摘 要：為探究不同pH值對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響及分子機(jī)制，采用分子模擬和熒光光譜分析等技術(shù)，對(duì)不同pH值條件下（4、5、6、7、8）木瓜蛋白酶的酶活性、均方根誤差（root mean square deviation，RMSD）、蛋白質(zhì)殘基的波動(dòng)、回旋半徑、蛋白間氫鍵、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和溶劑可及表面積等進(jìn)行分析。結(jié)果表明：pH 7時(shí)木瓜蛋白酶活性最高，pH 4和pH 8時(shí)比pH 7時(shí)活性分別降低約5.00%和5.35%；分子模擬結(jié)果顯示，不同pH值下木瓜蛋白酶的回旋半徑波動(dòng)不大，pH 8時(shí)RMSD有較大波動(dòng)；pH 4和pH 8時(shí)蛋白酶活性中心的3 個(gè)氨基酸殘基有較大波動(dòng)；隨著pH值的增加，木瓜蛋白酶間氫鍵數(shù)量逐漸增加，但pH 8的氫鍵數(shù)量較pH 7下降3.4 個(gè)；pH 7條件下木瓜蛋白酶活性中心與底物結(jié)合緊密，酶蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)更致密，而pH 4條件下酶活性中心與底物結(jié)合部位縫隙較大，酶蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)疏松；pH 4和8時(shí)活性下降與該條件下木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，如氫鍵的破壞、活性中心殘基的波動(dòng)、疏水表面積的改變、β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等。本研究從分子模擬角度明確了pH值對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響。

關(guān)鍵詞：木瓜蛋白酶；酶活性；pH值；分子模擬

Effect of Different pH on Papain Activity and Its Molecular Mechanism

DAI Wen， HUANG Yechuan*， HAN Jiayu， HU Xiao， LI Diandian， GUAN Sitong

（College of Food and Biology， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， China）

Abstract： In order to investigate the impact of different pH levels on papain activity and its molecular mechanism， molecular simulation and fluorescence spectroscopy were employed to analyze the enzyme activity， root mean square error （RMSE）， root mean square fluctuation （RMSF）， radius of gyration （Rg）， inter-protein hydrogen bonding， protein secondary structure， and solvent accessible surface area at various pH values （4， 5， 6， 7， and 8）. The results revealed that papain activity was highest at pH 7 and decreased by approximately 5.00% at pH 4 and 5.35% at pH 8 compared to pH 7， respectively. Molecular simulation results indicated that the Rg of papain exhibited minimal fluctuations across different pH levels; RMSD fluctuated greatly at pH 8， and three amino acid residues in the active center displayed significant fluctuations at both pH 4 and pH 8. As the pH value increased gradually， the number of hydrogen bonds in papain also increased except for a decrease by 3.4 atpH 8 compared to pH 7. Under a neutral condition （pH 7）， the active center of papain tightly bound to its substrate with a denser internal protein structure; whereas under acidic conditions （pH 4）， there was a larger gap between protease’s active center and its substrate binding site along with a looser internal protein structure. The decline in the activity observed at low pH （pH 4） and high pH （pH 8） could be attributed to structural changes protease such as disruption of hydrogen bonds， fluctuations in active center residues， alterations in hydrophobic surface area， and modifications in secondary structures such as β-sheet. This study clarified the effect of pH on papain activity from a molecular simulation perspective.

Keywords： papain; enzyme activity; pH value; molecular simulation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240618-151

中圖分類號(hào)：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）10-0009-06

引文格式：

代雯， 黃業(yè)傳， 韓佳鈺， 等. 不同pH值對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響及分子機(jī)制[J]. 肉類研究， 2024， 38（10）： 9-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240618-151. http：//www.rlyj.net.cn

DAI Wen， HUANG Yechuan， HAN Jiayu， et al. Effect of different ph on papain activity and its molecular mechanism[J]. Meat Research， 2024， 38（10）： 9-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240618-151. http：//www.rlyj.net.cn

