fā)展的進(jìn)程中，人民生活水平持續(xù)攀升，這一變化促使民眾對(duì)公共衛(wèi)生安全與環(huán)境衛(wèi)生安全的關(guān)注度日益高漲，針對(duì)獸用抗生素的“禁抗限抗”訴求也愈發(fā)強(qiáng)烈。致病性大腸桿菌，在微生物界作為常見致病病原的一員，于動(dòng)物群體患病時(shí)，往往扮演著雪上加霜的角色。它極易引發(fā)繼發(fā)感染，進(jìn)而直接致使患病豬只死亡，這無疑使養(yǎng)豬企業(yè)在疾病防控方面面臨更大的挑戰(zhàn)，遭受的損失也不斷擴(kuò)大。然而，養(yǎng)豬場(chǎng)為了控制細(xì)菌病，存在濫用抗生素的現(xiàn)象。這種行為的后果是，大腸桿菌的耐藥性不斷強(qiáng)化。如此一來，當(dāng)人類感染多重耐藥大腸桿菌時(shí)，合適的治療藥物將難覓蹤跡。鑒于此，從養(yǎng)豬場(chǎng)這一源頭減少抗生素的使用勢(shì)在必行。

廣東地區(qū)，鄔蘇曉等[13]研究發(fā)現(xiàn)2008年分離大腸桿菌對(duì)7種藥耐藥。王秀梅等[14]2007年分離的大腸桿菌最多耐17種藥。郭瀟木等[15]2011年的豬源大腸桿菌以12～14耐居多，僅有1株同時(shí)耐18種。賀丹丹等[16]2011—2012年患病豬源菌株的多重耐藥全部為5耐及以上。植嬋萍等[17]2014年豬源多重耐藥菌株主要集中于3～7耐，最高為10耐。饒麗麗等[18]2014年豬源大腸桿菌多重耐藥主要集中在4～9耐，最多耐13種藥。賈春玲等[19]2020—2021年大腸桿菌最多同時(shí)耐8種藥。經(jīng)搜索，我國此前公開報(bào)道的多重耐藥性最強(qiáng)的豬源大腸桿菌，為2023年趙婭婭等[20]在河南新鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)，耐24種藥物。

本研究的藥敏結(jié)果中，分離菌株對(duì)青霉素類、林可酰胺類、多肽類、喹諾酮類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類具有較高的耐藥性。其中E.coli-fs022-1對(duì)13類25種藥均耐藥。本研究的4株菌最少耐13種藥，最多耐25種藥，耐藥種類更多，同時(shí)還具有一定致病性。表明廣東地區(qū)豬源大腸桿菌多重耐藥較以前更為嚴(yán)重，應(yīng)該引起注意。

于“禁抗限抗”政策推行之際，如何應(yīng)對(duì)多重耐藥性豬源大腸桿菌所致感染這一問題，亟待解答且日益凸顯其重要性。知悉豬源大腸桿菌的流行態(tài)勢(shì)以及耐藥情形，有助于在減少乃至杜絕使用抗生素類抗菌藥物的大趨勢(shì)下，達(dá)成對(duì)豬源大腸桿菌的有效防控。

4 結(jié)論

本次研究的4株大腸桿菌均有多重耐藥現(xiàn)象，其中E.coli-fs022-1耐25種藥，E.coli-fs022-2耐18種藥，E.coli-fs022-3耐19種藥，E.coli-fs022-4耐13種藥。進(jìn)行致病力試驗(yàn)的E.coli-fs022-1半數(shù)致死量為3.29×107 CFU，有一定的致病性。提示廣東省豬源大腸桿菌的耐藥性比以前有所加強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王紅寧，劉世貴，劉書亮，等.規(guī)模化豬場(chǎng)仔豬黃、白痢的防治研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999（4）：25-28.

[2] 王俊，文元芳，鄧偉，等.一起仔豬水腫病的診斷與治療[J].湖南畜牧獸醫(yī)，2023（1）：21-22.

[3] 蔣俊麗，陳曉，葉先飛，等.急性腹瀉患者致瀉性大腸埃希菌流行情況及耐藥性分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2017，29（6）：689-693.

[4] 王利，洪穎，陳謹(jǐn)，等.安徽省馬鞍山市2014-2018年腹瀉患者中致瀉性大腸埃希菌病原學(xué)及流行特征分析[J].疾病監(jiān)測(cè)，2019，34（11）：1010-1016.

[5] 蔣紅霞，曾振靈.細(xì)菌耐藥機(jī)制及耐藥性控制對(duì)策[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001（4）：4-7.

[6] 徐?；ǎｇ娤?，秦愛建，等.細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，41（1）：156-160.

[7] 王芝超，左麗，曠年玲，等.黃連對(duì)不同機(jī)制介導(dǎo)的大腸桿菌耐藥的消除作用[J].中國獸醫(yī)雜志，2022，58（11）：16-20.

[8] 尹秀玲，牛發(fā)良.大腸桿菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007（1）：49-53.

[9] 楊微.大腸桿菌耐藥性的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué)，2011，32（6）：116-118.

[10]桓新，盧大雷，馬穎，等.開封市健康人群大腸埃希菌耐藥性變遷及多重耐藥分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（3）：339-341.

[11]尹姣姣，何敏，翟晶晶，等.晉中地區(qū)雞致病性大腸桿菌分離株的鑒定及其16S rDNA序列的同源性分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2019，49（3）：341-346.

[12]羅干，鄒宏，任紹科，等.鴨源致病性大腸桿菌O抗原與毒力基因檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)[J].中國畜牧獸醫(yī)，2023，50（2）：713-721.

[13]鄔蘇曉，肖正中.豬鏈球菌和豬大腸桿菌對(duì)19種藥物的敏感性分析[J].養(yǎng)豬，2008（6）：47-48.

[14]王秀梅，蔣紅霞，廖曉萍，等.豬源致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因及抗菌藥耐藥性的調(diào)查[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（19）：4109-4115.

[15]郭瀟木，楊銅，賀丹丹，等.廣東地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性及其系統(tǒng)發(fā)育群的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（1）：182-186.

[16]賀丹丹，黃良宗，陳孝杰，等.不同動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（10）：211-215.

[17]植嬋萍，郭小婷，姚旭，等.有機(jī)農(nóng)場(chǎng)雞、豬源大腸桿菌耐藥性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（12）：3351-3357.

[18]饒麗麗，羅東妹，陳佩玲，等.屠宰前雞、豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（7）：225-229.

[19]賈春玲，林森馨，李天宇，等.中山地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥性分析[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2021，46（6）：26-27+49.

[20]趙婭婭，秦保亮，劉星珂，等.仔豬多重耐藥大腸桿菌的分離鑒定和藥物敏感性分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2023，59（5）：70-74.