摘要 ［目的］明確新型植物免疫激活蛋白維大力（VDAL）對煙草花葉病毒（TMV）的抑制作用。［方法］采用半葉枯斑法和分光光度法，分別測定植物免疫激活蛋白VDAL對TMV的抑制作用和煙草植株過氧化物酶（POD）活性的影響。［結(jié)果］VDAL對TMV具有較好的體外鈍化作用，當(dāng)鈍化時間為90 min時，枯斑抑制率可達(dá)到80.76%；噴藥3次后抑制率為85.04%，且過氧化物酶活性較對照增加了1.26倍。［結(jié)論］VDAL可能通過對病毒的鈍化作用并誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生防御反應(yīng)，進(jìn)而防治煙草花葉病毒病。

關(guān)鍵詞 煙草花葉病毒；維大力；半葉枯斑法；分光光度法；過氧化物酶

中圖分類號 S 435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）22-0140-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Inhibitory Effect of Novel Plant Immune Activating Protein VDAL on Tobacco Mosaic Virus

HEI Ya-ya1， LI Yong-liang2， GUO Lin-lin1 et al

（Yangling Xiang Lin Agricultural and Biotechnology Science Co.， Ltd.， Yangling， Shaanxi 712100;2. Tobacco Company of Baoshan City Yunnan Province， Baoshan， Yunnan 678000）

Abstract ［Objective］ To clarify the inhibitory effect of a new plant immune activating protein （VDAL） on tobacco mosaic virus （TMV）. ［Method］ The inhibition of plant immune activating protein （VDAL） on TMV and the effect on peroxidase （POD） activity in tobacco plants were determined by spot inhibition and spectrophotometry. ［Result］ VDAL had a good inactivation effect on TMV in vitro. When the inactivation time was 90 min， the inhibition rate of lesions could reach 80.76%. After three times of spraying， the inhibition rate could rise to 85.04%， and the peroxidase activity increased 1.26 times compared with the control. ［Conclusion］ VDAL may control TMV disease by inactivating the virus and inducing the defense response of tobacco plants.

Key words Tobacco mosaic virus;VDAL;Half-leaf spot method;Spectrophotometry;Peroxidase

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是世界上第一個被發(fā)現(xiàn)的植物病毒，能夠侵染400多種植物，有著非常廣泛的寄主范圍^［1］。由TMV侵染引起的煙草花葉病毒病廣泛分布于世界各地，其田間發(fā)病率極高，嚴(yán)重時可達(dá)100%，由于TMV在植物細(xì)胞中絕對寄生，難以防治，被稱為“植物癌癥”^［2］。感染TMV后的煙草品質(zhì)和產(chǎn)量均會下降，嚴(yán)重時甚至顆粒無收，給種植煙草的農(nóng)戶和企業(yè)等帶來巨大的經(jīng)濟損失^［3］。由于化學(xué)防治方法有著高效、經(jīng)濟、快速等優(yōu)點，所以在生產(chǎn)中人們常常選擇用化學(xué)藥劑防治煙草花葉病毒病，但是長期大量以及不規(guī)范使用化學(xué)農(nóng)藥，很容易引起環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及抗藥性等問題，不利于我國煙草產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。因此，如何避免防治防治煙草病毒病過程中化學(xué)農(nóng)藥不合理使用已經(jīng)成為生產(chǎn)中亟待解決的問題^［4］。

