摘 要：人類患李斯特菌病的概率和食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最大污染濃度（Nmax）緊密相關(guān)。益生菌作為生物保護(hù)菌應(yīng)用在食品中控制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長已得到廣泛應(yīng)用，在復(fù)雜的食品環(huán)境中，益生菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長特性的影響可通過細(xì)菌間的競爭抑制模型來描述。本研究首先確認(rèn)益生菌植物乳桿菌植物亞種CICC6257（以下簡稱為植物乳桿菌CICC6257）在豬肉中的生長能力，探究該菌對(duì)豬肉品質(zhì)的影響，然后對(duì)選擇性培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)能力進(jìn)行驗(yàn)證，最后基于預(yù)測微生物學(xué)方法研究植物乳桿菌CICC6257對(duì)豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長特性的影響。結(jié)果表明：植物乳桿菌CICC6257在13 ℃貯藏的豬肉中生長良好，60 h左右生長達(dá)到穩(wěn)定期，并且在貨架期內(nèi)對(duì)豬肉的pH值無顯著影響（P≥0.05）；選擇性培養(yǎng)基可以很好地對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257進(jìn)行分離計(jì)數(shù)；Jameson-effect模型能夠準(zhǔn)確描述植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用；植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的遲滯時(shí)間（λ）和最大比生長速率（μmax）無顯著影響（P≥0.05），但可將豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的Nmax顯著降低0.75（lg（CFU/g））（P＜0.05）。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌CICC6257；豬肉；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；抑制模型

Modeling the Inhibitory Effect of Lactobacillus plantarum on the Growth of Listeria monocytogenes in Pork

ZHANG Wenmin1， DONG Qingli2，*， LIU Yangtai2， XIN Bao1， QIAN Wenwen1

（1. School of Public Health， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China; 2. School of Health Science and Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract： The maximum population density （Nmax） of Listeria monocytogenes in foods plays an important role in the probability of suffering listeriosis. Probiotics are widely used as bioprotective culture in foods to control the growth ofL. monocytogenes. In complex food environments， the impact of probiotic on the growth characteristics of L. monocytogenes can be described by a model describing inter-bacteria competitive inhibition. In this study， we first confirmed the growth ability of Lactobacillus plantarum CICC6257 in pork and explored its effect on pork quality. Then， we validated the accuracy of microbial counting results with selective culture medium. Finally， the antagonistic ability of L. plantarum CICC6257 againstL. monocytogenes was investigated on the basis of predictive microbiology. Results showed that L. plantarum CICC6257 could grow well in pork and reach the stationary phase after 60 h at 13 ℃. L. plantarum CICC6257 had no significant effect on the pH of pork within the shelf-life period （P ≥ 0.05）. Moreover， both species were well isolated by the selective medium. The Jameson-effect model accurately described the inhibitory effect of L. plantarum CICC6257 on L. monocytogenes in pork. The presence of L. plantarum CICC6257 showed no significant effect on the lag phase （λ） or maximal growth rate （μmax） ofL. monocytogenes （P ≥ 0.05）， but decreased the Nmax significantly by 0.75 （lg （CFU/g）） （P < 0.05）.

Keywords： Lactobacillus plantarum CICC6257; pork; Listeria monocytogenes; inhibition model

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240627-160

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）10-0001-08

引文格式：

張文敏， 董慶利， 劉陽泰， 等. 植物乳桿菌對(duì)豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌抑制模型的建立[J]. 肉類研究， 2024， 38（10）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240627-160. http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Wenmin， DONG Qingli， LIU Yangtai， et al. Modeling the inhibitory effect of Lactobacillus plantarum on the growth of g1LLd89ogZDrOi5ZAsR0t0vtn/xvo4otewPnmB+yKeY=Listeria monocytogenes in pork[J]. Meat Research， 2024， 38（10）： 1-8. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240627-160. http：//www.rlyj.net.cn

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種胞內(nèi)寄生性人畜共患致病菌，可穿越宿主的腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障，在宿主細(xì)胞中存活并繁殖。動(dòng)物和人類在攝入一定劑量的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌后會(huì)患李斯特菌病，強(qiáng)毒株的半數(shù)致死劑量為2.57～3.67（lg（CFU））[1]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在豬肉中可以達(dá)到的最大污染濃度（Nmax）由該菌的生長特性決定。遲滯時(shí)間（λ）、最大比生長速率（μmax）和Nmax等生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)是描述單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長特性的重要指標(biāo)[2]。通過對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長動(dòng)態(tài)進(jìn)行數(shù)學(xué)建?？梢垣@得該菌的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

