摘 要：柴油污染對環(huán)境生物多樣性和人類健康造成了嚴重威脅，微生物修復(fù)是目前柴油污染場地修復(fù)中的重要手段之一。以柴油為唯一的碳源，從四川某高校一垃圾堆放點的土壤中分離出一株芽孢桿菌屬Bacillus的菌株S3-2-LX，菌體呈桿狀，菌落呈乳白色圓形。為了驗證該菌株是否具有多環(huán)芳烴降解能力，開展了多環(huán)芳烴降解培養(yǎng)實驗，并基于Illumina HiSeq 2000平臺進行de novo測序。結(jié)果表明：培養(yǎng)7 d后，S3-2-LX菌株對萘、菲和芘的降解率分別為99.1%、42.1%和29.2%。S3-2-LX基因組測序總長度5 869 851 bp，共得到53個Scaffold，GC含量為34.89%，能注釋到COG、KEGG的基因數(shù)目分別為4211、3060個；S3-2-LX具有與烴類代謝相關(guān)的代謝通路，擁有降解烷烴、二惡英、二甲苯、苯甲酸、多環(huán)芳烴等的能力。通過對S3-2-LX的生理特性和代謝途徑分析，進一步揭示了其降解柴油的關(guān)鍵步驟和機制。

關(guān)鍵詞：柴油降解菌；分離和鑒定；芽孢桿菌屬；基因組測序；基因注釋

中圖分類號：Q93-3；Q781 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-5072（2024）06-0569-10

石油產(chǎn)品在大規(guī)模生產(chǎn)、運輸和使用中產(chǎn)生的污染物成為環(huán)境中普遍存在的污染［1］，這些石油污染物在環(huán)境中會長期滯留，對生態(tài)環(huán)境安全構(gòu)成潛在的威脅［2］。柴油作為商業(yè)石油產(chǎn)品的一種，是環(huán)境中常見的石油污染物，也是環(huán)境治理中的重要修復(fù)對象［3］。相較于物理和化學(xué)修復(fù)，生物修復(fù)具有更多優(yōu)勢，可以利用微生物的多種代謝能力去除環(huán)境中的柴油污染物，且不易導(dǎo)致土壤的二次污染［4］。然而，不同的土壤環(huán)境條件和柴油污染物組成可能使得施入的柴油降解微生物菌劑在污染場地環(huán)境中適應(yīng)能力不足，從而限制了它們的生長速度和修復(fù)效率，影響生物修復(fù)的效果［5］。因此，研究原位土壤中的土著柴油降解微生物的生態(tài)和生理代謝潛力對實施生物修復(fù)至關(guān)重要［6］。

自然界中存在著豐富多樣的柴油降解微生物，如在油田土壤［7］、海洋沉積物［8］和紅樹林沉積物［9］等不同環(huán)境中均能分離出具有柴油降解能力的微生物。然而，柴油污染物是一種復(fù)雜的混合物，主要由烷烴類化合物和芳香族化合物組成，不同類型的柴油降解菌對這些化合物的降解具有特異性和不同的效率［10］。Garrido等［11］從柴油污染場地的根際土壤中分離出的以Pseudomonas、Aquabacterium、Chryseobacterium和Sphingomonadaceae為主的細菌聯(lián)盟能夠利用不同類型的烷烴和多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）作為唯一的碳源和能源進行生長。Gran-scheuch等［12］從受柴油污染的南極土壤中分離出的PAHs高效降解細菌Sphingobium xenophagum D43FB能夠很好地修復(fù)原位柴油污染物。組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得對柴油降解微生物的代謝功能基因更為明晰［13］。例如，參與烷烴降解過程的烷烴單加氧酶基因（AlkB）、烷烴單加氧酶基因（Alkm）和細胞色素P450基因（CYP）［14-15］；參與PAHs降解過程的兒茶酚2，3-雙加氧酶基因（xylE）、萘雙加氧酶基因（ndoB）、吡喃雙加氧酶基因（nidA）和芘雙加氧酶大亞基基因［15-16］。因此，通過分析柴油降解菌株的基因組信息，可以挖掘其代謝柴油組分的潛力，能定向地為柴油污染場地篩選高效降解菌種進行生物修復(fù)。