木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，也被稱為巰基蛋白酶，最早于19世紀(jì)從未成熟的番木瓜乳膠中分離獲得，是第1種確定晶體結(jié)構(gòu)的蛋白酶[1]。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)肉類口感的追求也不斷提升，目前市場(chǎng)上流通的嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶，其能將結(jié)締組織、肌纖維中的膠原蛋白及彈性蛋白分解，使氨基酸間的連接鍵斷裂，破壞肉類結(jié)構(gòu)，使肉質(zhì)口感細(xì)膩、嫩滑[2]。在肉類嫩化和加工過程中，加工手段或加工環(huán)境中的一些物理或化學(xué)因素會(huì)影響木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白酶充分發(fā)揮其酶活性，從而影響嫩化效果。如張瓊[3]研究超聲波功率及時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，結(jié)果表明，隨超聲波功率增加，木瓜蛋白酶的活力呈先上升后下降趨勢(shì)。張艷梅等[4]發(fā)現(xiàn)，金屬Hg2＋濃度的增加會(huì)破壞木瓜蛋白酶的活性中心，導(dǎo)致酶的催化活性降低。

pH值在食品體系中是一個(gè)重要影響因素，也是影響酶活性的主要因素之一。不同pH值條件下酶分子的很多極性基團(tuán)解離狀態(tài)不同，各極性基團(tuán)所帶電荷的數(shù)量和種類也不相同，因此pH值的變化對(duì)酶與底物的親和力具有影響。除此之外，酶活性中心的空間構(gòu)象也會(huì)受到pH值的影響，從而影響酶的活性。目前有許多學(xué)者就pH值對(duì)酶的活性影響進(jìn)行了深入研究。陳維[5]發(fā)現(xiàn)，不同的pH值環(huán)境對(duì)不同生物材料中的過氧化氫酶活性有一定影響，pH值在6.2～8.0范圍內(nèi)時(shí)，酶的活性會(huì)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。彭青等[6]觀察pH 5.8～9.0條件下L1型金屬β-內(nèi)酰胺酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)其最適pH值為8.2，當(dāng)pH 5.8時(shí)，相對(duì)酶活性僅為14.64%。狄荻等[7]發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶的最適pH值為7左右，偏酸或偏堿都會(huì)影響其活性，當(dāng)pH 11時(shí)，其活性幾乎完全喪失。雖然目前的實(shí)驗(yàn)方法能夠評(píng)估各種因素對(duì)蛋白酶活性的影響，但無(wú)法在微觀水平上闡明蛋白酶活性變化的根本原因，而分子動(dòng)力學(xué)模擬能進(jìn)一步分析蛋白酶結(jié)構(gòu)的具體變化。如Li Yinli等[8]利用分子手段探究堿性磷酸酶的結(jié)構(gòu)變化；帥雨桐等[9]模擬不同加熱溫度對(duì)肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)及其對(duì)酚類物質(zhì)吸附的影響；高進(jìn)[2]模擬高壓下木瓜蛋白酶的分子動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律；黃業(yè)傳等[10]從分子模擬角度論證高壓條件下木瓜蛋白酶活性變化的機(jī)理，分子模擬能將蛋白酶內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化直觀地顯示出來。雖然部分研究者也探究了不同pH值對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，但并未具體研究其分子機(jī)制；鑒于木瓜蛋白酶在食品中應(yīng)用廣泛，經(jīng)常處于不同的pH值體系中，為更好地促進(jìn)木瓜蛋白酶在食品中的應(yīng)用，本研究考察5 組不同pH值（4、5、6、7、8）對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，并通過分子動(dòng)力學(xué)方法探究其分子機(jī)制，同時(shí)采用ROSETTA 3.7軟件模擬探究不同條件下酶與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的差異及可能的酶解機(jī)制差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（＞200 U/mg）、十二水合磷酸氫二鈉、三氯乙酸、L-酪氨酸、干酪素 上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；鹽酸 湖南匯虹試劑有限公司；氫氧化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TP-1901紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F98熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

配制不同pH值（4、5、6、7、8）的酶緩沖液：稱取0.528 g L-半胱氨酸鹽酸鹽和0.223 6 g乙二胺四乙酸二鈉，用磷酸氫二鈉溶液（0.05 mol/L）分別溶解，合并混勻后，用氫氧化鈉和鹽酸溶液（均為1 mol/L）調(diào)節(jié)pH值并定容至100 mL。取適量木瓜蛋白酶溶于不同pH值的酶緩沖液（5 mL）中，常溫下靜置20 min后定容至100 mL，再吸取1 mL至25 mL容量瓶中，加酶緩沖液定容，得到5 組終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的不同pH值木瓜蛋白酶溶液。配制完成后測(cè)定木瓜蛋白酶活性。