植物免疫誘抗劑是指利用來源于生物活體或其代謝產(chǎn)物的某種物質(zhì)誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生抗性的一種新型生物農(nóng)藥，包括蛋白多肽類、有機酸類、寡糖類和無機化合物類等^［5-6］。植物免疫激活蛋白作為植物免疫誘抗劑的一種，在植物受到外界環(huán)境或者病原菌等不利因素的影響時，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生各種免疫防御反應(yīng)，促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)、水分等的吸收，增強植株的抗病能力，進(jìn)而使植物更加健康地生長，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時也能夠降低化學(xué)農(nóng)藥和肥料的使用量，符合農(nóng)業(yè)綠色和可持續(xù)發(fā)展的要求，已經(jīng)成為農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用的熱點之一^［7-10］。維大力（VDAL）是一種新型的植物免疫激活蛋白，來源于棉花黃萎菌，它不僅可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的多種生長代謝活動，促進(jìn)作物的生長發(fā)育，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，增加產(chǎn)量和收入，還可以激活和誘導(dǎo)植物對各種病蟲害的抗性^［11］。近年來國內(nèi)已經(jīng)有VDAL相關(guān)產(chǎn)品促產(chǎn)增收、抗病蟲害等相關(guān)報道。馬全偉等^［12］研究發(fā)現(xiàn)，VDAL可以提高生菜的產(chǎn)量與品質(zhì)。李剛等^［13］研究發(fā)現(xiàn)，VDAL和薊馬信息素黏蟲板共同使用可以減輕薊馬對芒果的危害。張動軍等^［14］研究發(fā)現(xiàn)，施用VDAL不僅能提高小麥的抗逆能力，還能促進(jìn)其增產(chǎn)增收。此外，還有一些研究表明，VDAL可以提高馬鈴薯、葡萄等作物的品質(zhì)，并一定程度提高作物的抗病性^［15-17］。有關(guān)VDAL在煙草上的應(yīng)用研究少見報道。

過氧化物酶（POD）作為一種氧化還原酶與植物體內(nèi)的多種生理生化反應(yīng)都相關(guān)，它除了能夠催化酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)過程和促使木質(zhì)素的聚合外，還能降低活性氧的含量，避免因其濃度過高而破壞細(xì)胞膜^［18］。Morkunas等^［19］研究表明過氧化物酶是植物體為了抵御病原菌的侵染，形成防御系統(tǒng)的重要因素之一。目前有很多研究也已經(jīng)把過氧化物酶活性變化作為植物抗病性鑒定的一項指標(biāo)。周東興等^［20］研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌可以誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生更多的POD、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御酶，進(jìn)而提高其對枯萎病的防效。還有研究表明，一種新型植物源殺菌劑苯丙烯菌酮微乳劑，在質(zhì)量濃度為40 mg/L時對TMV的防效為75%，且能顯著提高植株防御酶活性^［21］。彭?，摰?sup>［^22］研究報道，將2種生防真菌的發(fā)酵液與氨基寡糖素共同使用，可以促進(jìn)煙草幼苗的生長和煙草體內(nèi)的各種防御酶活性的提高，從而更好地防治煙草黑脛病和根黑腐病。

為明確植物免疫激活蛋白VDAL對煙草花葉病毒病是否具有較好的誘導(dǎo)防治效果，該研究以煙草為試驗材料，測定施用VDAL對TMV的體外鈍化作用、誘導(dǎo)抗病性以及煙草植株P(guān)OD活性的影響，旨在為VDAL在煙草生產(chǎn)中的合理推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物。心葉煙，為TMV枯斑寄主。

1.1.2 供試病毒。TMV由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

1.1.3 供試藥劑。VDAL新型植物免疫激活蛋白干粉（含2% VDAL蛋白），由楊凌翔林農(nóng)業(yè)生物有限公司生產(chǎn)提供；抗病毒劑A（含3%氨基寡糖素），由河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司生產(chǎn)提供。

1.2 方法

1.2.1 煙草育苗。將煙草種子均勻灑在裝有基質(zhì)的育苗盤上，并覆蓋適量基質(zhì)，將育苗盤放入氣候室［溫度（26±1）℃，光照12 h/d，濕度60%］培養(yǎng)，20 d后移栽至花盆（高9.5 cm，直徑11.0 cm）中，待幼苗長至5～8葉時備用。

1.2.2 病毒接種。 選擇心葉煙上部最新長出且展開的葉片采用摩擦接種法接種TMV（質(zhì)量濃度為20 μg/mL）：先在接種的葉片表面灑少許粒徑為37 μm的金剛砂，再用毛筆蘸取適量TMV溶液均勻涂抹于葉片表面，并于接種8 min后用清水沖洗。