因此，本研究針對一處垃圾堆放點的土壤，以柴油為添加碳源，篩選能降解柴油的微生物。同時，對分離的菌株開展了培養(yǎng)實驗，驗證其對PAHs的降解能力，并結(jié)合基因組測序技術(shù)對其代謝途徑和潛力進行分析，以揭示其對柴油組分的降解潛力，為未來柴油污染場地的生物修復(fù)提供有效的菌株信息。

1 材料和方法

1.1 土壤來源

土壤樣品采自四川省南充市西華師范大學(xué)校內(nèi)的一廚余垃圾堆放點（106°07′08″E，30°81′ 21″N），通過無菌鏟從表層（0～10 cm）土壤中采集，并將其裝入塑封袋中，在-20 ℃冰箱中保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。

LB固體培養(yǎng)基：在1 L的液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂粉，倒入滅菌的培養(yǎng)皿。

無機鹽培養(yǎng)基（Mineral Salt Medium，MSM）［17］：5 mL PBS，3 mL MgSO4溶液，1 mL CaCl2溶液，1 mL FeCl3溶液，1 mL微量元素溶液，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。

選擇性無機鹽液體培養(yǎng)基：在已滅菌的MSM中加入1%（按總體積計算）無菌柴油，并使用0.22 μm的濾膜進行過濾滅菌。

選擇性無機鹽固體培養(yǎng)基：向MSM中添加1.5%（按總體積計算）的瓊脂粉，滅菌后倒入平板中。待平板凝固后，取100 μL柴油涂布于平板表面，制成油平板。

含PAHs的MSM：稱量0.05 g萘（二環(huán)PAH）至100 mL培養(yǎng)瓶中，移至通風(fēng)櫥。向培養(yǎng)瓶中加入丙酮溶液定容至100 mL，從而制得500 mg·L-1萘母液。將培養(yǎng)瓶口用封口膜密封，避光保存。向已滅菌的100 mL的培養(yǎng)瓶中加入5 mL的萘母液，將其置于通風(fēng)櫥中約30 min。待丙酮揮發(fā)后，加入已滅菌的45 mL MSM，從而制得45 mL含50 mg·L-1萘的MSM。制備含50 mg·L-1菲（三環(huán)PAH）和50 mg·L-1芘（四環(huán)PAH）的MSM的方法與上述相同。

1.3 柴油降解菌的分離方法

取10 g土樣加入裝有100 mL無菌水的培養(yǎng)瓶中，置于30 ℃、180 r·min-1的恒溫振蕩箱中振蕩3 h后靜置30 min，收集上層液體作為土壤懸濁液。取10 mL土壤懸濁液接種至裝有100 mL含1%柴油的選擇性無機鹽液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r·min-1的避光條件下培養(yǎng)3 d。從上一培養(yǎng)瓶中取5 mL培養(yǎng)液接種至45 mL含1%柴油的選擇性無機鹽液體培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)富集培養(yǎng)2～3 d。按照上述步驟重復(fù)富集培養(yǎng)3次。取最后一次富集培養(yǎng)得到的200 μL培養(yǎng)液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，可觀察到不同形態(tài)的菌落。

對不同形態(tài)的菌落分別進行劃線純化，以實現(xiàn)單菌的分離。為了驗證分離的菌株是否為柴油降解菌，將單菌落劃線于涂有柴油的平板上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，篩選出能夠在該平板上生長的菌落。同時，將菌落加入到選擇性無機鹽液體培養(yǎng)基中，選擇有明顯乳化柴油現(xiàn)象的菌株進行了進一步的分子生物學(xué)鑒定，分析其系統(tǒng)發(fā)育水平。

使用由金斯瑞生物科技公司合成的16S rRNA通用引物（515F：GTGCCAGCMGCCGCGG；907R：CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）進行PCR擴增和凝膠電泳實驗，將目標(biāo)條帶的擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序。菌株用甘油封存于-80 ℃冰箱。從得到的測序結(jié)果中，選取其中一株柴油降解菌S3-2-LX的菌株序列，使用MEGA-X軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 柴油降解菌形態(tài)和菌落的表征方法

使用涂布器將S3-2-LX菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基表面，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)過夜，對S3-2-LX菌株的菌落進行觀察。將S3-2-LX菌液離心以去除上清液，使用4%甲醛對菌體細胞固定后再進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察S3-2-LX菌株的細胞形態(tài)。