1.3.2 木瓜蛋白酶活性測(cè)定

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度測(cè)定：配制50 μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用純水做空白，于280 nm處測(cè)定吸光度（A1）。

木瓜蛋白酶活性測(cè)定：取6 支具塞試管并編號(hào)（a、b、c、d、e、空白管），分別取1 mL不同pH值木瓜蛋白酶溶液于對(duì)應(yīng)的具塞試管中，再另取1 mL pH 6的木瓜蛋白酶溶液于空白具塞試管中。將6 支具塞試管放置在40 ℃水浴鍋中水浴10 min后，在a、b、c、d、e管中迅速加入5 mL 6 mg/mL酪蛋白溶液，搖勻后進(jìn)行水浴10 min，再向每個(gè)管中加入5 mL 65.4 g/L三氯乙酸溶液，搖勻并過濾后，在280 nm處測(cè)定濾液吸光度（A2）?？瞻坠苤袆t先加入三氯乙酸溶液5 mL，振蕩混勻后水浴10 min，再加入酪蛋白溶液5 mL，搖勻后繼續(xù)水浴加熱10 min，過濾后在280 nm處測(cè)定溶液吸光度（A3）。木瓜蛋白酶活性按下式計(jì)算：

式中：n為酶液的稀釋倍數(shù)；m為所用木瓜蛋白酶的質(zhì)量/g。

1.3.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

在RCSB網(wǎng)站上下載木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)（ID號(hào)：1ppn），然后使用PyMOL軟件手動(dòng)去除結(jié)晶水。采用Gromacs（2019.6）軟件[11]進(jìn)行模擬，選擇GROMOS54a7力場(chǎng)[12]和SPC水模型。提前根據(jù)蛋白酶氨基酸側(cè)鏈的pKa和模擬的不同pH值條件關(guān)系設(shè)定好質(zhì)子化狀態(tài)，將其放置于立方體水盒子中，并設(shè)置蛋白酶與盒子邊緣最短距離為1 nm。通過增補(bǔ)適量的Na＋或Cl－使體系達(dá)到電中性。使用最速下降法對(duì)體系能量進(jìn)行最小化處理，先在NVT和NPT系統(tǒng)下分別進(jìn)行400 ps的平衡，然后進(jìn)行150 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，模擬步長(zhǎng)為2 fs，每10 ps儲(chǔ)存1 次數(shù)據(jù)，每個(gè)處理平行模擬3 次[13]。

模擬完畢后，先移除周期性邊界，再使用蛋白分子模擬命令分析不同pH值條件下木瓜蛋白酶的均方根誤差（root mean square deviation，RMSD）、均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）、回旋半徑（radius of gyration，Rg）、氫鍵數(shù)量、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白溶劑可及表面積。其中分析RMSD時(shí)使用全部150 ns的數(shù)據(jù)，而分析其他指標(biāo)時(shí)只使用結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定后的數(shù)據(jù)。分析時(shí)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔100 ps。

分子模擬結(jié)束后，用ROSETTA軟件模擬不同條件下酶與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的差異，取2 組酶活有較大差異的樣本，提取勢(shì)能最低的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接底物采用β-酪蛋白。再采用I-TASSER在線服務(wù)器構(gòu)建β-酪蛋白結(jié)構(gòu)，使用ROSETTA 3.7軟件進(jìn)行分子對(duì)接。共進(jìn)行10 次獨(dú)立對(duì)接，每次對(duì)接產(chǎn)生一個(gè)對(duì)接打分。

1.3.4 木瓜蛋白酶內(nèi)源性熒光光譜測(cè)定

將不同pH值（4、5、6、7、8）的木瓜蛋白酶溶液分別放入1.0 cm寬度的石英池中進(jìn)行熒光光譜分析。熒光光譜條件為激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描波長(zhǎng)范圍250～320 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和整理；使用PyMOL軟件繪制木瓜蛋白酶與底物對(duì)接結(jié)構(gòu)圖，使用Origin 2018軟件繪制其余圖，所有測(cè)定均進(jìn)行