益生菌可作為生物柵欄因子，通過與致病菌接觸時(shí)的信號(hào)分子交流、營養(yǎng)競爭及產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物抑制致病菌的生長[3]。Djenane等[4]的研究表明，清酒乳桿菌可以降低牛排中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的數(shù)量，并且對(duì)牛排的色澤與風(fēng)味沒有負(fù)面影響。Casale等[5]發(fā)現(xiàn)，乳酸乳桿菌可以抑制巴西白奶酪中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長，并且對(duì)白奶酪的物化性質(zhì)沒有影響。Prezzi[6]、Heredia-Castro[7]等指出，乳酸菌作為生物保護(hù)菌的首要條件是可在食品中生存繁殖，同時(shí)對(duì)食品品質(zhì)無負(fù)面影響。

近些年來，兩菌競爭抑制模型如Lotkae-Volterra模型（機(jī)理性交互模型）和Jameson-effect模型（經(jīng)驗(yàn)性交互模型）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到預(yù)測微生物學(xué)領(lǐng)域。機(jī)理性交互模型考慮到微生物整個(gè)生長階段環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化[8-10]，可以很好描述微生物間的交互作用，但是機(jī)理性模型包含的參數(shù)太多，模型建立過程比較復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中不易實(shí)施。Lotkae-Volterra模型可能會(huì)高估細(xì)菌的λ，低估μmax，這會(huì)導(dǎo)致致病菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估出現(xiàn)“失敗-危險(xiǎn)”的結(jié)果[11]。先前大量研究表明Jameson-effect模型適合描述同一環(huán)境中優(yōu)勢菌對(duì)劣勢菌的抑制作用，經(jīng)過修正擴(kuò)展后的Jameson-effect模型適用于模擬多種環(huán)境條件下微生物間的交互作用[12-14]。

本研究選取產(chǎn)細(xì)菌素的益生菌植物乳桿菌植物亞種CICC6257（以下簡稱為植物乳桿菌CICC6257）為生物保護(hù)菌，首先研究該菌在豬肉中的生存能力及對(duì)其對(duì)豬肉pH值的影響，然后評(píng)估選擇性培養(yǎng)基對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257進(jìn)行分離計(jì)數(shù)的能力，最后將植物乳桿菌CICC6257添加到豬肉中抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長，應(yīng)用Jameson-effect模型構(gòu)建植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型，探究植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌λ、μmax和Nmax的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿瘦肉（2 kg） 上海卜蜂蓮花超市（周家嘴路店）。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC13932，血清型4b）由本實(shí)驗(yàn)室保藏；益生菌植物乳桿菌CICC6257購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（http：//www.china-cicc.org/）。植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活化所用培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHIB）培養(yǎng)基；植物乳桿菌CICC6257的選擇性增菌培養(yǎng)基為MRS肉湯（MRS broth，MRSB）培養(yǎng)基，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的選擇性增菌培養(yǎng)基為胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（tryptic soy broth with yeast extract，TSB-YE）培養(yǎng)基；用于植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌分離計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基分別為MRS瓊脂（MRS agar，MRSA）和PALCAM瓊脂，以上培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

氯化鈉、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液、無水乙醇、甘油、細(xì)菌培養(yǎng)皿、無菌均質(zhì)袋、封口膜和試管均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-S2型滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HLQ-8型斬拌機(jī) 安徽華菱西廚裝備有限公司；SW-CJ-IFD型生物安全柜 江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-103B型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海比朗儀器有限公司；JJ500型電子天平 江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；XW-80A型漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Bagmixer 400型無菌均質(zhì)機(jī) 法國Interscience公司；10型pH計(jì) 浙江力辰科技有限公司；DW-300型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng) 上海和泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)和接種液制備