1.5 多環(huán)芳烴降解實驗

取出50%甘油管藏的菌液，在室溫下進行凍融處理后，取20 μL菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)直至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落并轉(zhuǎn)移到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基內(nèi)菌群的光密度（OD600）約為0.2后，將全部菌液與LB液體培養(yǎng)基一同轉(zhuǎn)移到50 mL無菌離心管中，5 000 r·min-1離心5 min后倒掉上清液。向離心管中加入MSM，并用渦旋混勻。再次以5 000 r·min-1離心2 min并倒掉上清液，重復(fù)此步驟2次后，向離心管中加入50 mL已滅菌的MSM以重懸菌體，制成菌懸液。取5 mL的S3-2-LX菌懸液分別接種至含有45 mL 50 mg·L-1萘、菲和芘的MSM的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、100 r·min-1、初始pH為7的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，測定培養(yǎng)瓶中各PAHs的殘余量。

1.6 多環(huán)芳烴的測定方法

1.6.1 萃取培養(yǎng)液中殘余的多環(huán)芳烴

在通風(fēng)櫥內(nèi)，分別向已培養(yǎng)了7 d的含有不同PAH和菌懸液的培養(yǎng)瓶中加入5 mL正己烷，并將培養(yǎng)瓶放入超聲儀中進行超聲波萃取，持續(xù)30 min后，靜置15 min。將培養(yǎng)瓶中的全部液體倒入50 mL離心管中，再次靜置10 min，等待液體中的氣泡消失。當(dāng)培養(yǎng)液明顯分層后，使用1 mL注射器沿離心管管壁吸取上層的萃取液，通過0.22 μm的綠色有機濾膜過濾后，將其打入安捷倫細胞瓶內(nèi)，以備后續(xù)測定。

1.6.2 氣相色譜儀測定條件

使用GC-2014型氣相色譜儀進行GC-FID測定。進樣量為2 μL，N2進樣速度為50 mL·min-1，H2進樣速度為40 mL·min-1，色譜柱采用SK-5（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）。具體的色譜條件為：采用不分流進樣，進樣口溫度為280 ℃；初始柱溫為100 ℃；檢測器溫度為300 ℃。柱箱采用升溫程序：初始溫度為100 ℃，保持1 min；以15 ℃·min-1的升溫速率升溫至255 ℃，保持1 min；再以1 ℃·min-1的升溫速率升溫至265 ℃，保持1 min；最后以2.5 ℃·min-1的升溫速率升溫至295 ℃，保持5 min。

1.6.3 GC-FID定量分析多環(huán)芳烴含量

本實驗采用外標(biāo)法進行定量測定。使用含有萘、菲和芘的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（稀釋梯度為10.0、7.5、5.0、2.5和1.0 mg·L-1）進行GC-FID定量分析，基于不同濃度的峰面積繪制線性回歸方程，對土壤樣品中的PAHs進行定量。在相同的色譜條件下，依次對每個處理的樣品進行GC-FID測定，根據(jù)保留時間確定每個樣品中PAHs的峰面積。通過將待測樣品的峰面積代入線性回歸方程，計算樣品中PAHs的含量，并據(jù)此計算出每個樣品中多環(huán)芳烴的殘余濃度。

1.7 基因組測序和組裝

將菌株S3-2-LX接種于LB液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃下培養(yǎng)12 h。使用離心方法收集菌體，并將其用無菌緩沖液清洗2～3次，用于后續(xù)的基因組測序。

將S3-2-LX菌體樣品寄給美吉生物公司Illumina HiSeq 2000平臺進行基因組測序。在進行DNA提取后，美吉生物公司對提取到的DNA樣品進行質(zhì)量檢測。對質(zhì)檢合格的DNA樣品構(gòu)建插入片段約為400 bp的文庫，再進行PE150（pair-end）測序。對獲得序列進行基因組組裝，得到多條基因組scaffold。對基因組進行注釋，包括對編碼序列（CDS）、tRNA、rRNA和基因組島進行預(yù)測。對預(yù)測得到的編碼基因進行COG和KEGG注釋，以獲取相應(yīng)的功能注釋信息［18］。

2 結(jié) 果

2.1 S3-2-LX菌株的分離、鑒定和表征

16S rRNA基因測序分析表明，S3-2-LX菌株隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）（Genbank序列號MZ127404），該菌株的16S rRNA基因序列與菌株Bacillus cereus group sp.strain TLPF1的相似度最高，為91.73%（圖1）。