3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

木瓜蛋白酶的等電點(diǎn)為8.75。如圖1所示，隨著pH值的增加，木瓜蛋白酶的活性先增大后減小。在pH 7時(shí)活性最高，pH 6時(shí)次之。pH為4和8時(shí)活性與pH 7時(shí)相比有顯著差異（P＜0.05），活性分別下降5.00%、5.35%。朱新儒[15]在雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究中，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)pH值保持在7.0～8.0之間時(shí)，木瓜蛋白酶有較高活性。

王偉濤[16]認(rèn)為酸性和堿性環(huán)境對(duì)酶活性有一定的影響，但影響都在一定范圍內(nèi)；余壘[17]發(fā)現(xiàn)隨著pH值的升高，木瓜蛋白酶活性保留率、蛋白回收率逐漸提高，純化因子逐漸增加，但當(dāng)pH值超過6時(shí)，蛋白酶的電荷會(huì)隨溶液

pH值的改變而變化，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的電荷狀態(tài)會(huì)受到pH值及其等電點(diǎn)的影響[18]。因此，偏中性環(huán)境更有利于木瓜蛋白酶發(fā)揮其催化活性。

2.2 不同pH值下木瓜蛋白酶分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

2.2.1 RMSD在模擬中的變化

RMSD體現(xiàn)了蛋白質(zhì)原始構(gòu)象與在特定時(shí)間其結(jié)構(gòu)的平均偏差[19]。如圖2所示，5 組RMSD數(shù)據(jù)在模擬過程中波動(dòng)幅度不大，均在130 ns后穩(wěn)定在某一恒定數(shù)值附近。130 ns后pH 4～8條件下的RMSD平均值分別為0.29、0.27、0.31、0.26、0.33 nm，其中pH 8時(shí)RMSD平均值比pH 7時(shí)增加0.07 nm，波動(dòng)較明顯。說明pH值的改變會(huì)對(duì)木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，但影響不大，該結(jié)論與孔慶新等[20]研究結(jié)果相似。他們?cè)趯ⅵ?乳球蛋白與茶多酚表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）結(jié)合的分子模擬中發(fā)現(xiàn)，結(jié)合過程中EGCG只在有限的pH值范圍內(nèi)波動(dòng)，不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成較大影響。

2.2.2 RMSF在模擬中的變化

RMSF反映的是蛋白質(zhì)各原子坐標(biāo)與平均位置坐標(biāo)的漲落情況，能夠衡量原子運(yùn)動(dòng)幅度大小[21]。經(jīng)計(jì)算，pH 4～8條件下平均RMSF分別為0.149、0.139、0.142、0.136、0.157 nm?？傮w上隨pH值增大，RMSF會(huì)略微減小，但在pH 8時(shí)波動(dòng)明顯，這與酶活性和RMSD分析結(jié)果具有一定相關(guān)性。如圖3所示，pH 4～8條件下25位殘基RMSF分別為0.135、0.119、0.127、0.106、0.151 nm；158號(hào)位殘基分別為0.125、0.155、0.134、0.138、0.161 nm；159號(hào)位殘基分別為0.176、0.127、0.146、0.107、0.142 nm。在pH 4時(shí)，木瓜蛋白酶活性中心的25位和159位氨基酸殘基表現(xiàn)出較大的波動(dòng)，pH 8時(shí)，酶活性中心的25、158、159位氨基酸殘基均有較大波動(dòng)。表明環(huán)境偏酸和偏堿可能會(huì)導(dǎo)致酶的活性中心結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，這與酶活性結(jié)果一致。

2.2.3 Rg在模擬中的變化

Rg表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的松緊程度，Rg越小，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越致密，Rg越大，則表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越疏松。由圖4可知，所有組均在80 ns后趨于穩(wěn)定。計(jì)算模擬后80 ns的平均Rg，pH 4～8條件下木瓜蛋白酶的平均Rg分別為1.669、1.673、1.676、1.664、1.675 nm。可以看出各組Rg基本一致，無(wú)較大波動(dòng)。pH 7時(shí)Rg最小，說明此時(shí)木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)較致密，這也與上述RMSD、RMSF分析基本一致。