1.2.3 VDAL對TMV的體外鈍化作用。采用半葉枯斑法^［23］進(jìn)行鈍化試驗：挑選健康且長勢一致的5～6葉期心葉煙，將VDAL稀釋7 500倍與TMV等體積混合后分別鈍化30、60和90 min，摩擦接種于左半邊葉片（處理）；抗病毒劑A稀釋400倍與TMV等體積混合分別鈍化30、60和90 min后，摩擦接種于左半邊葉片（藥劑對照）；無菌水與TMV等體積混合后分別鈍化30、60和90 min，摩擦接種于右半邊葉片（CK1為VDAL空白對照，CK2為抗病素劑A空白對照），每個處理接種3個葉片，重復(fù)3次，并在3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，計算枯斑抑制率。計算公式如下：

枯斑抑制率（%）=（對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù)）對照枯斑數(shù)×100（1）

1.2.4 VDAL誘導(dǎo)煙草抗TMV活性測定。

采用羅琰^［24］的方法并加以改進(jìn)。選擇健康、長勢一致的5～6葉期心葉煙，共設(shè)置3個處理：清水（空白對照CK）、抗病毒劑A 400倍稀釋液（藥劑對照）以及VDAL 7 500倍稀釋液，每隔5 d噴施1次藥液，總共噴3次，在每次噴完藥24 h后進(jìn)行TMV摩擦接種。每個處理接種3個葉片，設(shè)置3次重復(fù)，并于接種3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，根據(jù)公式（1）計算枯斑抑制率。

1.2.5 煙草植株防御酶活性測定。

選擇健康、長勢一致的8～10葉期心葉煙，設(shè)置對照（空白對照CK）、抗病毒劑A 400倍稀釋液（藥劑對照）和VDAL 7 500倍稀釋液，共3個處理。共施藥2次，每次間隔5 d，分別在第1次施藥后的第 0、1、3、5、7、9天剪取同一葉位的煙草葉片，每個處理隨機選取3株，重復(fù)3次，液氮速凍后在-80 ℃冰箱保存待測定POD活性，測定方法參照劉偲嘉^［25］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件及Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VDAL對TMV的體外鈍化作用

從表1可以看出，VDAL與抗病毒劑A對TMV都具有一定的鈍化作用，其中VDAL處理組的鈍化效果隨著鈍化時間的延長逐漸提高，當(dāng)鈍化時間為90 min時，抑制率高達(dá)80.76%，而抗病毒劑A處理組的抑制率在31.14%～34.44%。通過分析可知，相同處理的不同鈍化時間的抑制率之間無顯著差異，而在相同的鈍化時間內(nèi)，VDAL處理組的抑制率均顯著高于抗病毒劑A處理組，可見VDAL對TMV體外鈍化效果明顯。

2.2 VDAL誘導(dǎo)煙草抗TMV活性

由表2可知，隨著噴藥次數(shù)的增加，VDAL和抗病毒劑A對TMV的誘導(dǎo)效果均越來越好，其中在累計施藥1次和2次后，VDAL處理組的煙草葉片枯斑數(shù)均顯著少于抗病毒劑A處理組和CK處理組，且在只噴施1次VDAL后，枯斑抑制率就已經(jīng)達(dá)到了46.99%，而在累計噴施3次后抑制率增加到85.04%，高于抗病毒劑A處理（80.55%），但沒有表現(xiàn)出明顯的差異性?？梢奦DAL能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗TMV活性，且在一定范圍內(nèi)增加施藥次數(shù)可以提高煙草植株的抗病能力，從而更有效地防治煙草花葉病毒病。

2.3 煙草植株P(guān)OD活性

從圖1可以看出，與CK相比，用VDAL和抗病毒劑A處理后，煙草植株體內(nèi)POD活性均有不同程度提高。其中VDAL處理在第1次施藥后7 d（第2次施藥后1 d）時POD活性達(dá)到峰值，為CK的1.26倍，且?guī)缀踉谡麄€檢測時期酶活均顯著高于CK，尤其是第1次施藥后24 h時較CK增加了142.32%?？共《緞〢對照組在噴藥后3 d時POD活性達(dá)到最大值，是CK的1.30倍。而從POD活性的變化趨勢來看，3組處理POD活性均呈不規(guī)律變化，這可能是煙草植株為了適應(yīng)外界環(huán)境的變化或其他因素刺激而產(chǎn)生的防御反應(yīng)，但是VDAL處理后的POD活性總體比CK活性高，說明VDAL激活了煙草植株的防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)煙草植株葉片內(nèi)POD 活性的提高，進(jìn)而增強了煙草植株的抗病性。