S3-2-LX菌株的菌落直徑約2 mm，為圓形、乳白色的不透明菌落，菌落表面光滑，邊緣完整（圖2a），該菌株的菌體細胞呈桿狀，長度約為2 μm（圖2b）。

2.2 S3-2-LX菌株對多環(huán)芳烴的降解

S3-2-LX菌株在相同條件下培養(yǎng)7 d后，對萘的降解率為99.06%，明顯高于對菲（42.10%）和芘（29.20%）的降解率。

2.3 S3-2-LX菌株的基因組評估

如圖3所示，不同基因拼接片段的GC含量集中在同一區(qū)域，表明該基因組未受到外源物種的污染，部分基因可能來自質(zhì)粒的DNA。該基因組平均深度為183.79 X ，GC含量為34.89%。

設(shè)置17-mer為參數(shù)，逐步向右移動，得到各深度的頻率，以此來評估基因組的質(zhì)量，并確定是否存在質(zhì)粒污染。結(jié)果如圖4所示：頻率曲線存在一個明顯的主峰，說明該菌株的測序結(jié)果可信；此外，出現(xiàn)的次峰表明一部分片段可能是重復(fù)片段，或者可能是具有多個拷貝的質(zhì)粒。

2.4 S3-2-LX菌株的基因組組裝結(jié)果

由表1可知，S3-2-LX基因組序列的總長度為5 869 851 bp。通過對S3-2-LX菌株的基因進行編碼基因預(yù)測，可知其有5 956個編碼基因，總長度為4 939 365 bp，占基因組的84.15%。在S3-2-LX菌株的全基因組中，共有24個轉(zhuǎn)座子，總長度為14 031 bp；包含48個tRNA，總長度為3 618 bp，以及3個rRNA，總長度為1 765 bp。與多種生物功能相關(guān)的基因組區(qū)段（基因組島，genomic island）共有6個，總長度為72 940 bp。這些基因組島中共91個基因，其中36個基因被注釋為功能未知的假設(shè)蛋白質(zhì)，5個基因被注釋為重組酶和噬菌體特異性位點整合酶（表2）。

2.5 S3-2-LX菌株的功能注釋

2.5.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋

COG對比結(jié)果顯示（圖5），共有4 211個基因完成了蛋白質(zhì)注釋，占全部基因的70.70%。其中，注釋數(shù)量較多的基因功能主要包括：參與氨基酸運輸和代謝（E：Amino acid transport metabolism）的基因共368個（8.74%）；參與轉(zhuǎn)錄（K：Transcription）的基因共346個（8.22%）；參與無機離子的轉(zhuǎn)運與代謝（P：Inorganic ion transport and metabolism）的基因共251個（5.96%）；參與碳水化合物運輸和代謝（G：Carbohydrate transport and metabolism）的基因共233個（5.53%）；參與細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生（M：Cell wall/Membrane/Envelope biogenesis）的基因共228個（5.41%）。其中，參與轉(zhuǎn)錄的基因中包括編碼典型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LysR型、GntR型、EamA-like型、IcIr型、MarR型和AraC型家族調(diào)節(jié)因子的基因；參與細胞運動（N：cell motility）的基因共36個（0.85%），包括編碼鞭毛蛋白FliS、FlgC、FliE等的基因和編碼趨化復(fù)合體蛋白CheC、CheR、CheY、CheZ的基因。

2.5.2 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋

KEGG對比結(jié)果顯示（圖6），S3-2-LX菌株在細胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、人類疾病（Human Giseases）、新陳代謝（Metabolism）和生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）這6大功能上共有3060個基因進行了注釋，涵蓋了42個通路。對于涉及的代謝通路總數(shù)以及每個通路參與的基因數(shù)量進行對比發(fā)現(xiàn)，在新陳代謝、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和細胞過程功能上，基因的功能注釋較多。富集分析顯示，在代謝通路中共有2126個基因得到了注釋，其中與碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）相關(guān)的基因注釋數(shù)量為253個，占代謝通路注釋的基因總數(shù)的11.9%。涉及異種生物降解和代謝（Xenobiotics biodegradation and metabolism）的基因共有45個，占代謝通路注釋的基因總數(shù)的2.12%。在環(huán)境信息處理方面共有310個基因進行了注釋，在遺傳信息處理理方面共有221個基因進行了注釋，細胞過程中共有99個基因進行了注釋，其中細胞群落-原核生物是注釋基因數(shù)量最多的。此外，注釋到異種生物降解和代謝的代謝通路有二惡英降解途徑（ko00621）、二甲苯降解途徑（ko00622）、硝基甲苯降解途徑（ko00633）等（表3）。