2.2.4 木瓜蛋白酶蛋白間氫鍵數(shù)量在模擬中的變化

氫鍵是一種對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用的非共價(jià)結(jié)合力。圖5顯示，隨著pH值的增加，木瓜蛋白酶蛋白間氫鍵數(shù)量逐漸增加。以模擬后50 ns進(jìn)行計(jì)算，在pH 4～8范圍內(nèi)，木瓜蛋白酶平均氫鍵數(shù)量分別為144.6、148.3、151.3、155.6、152.2 個(gè)。其中pH 8時(shí)的氫鍵數(shù)量比pH 7時(shí)減少3.4 個(gè)，可能導(dǎo)致部分蛋白結(jié)構(gòu)受損，這可能是木瓜蛋白酶活性隨著pH值的上升而逐漸升高、當(dāng)pH值上升至7后酶活性又降低的主要原因之一。

2.2.5 木瓜蛋白酶蛋白溶劑可及表面積在模擬中的變化

由表1可知，隨著pH值的上升，木瓜蛋白酶溶劑總可及表面積和疏水表面積均呈先減小后增大的趨勢(shì)，其原因可能是過酸或過堿的環(huán)境導(dǎo)致木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)疏松，水分子更容易滲透進(jìn)入木瓜蛋白酶分子內(nèi)部，從而使更多的疏水區(qū)域暴露，這與曾琪等[22]的研究結(jié)果相似。在本研究過程中，親水表面積總是大于疏水表面積，說明木瓜蛋白酶在不同pH值下均為水溶性，這與孔慶新等[20]得到的結(jié)論一致。

2.2.6 木瓜蛋白酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在模擬中的變化

如表2所示，隨著pH值的升高，木瓜蛋白酶蛋白的β-折疊數(shù)量先增多后減少，在pH 7時(shí)β-折疊數(shù)量明顯高于其他4 個(gè)pH條件，可推測(cè)β-折疊數(shù)量與酶活性有一定的關(guān)聯(lián)性，β-折疊數(shù)量越高，酶活性相對(duì)越高。而無(wú)規(guī)卷曲的數(shù)量明顯先減小后增加，在pH 6時(shí)降至最低，pH 7時(shí)次之，說明隨著pH值的增加，木瓜蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)從無(wú)序狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛行驙顟B(tài)，當(dāng)pH值超過7時(shí)，蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)又會(huì)由有序轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài)。因此可推測(cè)偏酸或偏堿的pH值會(huì)導(dǎo)致蛋白酶空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則狀態(tài)，進(jìn)而影響其活性。同時(shí)隨pH值的增加，α-螺旋呈增加趨勢(shì)，這與前面對(duì)蛋白間氫鍵分析基本一致，因?yàn)棣?螺旋的穩(wěn)定與氫鍵有關(guān)[23]。一些學(xué)者研究了不同pH值對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，但結(jié)果并不一致。郭洪偉[24]在研究pH值對(duì)芽孢皮層裂解酶的活力及結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，體系pH值大于7時(shí)，蛋白質(zhì)大分子因堿性而聚集的現(xiàn)象導(dǎo)致β-折疊結(jié)構(gòu)減少，這與本研究結(jié)果相似；而韓玲[25]在pH值對(duì)溶菌酶分子機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著體系pH值的降低，溶菌酶結(jié)構(gòu)中α-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)變大，Zhu Junxiang等[26]發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同pH值條件下無(wú)顯著變化，Abdollahi等[27]研究β-乳球蛋白與阿魏酸的結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著pH值升高，α-螺旋和β-折疊的比例均降低。