3 討論與結(jié)論

植物在受到一定的刺激后，能夠激活自身的防御系統(tǒng)從而去抵御外界不良條件的干擾。TMV和枯斑寄主煙草之間存在著一種相互影響的機制，當(dāng)TMV侵染煙草植株時會誘發(fā)植株自身對TMV的抵抗，從而使植物產(chǎn)生過敏性壞死（HR）反應(yīng)，因此會在葉片上產(chǎn)生大大小小的枯斑，枯斑的大小和數(shù)量能夠體現(xiàn)出植株抵抗外界刺激能力的強弱，從而反映出藥劑誘導(dǎo)作用的高低。該研究通過噴施VDAL后煙草植株感染TMV所產(chǎn)生的HR反應(yīng)的強弱以及POD活性的變化作為判斷其對TMV的誘導(dǎo)抗性強弱的指標(biāo)。研究結(jié)果表明，VDAL對TMV具有較好的體外鈍化作用，且在一定范圍內(nèi)隨著鈍化時間的延長，枯斑抑制率也逐漸升高，當(dāng)鈍化90 min時抑制率為80.76%；其次VDAL也能夠很好地誘導(dǎo)煙草植株對TMV產(chǎn)生抗性，噴施1次藥劑時枯斑抑制率已經(jīng)達(dá)到46.99%，累計噴施1次和2次藥劑時，VDAL處理組的枯斑數(shù)均明顯少于CK，抑制率顯著高于藥劑對照組，且在一定范圍內(nèi)隨著施藥次數(shù)的增加誘導(dǎo)效果也越來越好，在第3次施藥后抑制率高達(dá)85.04%，和抗病毒A藥劑處理的效果相當(dāng)。蘇小記等^［26］研究顯示，每次間隔7 d接連噴施20%氨基寡糖素水劑3～4次時，對TMV有明顯的抑制作用，防效為72.4%～77.9%。余清等^［27］研究報道，氨基寡糖素對煙草植株的生長具有明顯促進(jìn)作用，且接連噴施4次能夠有效防治煙草花葉病毒病，防效為64.19%。在該研究中噴施VDAL 3次，對煙草花葉病毒病的抑制率為85.04%。

誘導(dǎo)抗性是指植物在受到不良條件的影響后，引起自身產(chǎn)生一系列免疫防御反應(yīng)來抵御病原菌的侵染，降低病害的發(fā)生率和嚴(yán)重程度的抗病機制。該研究結(jié)果表明，用VDAL噴施處理煙草植株后3 d，POD活性開始上升，在第7天（2次噴藥后1 d）達(dá)到最大值，為CK的1.26倍，且在后2次測定時POD活性均顯著高于CK，說明VDAL激發(fā)了煙草防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)煙草植株體內(nèi)過氧化物酶活性的提高，這是誘導(dǎo)煙草抗病的重要機制之一。

綜上所述，植物免疫激活蛋白VDAL可以有效抑制TMV對煙草植株的侵染，并且能夠通過誘導(dǎo)煙草自身產(chǎn)生抗病性，進(jìn)而達(dá)到防治病毒病的效果，使煙草植株能夠健康生長，該試驗為煙草花葉病毒病的田間試驗和綠色防控提供了技術(shù)參考，而關(guān)于VDAL與其他產(chǎn)品復(fù)配防治煙草花葉病毒病等方面有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 司世飛，宋莉莎，任靜，等.一株抗煙草赤星病解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定［J］.河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，38（4）：410-415.

［2］ HAN Y G，LUO Y，QIN S R，et al.Induction of systemic resgZK/1/cdYRAP4Kd9kYU60w==istance against tobacco mosaic virus by Ningnanmycin in tobacco［J］.Pesticide biochemistry and physiology，2014，111：14-18.

［3］ MCGRATH M T，SHISHKOFF N.Evaluation of biocompatible products for managing cucurbit powdery mildew［J］.Crop protection，1999，18（7）：471-478.