被注釋的基因組主要集中在芳香族化合物降解基因上，如兒茶酚2，3-雙加氧酶基因（catE）、尿黑酸1，2-雙加氧酶基因（hmgA）、s-（羥甲基）谷胱甘肽脫氫酶基因（frmA）和4-草酰乙酸互變異構(gòu)酶雙加氧酶外二醇基因（praC）等。此外，還存在參與降解烷烴的降解酶基因，如烷烴磺酸單加氧酶基因（ssuD）、細胞色素P450基因（cypD_E）（表4）。

3 討 論

3.1 S3-2-LX菌株的菌屬特征

本研究分離出的柴油降解菌S3-2-LX菌株對于修復(fù)柴油類污染場地具有現(xiàn)實意義，尤其在PAHs污染較重的土壤環(huán)境中。芽孢桿菌屬屬于好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細菌，化能異養(yǎng)型，能夠產(chǎn)生抵抗不利條件的特殊芽孢［19］。S3-2-LX菌株基因組中存在5個重組酶和噬菌體特異性位點整合酶的基因，該基因?qū)λ交蜣D(zhuǎn)移有重要作用［20］，這表明該菌株在在垃圾堆放點這一復(fù)雜多變的污染環(huán)境中具有很強的適應(yīng)能力。在深海環(huán)境中分離的多環(huán)芳烴降解菌Celeribacter indicus P73T的基因組中也發(fā)現(xiàn)了多個轉(zhuǎn)座酶基因和整合酶基因等可移動遺傳元件［21］。

3.2 S3-2-LX菌株對PAHs的降解能力

S3-2-LX菌株對萘、菲和芘有較好的降解作用，且降解率隨著PAHs環(huán)數(shù)的增加而降低。這一發(fā)現(xiàn)與以往從油田土壤、森林土壤和濕地土壤中分離的多種芽孢桿菌降解能力相似，這些菌屬可以有效降解不同環(huán)數(shù)的PAHs，例如萘［22］、苯并［a］芘［23］等。Rabodonirina等［24］研究表明，在油污染的土壤中分離出的混合菌Pseudomonas和Bacillus能夠有效降解芴（65%～86%）和菲（86%～95%），然而對高分子量的芘和氟蒽的降解效率則顯著低于芴和菲。該規(guī)律在其他PAHs降解菌中也有所體現(xiàn)。例如在同一培養(yǎng)條件下，PAHs降解菌Bacillus spp.對萘的降解率高達89.30%，而對于其他3種較高分子量的PAHs（菲、氟蒽和芘）的降解率在45%～60%［25］。有研究表明，隨著PAHs環(huán)數(shù)的增加，其疏水性和電化學(xué)穩(wěn)定性也相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致它們在環(huán)境中的生物可利用性降低，在環(huán)境中的留存時間也隨之增加。同時，降解高環(huán)PAHs的微生物大多在環(huán)境中的相對豐度較低，且生長速率較慢，這可能也是導(dǎo)致菲和芘的降解效率顯著低于萘的原因［26］。