2.2.7 木瓜蛋白酶蛋白活性中心殘基間距離的變化

有研究[28]表明，木瓜蛋白酶活性部位由25位的半胱氨酸（Cys25）、158位的天冬酰胺（Asp158）和159位的組氨酸（His159）3 個(gè)氨基酸組成。據(jù)2.1節(jié)所述，pH 4和7時(shí)的木瓜蛋白酶活性差距較大，取這2 組樣品結(jié)構(gòu)勢(shì)能最低時(shí)的活性中心殘基距離進(jìn)行對(duì)比，pH 4條件下，114 ns結(jié)構(gòu)勢(shì)能最低，pH 7條件下，110 ns結(jié)構(gòu)勢(shì)能最低。由表3可知，pH 7條件下，Cys25到Asp158和His159的距離均減小，而Asp158到His159的距離略微增大。由此可推斷不同的pH值可能會(huì)影響木瓜蛋白酶活性，這種影響可能與活性中心殘基之間的距離變化有關(guān)，pH值接近中性時(shí)，氨基酸之間距離減小會(huì)使蛋白酶內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊密，從而能夠更好地發(fā)揮其酶活性。

2.2.8 木瓜蛋白酶分子與底物結(jié)合分析

10 次獨(dú)立分子對(duì)接的打分中，pH 7條件下的10 次對(duì)接打分平均值為－222.140，pH 4條件下的10 次對(duì)接打分平均值為－124.155，對(duì)接打分越低，表明結(jié)合越牢固。結(jié)果表明，pH 7條件下的最低能量結(jié)構(gòu)與β-酪蛋白對(duì)接，其對(duì)接打分明顯低于pH 4條件下，說明pH 7條件下木瓜蛋白酶與β-酪蛋白結(jié)合更為緊密，提示催化活性更高，這與酶活性的測(cè)定結(jié)果一致。

由圖6可知，pH 4條件下底物與木瓜蛋白酶結(jié)合部位有較大空腔，二者結(jié)合并不緊密，而pH 7條件下蛋白結(jié)合部位基本無(wú)縫隙，結(jié)合緊密且均勻，這與對(duì)接打分結(jié)果一致，說明pH 7條件下木瓜蛋白酶催化活性更高，催化效果更好。

a. pH 4；b. pH 7。紅色部分為木瓜蛋白酶活性中心的3 個(gè)氨基酸（Cys25、Asp158、His159）。

2.3 不同pH值條件下木瓜蛋白酶的熒光光譜分析

熒光光譜是研究水溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種有效方法[29]，具有選擇性好、靈敏性高的特點(diǎn)。研究[30]

表明，蛋白質(zhì)中能提供熒光的氨基酸主要是酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下的蛋白質(zhì)分子熒光光譜圖能有效反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖7可知，隨著pH值的增加，木瓜蛋白酶的熒光峰位置基本沒有發(fā)生藍(lán)移或紅移，說明熒光基團(tuán)在親水環(huán)境中以相對(duì)穩(wěn)定的形式存在[24]。出現(xiàn)波峰的最大激發(fā)波長(zhǎng)均為281 nm，但熒光強(qiáng)度明顯不同。其中pH 8時(shí)的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，這可能是由于該pH值下疏水表面積最大，無(wú)規(guī)卷曲數(shù)量相對(duì)較多，空間結(jié)構(gòu)松散，從而蛋白鏈斷開或分解，導(dǎo)致游離的熒光氨基酸含量大增[31]。

pH 4時(shí)熒光強(qiáng)度最低，可能由于是熒光基團(tuán)過度暴露而發(fā)生猝滅[32]。pH 7時(shí)的熒光強(qiáng)度位于中間值，說明蛋白空間結(jié)構(gòu)比較緊密，這與Rg、酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心殘基距離分析結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

考察5 組pH（4、5、6、7、8）對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，木瓜蛋白酶的活性先增大后減小，pH 7條件下的木瓜蛋白酶活性最高。分子模擬結(jié)果顯示，pH 4和8時(shí)木瓜蛋白酶活性中心的3 個(gè)氨基酸殘基有較大波動(dòng)，此外，在pH 4和8條件下，木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，包括氫鍵的破壞、疏水表面積的改變及β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等因素導(dǎo)致活性下降。在pH 7時(shí)，木瓜蛋白酶活性中心與β-酪蛋白結(jié)合緊密，酶蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)更致密，在pH 4時(shí)，木瓜蛋白酶活性中心與β-酪蛋白結(jié)合部位縫隙較大，且酶蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)較松散，因此pH 7時(shí)更有利于酶的催化作用。本研究綜合實(shí)驗(yàn)和分子模擬技術(shù)結(jié)果，探討不同pH值對(duì)木瓜蛋白酶活性產(chǎn)生的影響，為促進(jìn)木瓜蛋白酶在食品加工中的應(yīng)用及提高產(chǎn)品品質(zhì)提供了一定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kamphuis I G， Kalk K H， Swarte M， et al. Structure of papain refined at 1.65 ? resolution[J]. Journal of Molecular Biology， 1984， 179（2）： 233-256. DOI：10.1016/0022-2836（84）90467-4.