［4］ 劉莉，張冠江，劉元德，等.新型天然免疫誘抗劑對煙草病毒病的效果研究［J］.農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2020（11）：126-127.

［5］ 邱德文.植物免疫誘抗劑的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2014，16（1）：39-45.

［6］ SCHWESSINGER B，RONALD P C.Plant innate immunity：Perception of conserved microbial signatures［J］.Annual review of plant biology，2012，63（1）：451-482.

［7］ 謝尚強，王文霞，張付云，等.植物生物刺激素研究進(jìn)展［J］.中國生物防治學(xué)報，2019，35（3）：487-496.

［8］ 邱德文.我國植物免疫誘導(dǎo)技術(shù)的研究現(xiàn)狀與趨勢分析［J］.植物保護，2016，42（5）：10-14.

［9］ QIU D W，DONG Y J，ZHANG Y，et al.Plant immunity inducer development and application［J］.Molecular plant-microbe interactions，2017，30（5）：355-360.

［10］ JONES J D G，DANGL J L.The plant immune system［J］.Nature，2006，444（7117）：323-329.

［11］ 孫風(fēng)清，李娟起，齊俊生，等.苗期葉面噴施大麗花輪枝孢激活蛋白（VdAL）對黃瓜商品苗貯藏質(zhì)量的影響［J］.中國蔬菜，2016（3）：48-52.

［12］ 馬全偉，王淑榮，崔艮中，等.新型植物免疫激活蛋白維大力（VDAL）對生菜產(chǎn)量及品質(zhì)的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2021（2）：26-28.

［13］ 李剛，覃保榮，梁杰強，等.薊馬信息素粘蟲板+植物免疫激活蛋白在芒果生產(chǎn)上的應(yīng)用效果［J］.中國農(nóng)技推廣，2021，37（3）：77-78，84.

［14］ 張動軍，王香芝，張付強，等.新型植物免疫激活蛋白維大力（VDAL）對小麥抗逆及產(chǎn)量的影響［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2020（10）：86-89.

［15］ 薛建光，王琳，張付強，等.新型植物免疫激活蛋白維大力在馬鈴薯上的增產(chǎn)抗病作用初探［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2020，40（24）：4-7.

［16］ 王艷君，付玉華，鐘英麗，等.大麗輪枝孢（Verticillium dahliae）Asp f2類蛋白（VDAL）在水稻（Oryza sativa）中抵御真菌病害及提高產(chǎn)量的功能分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2020，28（12）：2091-2107.

［17］

馬柏林，羅桂杰，劉博，等.噴施不同濃度大麗花輪枝孢鋅離子結(jié)合蛋白（VdAL）對宿曉紅葡萄果實品質(zhì)的影響［J］.北方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，48（4）：110-115.

［18］ 陳捷.植物病理生理學(xué)［M］.沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

［19］ MORKUNAS I，GMEREK J.The possible involvement of peroxidase in defense of yellow lupine embryo axes against Fusarium oxysporum［J］.Journal of plant physiology，2007，164（2）：185-194.

［20］ 周東興，王恩澤，劉多，等.番茄枯萎病生防細(xì)菌的篩選及對植株防御酶活性的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2020，39（5）：1753-1760.

［21］ 劉澄瑾，張洪雨，孫禮雪，等.苯丙烯菌酮誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒（TMV）及對幾種防御酶活性的影響［J］.農(nóng)藥，2022，61（10）：767-770.

［22］ 彭?，摚锶~韓，李曉芳，等.生防真菌與氨基寡糖素組合對煙草黑脛病和根黑腐病的防治［J］.中國煙草科學(xué)，2021，42（1）：47-53.

［23］ 田波，裴美云.植物病毒研究方法：上冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

［24］ 羅琰.香菇多糖對煙草花葉病毒的抑制作用研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（24）：147，163.

［25］ 劉偲嘉.PS04菌株胞外多糖誘導(dǎo)植物抗性及其應(yīng)用研究［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［26］ 蘇小記，賈麗娜.2.0%氨基寡糖素水劑防治煙草病毒病藥效試驗［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，51（3）：55-56.

［27］ 余清，劉勇，莫笑晗，等.氨基寡糖素在煙草上的應(yīng)用［J］.中國生物防治，2002，18（3）：128-131.