3.3 柴油降解菌株S3-2-LX的代謝功能基因

基因組的注釋信息很好地印證了S3-2-LX菌株的PAHs降解能力。S3-2-LX菌株基因組中含有二惡英、二甲苯和萘等降解通路相關(guān)的基因信息，這表明S3-2-LX具備降解芳香族化合物的潛力。該研究結(jié)果與對Falsochrobactrum TDYN1［18］和Bacillus marsiflavi［27］菌株的研究結(jié)果相似，均從基因組水平和降解實驗水平揭示了這些菌屬的PAHs降解能力。PAHs的代謝途徑主要包括羥基化、脫氫、苯環(huán)裂解和異構(gòu)等步驟，將芳香族化合物分解為小分子脂肪酸，最終轉(zhuǎn)化為H2O和CO2［20］。如，在S3-2-LX菌株中發(fā)現(xiàn)的2-氧葡萄糖酸鹽/2-氧酸鐵氧化還蛋白氧化還原酶亞基（korA /korB）、鐵氧還蛋白亞硝酸鹽還原酶基因（nirA）參與苯環(huán)上的雙加氧反應(yīng)，是PAHs降解的關(guān)鍵和限速步驟［28-29］。而加氧過后，在adhP、adhE、frmA等酶基因的催化下進行脫氫過程［30］。hmgA、catE、4-羥苯（基）丙酮酸雙（加）氧酶基因（hppD）和4-羥基苯甲酸鹽-3-單加氧酶基因（hpaB）等酶基因則催化苯環(huán)的裂解［29］。而praC、acd（脂酰輔酶A脫氫酶）、fadD（長鏈?；o酶A合酶）等酶基因可以催化開環(huán)后脂肪酸的降解過程［31］。此外，S3-2-LX菌株基因組的KEGG基因注釋中還發(fā)現(xiàn)了ssuD、cypD_E等酶基因。ssuD或cypD_E能將烷烴末端的甲基催化氧化成羥基，轉(zhuǎn)化為醇類，是烷烴降解的關(guān)鍵步驟和限速步驟［32］。adhP和adhE進一步將醇類氧化為相應(yīng)的醛和脂肪酸［33］。此外，acd和fadD等酶基因可將脂肪酸β-氧化生成乙酰輔酶A，并通過進一步的三羧酸循環(huán)進行代謝，最終生成H2O和CO2［34］。這些基因的檢出表明，S3-2-LX菌株也具備降解烷烴的潛力。

3.4 其他功能基因?qū)3-2-LX菌株的柴油降解能力的影響

通過基因組COG分析發(fā)現(xiàn)，S3-2-LX菌株包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LysR型、GntR型、EamA-like型、IcIr型、MarR型和AraC型家族調(diào)節(jié)因子。研究表明，LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是原核生物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，在調(diào)節(jié)芳香族化合物分解代謝、細胞運動和群體感應(yīng)中的基因表達中起著關(guān)鍵作用［35］。而GntR型、EamA-like型、IcIr型、MarR型和AraC型家族調(diào)節(jié)因子也能夠調(diào)節(jié)芳香族化合物的代謝過程［35-36］。這些基因的檢出表明該菌株能快速地響應(yīng)PAHs的脅迫，并對其進行降解代謝。此外，還發(fā)現(xiàn)了趨化性和細胞運動基因，包括編碼鞭毛蛋白（如FliS、FlgC、FliE等）和趨化復(fù)合體蛋白（CheC、CheR、CheY、CheZ）的基因。有研究證明，趨化性和細胞運動基因能夠有效提高柴油降解微生物對碳氫化合物的生物可利用效率［37-38］，有助于提高微生物對柴油的降解效率。

4 結(jié) 論

本研究從土壤中分離得到柴油降解菌Bacillus S3-2-LX，發(fā)現(xiàn)其具有較強的PAHs降解能力?；蚪M測序和分析發(fā)現(xiàn)其具有柴油降解代謝基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、趨化性和細胞運動基因、可移動遺傳元件基因等，這些基因為該菌株的柴油降解能力提供了遺傳基礎(chǔ)。該菌株的分離和代謝途徑的分析為柴油污染的生物修復(fù)提供了優(yōu)質(zhì)菌株來源和理論支撐。

參考文獻：

［1］ AHMED F，F(xiàn)AKHRUDDIN A.A review on environmental contamination of petroleum hydrocarbons and its biodegradation［J］.International Journal of Environmental Sciences & Natural Resources，2018，11（3）：63-69.

［2］ GUO W，WANG X，LIU S，et al.Long-term petroleum hydrocarbons pollution after a coastal oil spill［J］.Journal of Marine Science and Engineering，2022，10（10）：1380.

［3］ CZARNY J，STANINSKA P J，PIOTROWSKA C A，et al.Acinetobacter sp.as the key player in diesel oil degrading community exposed to PAHs and heavy metals［J］.Journal of Hazardous Materials，2020，383：121168.

［4］ ZHANG C，WU D，REN H.Bioremediation of oil contaminated soil using agricultural wastes via microbial consortium［J］.Scientific Reports，2020，10（1）：9188.

［5］ 張勝，陳立，李政紅，等.中原石油污染土壤原位微生物生態(tài)修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報，2011，38（4）：615-620.

［6］ ACOSTA-GONZLEZ A，MARQUS S.Bacterial diversity in oil-polluted marine coastal sediments［J］.Current Opinion in Biotechnology，2016，38：24-32.