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257接種液的制備過程如下：實(shí)驗(yàn)前1 d，用滅菌的接種環(huán)分別從4 ℃冰箱保存的TSB-YE和MRSB培養(yǎng)基上挑取1 株菌苔，分別接種于100 mL BHIB培養(yǎng)基中。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在37 ℃、110 r/min的搖床上培養(yǎng)18 h，植物乳桿菌CICC6257在37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h，使細(xì)菌生長到穩(wěn)定期。然后分別取10 mL單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257的菌懸液在冷凍離心機(jī)中離心（4 ℃、8 000 r/min、5 min）收集菌體，菌體分別用10 mL無菌生理鹽水重懸，重復(fù)2 次。最后用無菌生理鹽水分別將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257菌液稀釋到104～105 CFU/mL和106～107 CFU/mL左右備用。

1.3.2 植物乳桿菌CICC6257在豬肉中的生長能力測定

實(shí)驗(yàn)前將整塊的豬后腿瘦肉切成小塊，放在用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭滅菌過的斬拌機(jī)中斬拌3 min，將制得的肉糜放在預(yù)先紫外殺菌的托盤里，轉(zhuǎn)移到無菌操作臺(tái)中，紫外輻照1 h，期間每隔15 min翻動(dòng)肉糜，使肉糜的外部和內(nèi)部都能被紫外輻射滅菌。

在生物安全柜中，稱取已滅菌的豬肉（25 g/份）分裝在無菌均質(zhì)袋中，每份豬肉接種1 mL植物乳桿菌CICC6257菌液。將接種菌液的豬肉用無菌均質(zhì)機(jī)正反面各拍打2 min，使得菌液在豬肉中均勻分布。植物乳桿菌CICC6257的接種濃度約為105 CFU/g，確切初始接種量由平板計(jì)數(shù)法確認(rèn)。將均質(zhì)袋中的豬肉轉(zhuǎn)移到經(jīng)紫外殺菌的氣調(diào)保鮮盒中進(jìn)行無菌空氣包裝，然后將包裝好的豬肉放置在13 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（相對(duì)濕度55%）培養(yǎng)。每隔適宜時(shí)間取樣對(duì)植物乳桿菌CICC6257進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為MRSA培養(yǎng)基。

1.3.3 植物乳桿菌CICC6257接種豬肉pH值的測定

乳酸菌菌體及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能會(huì)影響豬肉的感官品質(zhì)，主要是產(chǎn)生的有機(jī)酸會(huì)引起豬肉pH值的變化。檢測植物乳桿菌CICC6257對(duì)豬肉pH值的影響，未經(jīng)處理的豬肉作為對(duì)照組，直接用pH計(jì)插入豬肉中進(jìn)行pH值測定。

1.3.4 選擇性培養(yǎng)基的驗(yàn)證

按照1.3.1節(jié)所述制備單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257生長到穩(wěn)定期的接種液。用滅菌后的接種環(huán)蘸取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的接種液在MRSA和PALCAM培養(yǎng)基上分別劃線培養(yǎng)分離單菌落，同時(shí)蘸取植物乳桿菌CICC6257的接種液分別在MRSA和PALCAM培養(yǎng)基上分別劃線。將劃線后的培養(yǎng)皿倒置放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)菌菌落形成情況，拍照記錄。

1.3.5 植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在豬肉中的生長特性測定

將已滅菌的豬肉按照25 g/份放置在均質(zhì)袋中，分成以下3 組：1）陰性對(duì)照組，每份豬肉接種2 mL無菌生理鹽水；2）單核細(xì)胞增生李斯特氏菌單獨(dú)接種組（對(duì)照組），每份豬肉接種2 mL單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（1 mL）和無菌生理鹽水（1 mL）的混合液；3）單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257共同接種組（處理組），每份豬肉接種2 mL植物乳桿菌CICC6257（1 mL）和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（1 mL）的混合液。

將接種菌液的豬肉用無菌均質(zhì)機(jī)正反面各拍打2 min，使得菌液在豬肉中均勻分布。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257的確切初始接種量用平板計(jì)數(shù)法確認(rèn)。將均質(zhì)袋中的豬肉轉(zhuǎn)移到經(jīng)紫外殺菌的氣調(diào)保鮮盒中進(jìn)行無菌空氣包裝，然后將包裝好的豬肉放置在13 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在適宜間隔取樣對(duì)豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法如下：在無菌條件下，將氣調(diào)保鮮盒中的豬肉轉(zhuǎn)移到含有225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，然后在均質(zhì)機(jī)上拍打2 min，使細(xì)菌充分散落在勻漿中。用10 倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，選擇2～3 個(gè)適宜稀釋度的菌懸液，用移液槍吸取100 μL涂布在預(yù)先準(zhǔn)備好的PALCAM和MRSA選擇性培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)皿晾干之后，倒置放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。為檢測紫外輻照殺滅豬肉中背景菌的效果，將陰性對(duì)照組的均質(zhì)液涂布在TSA平板上，培養(yǎng)條件與計(jì)數(shù)方法同上。