[2] 高進(jìn). 木瓜蛋白酶加工過程中的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)研究[D]. 天津： 天津科技大學(xué)， 2018.

[3] 張瓊. 超聲波協(xié)同半胱氨酸促進(jìn)木瓜蛋白酶嫩化肉塊的應(yīng)用研究[D].成都： 成都大學(xué)， 2021. DOI：10.27917/d.cnki.gcxdy.2021.000131.

[4] 張艷梅， 曾虹燕， 蔡西玲， 等. 汞離子對(duì)木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)的影響及抑制機(jī)理的研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志， 2012， 32（1）： 87-91. DOI：10.13523/j.cb.20120112.

[5] 陳維. 探究pH值對(duì)3 種生物材料中過氧化氫酶活性的影響[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 2014， 49（6）： 53-56.

[6] 彭青， 侯冰， 姚芬， 等. pH值、溫度、底物濃度對(duì)L1型金屬β-內(nèi)酰胺酶活性的影響[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2010， 35（1）： 69-71; 76. DOI：10.13461/j.cnki.cja.004517.

[7] 狄荻， 周詠新， 張新燁， 等. 探究影響菠蘿蛋白酶活性的條件[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 2020， 55（11）： 58-60. DOI：10.3969/j.issn.0006-3193.2020.11.019.

[8] LI Y L， ZHANG S Y， BAO Z J， et al. Exploring the activation mechanism of alcalase activity with pulsed electric field treatment： effects on enzyme activity， spatial conformation， molecular dynamics simulation and molecular docking parameters[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2022， 76： 102918. DOI：10.1016/j.ifset.2022.102918.

[9] 帥雨桐， 黃業(yè)傳， 何元琪， 等. 分子動(dòng)力學(xué)模擬加熱對(duì)肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)及酚類物質(zhì)吸附的影響[J]. 肉類研究， 2021， 35（3）： 8-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210309-057.

[10] 黃業(yè)傳， 張喜才， 曾奕秀， 等. 高壓處理對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響及分子動(dòng)力學(xué)模擬[J]. 食品工業(yè)科技， 2023， 44（12）： 102-107. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2022090241.

[11] ABRAHAM M J， MURTOLA T， SCHULZ R， et al. GROMACS： high performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers[J]. SoftwareX， 2015， 1/2： 19-25. DOI：10.1016/j.softx.2015.06.001.

[12] SCHMID N， EICHENBERGER A P， CHOUTKO A， et al. Definition and testing of the GROMOS force-field versions 54A7 and 54B7[J]. European Biophysics Journal， 2011， 40（7）： 843-856. DOI：10.1007/s00249-011-0700-9.

[13] 簡(jiǎn)清梅， 索化夷， 張喜才， 等. 分子動(dòng)力學(xué)模擬超高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品科學(xué)， 2021， 42（23）： 57-63. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20210427-378.

[14] Mehta S K， Bhawna， Rekha， et al. The effect of the presence of sodium bis-（2-ethylhexyl） sulfosuccinate （AOT） on the interactions between sodium dodecyl sulfate （SDS） and protein papain[J]. Journal of Molecular Liquids， 2017， 248： 751-758. DOI：10.1016/j.molliq.2017.10.083.

[15] 朱新儒. [CnPy]Cl（n=2，4，6）吡啶離子液體的合成及雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2019. DOI：10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000896.

[16] 王偉濤. 木瓜蛋白酶的雙水相萃取研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2014.

[17] 余壘. PEG/無(wú)機(jī)鹽/離子液體、離子液體/無(wú)機(jī)鹽雙水相分離純化木瓜蛋白酶的研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2019. DOI：10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000737.