［7］ LEITE G G F，F(xiàn)IGUEIRA J V，ALMEIDA T C M，et al.Production of rhamnolipids and diesel oil degradation by bacteria isolated from soil contaminated by petroleum［J］.Biotechnology Progress，2016，32（2）：262-270.

［8］ GAO J，MING J，XU M，et al.Isolation and characterization of a high-efficiency marine diesel oil-degrading bacterium［J］.Petroleum Science，2021，18（2）：641-653.

［9］ KHAN A L，NUMAN M，BILAL S，et al.Mangrove’s rhizospheric engineering with bacterial inoculation improve degradation of diesel contamination［J］.Journal of Hazardous Materials，2022，423：127046.

［10］OYEWOLE O A，RAJI R O，OKEKE S K，et al.Potential of fungi isolated from diesel contaminated soil to degrade diesel［J］.Tanzania Journal of Science，2021，47（1）：47-56.

［11］GARRIDO-SANZ D，REDONDO-NIETO M，GUIRADO M，et al.Metagenomic insights into the bacterial functions of a diesel-degrading consortium for the Rhizoremediation of diesel-polluted soil［J］.Genes，2019，10（6）：456.

［12］GRAN-SCHEUCH A，F(xiàn)UENTES E，BRAVO D M，et al.Isolation and characterization of phenanthrene degrading bacteria from diesel fuel-contaminated antarctic soils［J］.Frontiers in Microbiology，2017，8：1634.

［13］SAKSHI，HARITASH A K.A comprehensive review of metabolic and genomic aspects of PAH-degradation［J］.Archives of Microbiology，2020，202（8）：2033-2058.

［14］ROJO F.Degradation of alkanes by bacteria［J］.Environmental Microbiology，2009，11（10）：2477-2490.

［15］吳慧君，宋權(quán)威，鄭瑾，等.微生物降解石油烴的功能基因研究進展［J］.微生物學(xué)通報，2020，47（10）：3355-3368.

［16］HAMME J D V，SINGH A，WARD O P.Recent advances in petroleum microbiology［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67（4）：503-549.

［17］ZHANG X，XU D，ZHU C，et al.Isolation and identification of biosurfactant producing and crude oil degrading Pseudomonas aeruginosa strains［J］.Chemical Engineering Journal，2012，209：138-146.

［18］陳冠益，陳紅云，栗高源，等.一株石油降解菌 TDYN1 基因組測序及分析［J］.生物學(xué)雜志，2023，40（1）：34-39.

［19］徐靖，牛邦彥，張亞南，等.芽孢桿菌屬Bacillus分類學(xué)研究進展［J］.中國土壤與肥料，2022（12）：225-237.

［20］CHOI E J，JIN H M，LEE S H，et al.Comparative genomic analysis and benzene，toluene，ethylbenzene，and o-，m-，and p-xylene （BTEX） degradation pathways of Pseudoxanthomonas spadix BD-a59［J］.Applied and Environmental Microbiology，2013，79（2）：663-671.

［21］曹軍偉.深海多環(huán)芳烴降解菌Celeribacter indicus P73T降解熒蒽和菲的機制研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2016.

［22］PARELLADA E A，IGARZA M，ISACC P，et al.Squamocin，an annonaceous acetogenin，enhances naphthalene degradation mediated by Bacillus atrophaeus CN4［J］.Revista Argentina de Microbiologia，2017，49（3）：282-288.

［23］LU Q，CHEN K，LONG Y，et al.Benzo（a）pyrene degradation by cytochrome P450 hydroxylase and the functional metabolism network of Bacillus thuringiensis［J］.Journal of Hazardous Materials，2019，366：329-337.

［24］RABODONIRINA S，RASOLOMAMPIANINA R，KRIER F，et al.Degradation of fluorene and phenanthrene in PAHs-contaminated soil using Pseudomonas and Bacillus strains isolated from oil spill sites［J］.Journal of Environmental Management，2019，232：1-7.

［25］MANDREE P，MASIKA W，NAICKER J，et al.Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons from industry contaminated soil using indigenous Bacillus spp.［J］.Processes，2021，9（9）：1606.

［26］GIUNTA M，BOSCO D L，LEONARDI G，et al.Estimation of gas and dust emissions in construction sites of a motorway project［J］.Sustainability，2019，11（24）：7218.

［27］SAEED M，ILYAS N，BIBI F，et al.Biodegradation of PAHs by Bacillus marsiflavi，genome analysis and its plant growth promoting potential［J］.Environmental Pollution，2022，292：118343.

［28］KIM S，KWEON O，JONES R C，et al.Genomic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1［J］.Biodegradation，2008，19（6）：859-881.

［29］LI X，QU C，BIAN Y，et al.New insights into the responses of soil microorganisms to polycyclic aromatic hydrocarbon stress by combining enzyme activity and sequencing analysis with metabolomics［J］.Environmental Pollution，2019，255：113312.

［30］SIERRA-GARCA I N，ALVAREZ J C，DE VASCONCELLOS S P，et al.New hydrocarbon degradation pathways in the microbial metagenome from Brazilian petroleum reservoirs［J］.PLos ONE，2014，9（2）：e90087.

［31］ISMAIL W，GESCHER J.Epoxy coenzyme a thioester pathways for degradation of aromatic compounds［J］.Applied and Environmental Microbiology，2012，78（15）：5043-5051.

［32］MISHRA S，SINGH S N.Microbial degradation of n-hexadecane in mineral salt medium as mediated by degradative enzymes［J］.Bioresource Technology，2012，111：148-154.

［33］PAL S，KUNDU A，BANERJEE T D，et al.Genome analysis of crude oil degrading Franconibacter pulveris strain DJ34 revealed its genetic basis for hydrocarbon degradation and survival in oil contaminated environment［J］.Genomics，2017，109（5-6）：374-382.

［34］HONG Y H，DENG M C，XU X M，et al.Characterization of the transcriptome of Achromobacter sp.HZ01 with the outstanding hydrocarbon-degrading ability［J］.Gene，2016，584（2）：185-194.

［35］DAS D，BARUAH R，ROY A S，et al.Complete genome sequence analysis of Pseudomonas aeruginosa N002 reveals its genetic adaptation for crude oil degradation［J］.Genomics，2015，105（3）：182-190.

［36］CAO J，LAI Q，YUAN J，et al.Genomic and metabolic analysis of fluoranthene degradation pathway in Celeribacter indicus P73T［J］.Scientific Reports，2015，5：7741.

［37］范萌，黃升泉，李昱龍，等.芽孢桿菌鞭毛及其運動相關(guān)特性的研究進展［J］.微生物學(xué)通報，2022，49（5）：1832-1845.

［38］IBRAR M，KHAN S，HASAN F，et al.Biosurfactants and chemotaxis interplay in microbial consortium-based hydrocarbons degradation［J］.Environmental Science and Pollution Research，2022，29（17）：24391-24410.

Analysis on the Screening，Identification and Genome Sequencingof Diesel-degrading Strain Bacillus S3-2-LX

YE Chun-honga，YANG Rui-yub，PENG Chaoa，LU Lub

（a.College of Life Science，b.College of Environmental Science and Engineering，China West Normal University，Nanchong Sichuan 637009，China）

Abstract：Diesel pollution has posed serious threats to environmental biodiversity and human health.Bioremediation is an important approach to deal with diesel pollution.Taking diesel as the only carbon source，this study has isolated a strain from the soil of a garbage dump site in a university of Sichuan Province.The strain named S3-2-LX belongs to the Bacillus genus.Its thallus is rod-shaped，and its bacterial colony is oyster white and round.To verify the degradation capability of the strain towards polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs），a PAH degradation cultivation experiment is conducted and de novo sequencing is performed on the Illumina HiSeq 2000 platform.The results are as follows：strain S3-2-LX has exhibited high degradation rates of naphthalene （99.1%），phenanthrene （42.1%），and pyrene （29.2%） after 7 days of cultivation；the total sequencing length of S3-2-LX genome is 5 869 851 bp and a total of 53 Scaffolds are obtained，with a GC content of 34.89%；gene annotation by the COG and KEGG databases has identified 4 211 and 3 060 genes，respectively；S3-2-LX possesses pathways related to hydrocarbon metabolism and the ability to degrade alkane，dioxins，xylene，benzoic acid，and polycyclic aromatic hydrocarbons.The analysis on the physiological characteristics and metabolic pathways of S3-2-LX in this study has further revealed the key steps and mechanisms of its diesel degradation.

Keywords：diesel-degrading bacteria；isolation and identification；Bacillus；genome sequencing；gene annotation