[18] LI F F， LI Q， WU S G， et al. Salting-out extraction of sinomenine from Sinomenium acutum by an alcohol/salt aqueous two-phase system using ionic liquids as additives[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology， 2018， 93： 1925-1930. DOI：10.1002/jctb.5318.

[19] OCKERMAN H， HARNSAWAS S， YETIM H. Papain in meat is inhibited by potato protein or ascorbic acid[J]. Food Science， 1993， 58： 1265-1268. DOI：10.1111/j.1365-2621.1993.tb06162.x.

[20] 孔慶新， 黃業(yè)傳， 徐偉平， 等. β-乳球蛋白與EGCG結(jié)合規(guī)律的分子動(dòng)力學(xué)探究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2022， 41（1）： 51-59. DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2022.01.007.

[21] 邵冬青， 張群， 姜舟婷. 分子動(dòng)力學(xué)模擬研究溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響[J]. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 33（1）： 44-48; 130. DOI：10.3969/j.issn.2096-2835.2022.01.007.

[22] 曾琪， 胡淼， 王歡， 等. pH值處理對(duì)黑豆分離蛋白結(jié)構(gòu)、流變特性及乳化性能的影響[J]. 食品科學(xué)， 2020， 41（22）： 15-21. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20190906-080.

[23] Mozhaev V V， Lange R， Kudryashova E V， et al. Application of high hydrostatic pressure for increasing activity and stability of enzymes[J]. Biotechnology & Bioengineering， 1996， 52（2）： 320-331. DOI：10.1002/（sici）1097-0290（19961020）52：23.0.CO;2-N.

[24] 郭洪偉. 超高壓、pH值對(duì)芽孢皮層裂解酶的活力及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)影響的研究[D]. 銀川： 寧夏大學(xué)， 2019. DOI：10.27257/d.cnki.gnxhc.2019.000569.

[25] 韓玲. 溫度及pH對(duì)氯化鈉誘導(dǎo)的溶菌酶聚集的影響及其分子機(jī)制的研究[D]. 沈陽(yáng)： 遼寧大學(xué)， 2011.

[26] ZHU J X， LI K J， WU H， et al. Multi-spectroscopic， conformational， and computational atomic-level insights into the interaction of β-lactoglobulin with apigenin at different pH levels[J]. Food Hydrocolloids， 2020， 105： 105810. DOI：10.1016/j.foodhyd.2020.105810.

[27] ABDOLLAHI K， INCE C， CONDICT L， et al. Combined spectroscopic and molecular docking study on the pH dependence of molecular interactions between β-lactoglobulin and ferulic acid[J]. Food Hydrocolloids， 2019， 101： 105461. DOI：10.1016/j.foodhyd.2019.105461.

[28] Drenth J， Jansonius J N， Koekoek R， et al. The structure of papain[J]. Advances in Protein Chemistry， 1971， 25： 79-115. DOI：10.1016/S0065-3233（08）60279-x.

[29] 楊家祥， 張玉慧， 許興友， 等. 熒光光譜在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中的應(yīng)用[J]. 淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 1999， 8（4）： 28-31.

[30] Bhuiya S， Chowdhury S， Das S. Molecular insight into the binding aspects of benzo[c]phenanthridine alkaloid nitidine with bovine hemoglobin： a biophysical exploration[J]. Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2019， 223： 117293. DOI：10.1016/j.saa.2019.117293.

[31] 曾新安， 于淑娟， 徐婭莉. 脈沖電場(chǎng)對(duì)木瓜蛋白酶影響的熒光光譜分析[J]. 光譜學(xué)與光譜分析， 2007， 27（12）： 2558-2561. DOI：10.3964/j.issn.1000-0593.2007.12.044.

[32] 郭雁. 駝乳血清白蛋白的分離純化及其結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性研究[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

收稿日期：2024-06-18

基金項(xiàng)目：荊楚理工學(xué)院校級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（KC2023052）；荊門市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFZD058）

第一作者簡(jiǎn)介：代雯（2003—）（ORCID： 0009-0003-3284-2974），女，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail： 2382701094@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：黃業(yè)傳（1975—）（ORCID： 0000-0002-1931-9017），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸すこ獭-mail： huangyc@juct.edu.cn