1.3.6 植物乳桿菌CICC6257對(duì)豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌抑制模型的建立

1.3.6.1 一級(jí)模型的構(gòu)建

選用Baranyi模型[15]構(gòu)建植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的一級(jí)模型，見

式（1）～（3）：

（1）

（2）

（3）

式中：Y0、Y（t）和Ymax分別為初始時(shí)刻、

t時(shí)刻和達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落總數(shù)（ln（CFU/g））；μmax為最大比生長速率/（ln（CFU/g））－h(huán)；λ為細(xì)菌生長的遲滯時(shí)間/h。

1.3.6.2 抑制模型的構(gòu)建

應(yīng)用修正的Jameson-effect模型構(gòu)建植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型，模型的建立分為3 步：首先，應(yīng)用傳統(tǒng)的Baranyi模型擬合得到植物乳桿菌CICC6257與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌共同培養(yǎng)時(shí)兩菌的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)；其次，將得到的兩菌生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)應(yīng)用到修正的Jameson-effect模型中，擬合得到抑制系數(shù)γ和Nmax；最后，應(yīng)用MATLAB軟件編寫程序，模擬植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用圖。修正的Jameson-effect模型見式（4）～（7）[16]：

（4）

（5）

（6）

（7）

在細(xì)菌遲滯時(shí)間內(nèi)，

式中：μmax-Lm和μmax-Lp分別為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257的最大比生長速率（ln（CFU/g））－h(huán)；Lm（t）和Lp（t）分別為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257在t時(shí)刻的菌落總數(shù)（lg（CFU/g））；qLm（t）和qLp（t）分別為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257在t時(shí)刻的生理狀態(tài)（q＝μt/μmax）；Nmax-Lm和Nmax-Lp分別為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257的最大菌落總數(shù)（lg（CFU/g））。植物乳桿菌CICC6257達(dá)到最大菌落總數(shù)后，若γ＜1，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌繼續(xù)生長，菌落總數(shù)增加；若γ＞1，菌落總數(shù)減?。蝗籀茫?，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌停止生長。

1.3.6.3 抑制模型的數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)

應(yīng)用準(zhǔn)確因子（accuracy factor，Af）、偏差因子（bias factor，Bf）和均方根誤差（root mean square error，RMSE）對(duì)構(gòu)建的抑制模型進(jìn)行數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)。Af、Bf和RMSE分別按式（8）～（10）計(jì)算：

（8）

（9）

（10）

式中：n為觀察的數(shù)據(jù)點(diǎn)個(gè)數(shù)；Np為細(xì)菌菌落總數(shù)的預(yù)測值（lg（CFU/g））；No為細(xì)菌菌落總數(shù)的觀察值（lg（CFU/g））。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2010將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)單位CFU/g轉(zhuǎn)換為（lg（CFU/g））。應(yīng)用Microrisk Lab軟件（https：//www.microrisklab.top/）擬合單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257的一級(jí)生長模型，得到單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257的λ和μmax，應(yīng)用MATLAB R2016a軟件（美國MathWorks公司）構(gòu)建植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少做3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 17.0軟件（美國IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌CICC6257在豬肉中的生長特性

本研究涉及全程非冷鏈運(yùn)輸模型，根據(jù)EcoSure[17]對(duì)市售冷鮮豬肉環(huán)境的調(diào)研數(shù)據(jù)，冷鮮保藏環(huán)境溫度在－6.67～19.44 ℃之間，因此本研究選取13 ℃研究益生菌對(duì)豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制特性，以達(dá)到高估風(fēng)險(xiǎn)的目的。

由圖1可知，植物乳桿菌CICC6257生長緩慢，在60 h左右生長到穩(wěn)定期。植物乳桿菌CICC6257在13 ℃貯藏豬肉中生長狀況良好，具有用作生物保護(hù)菌抑制豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的潛力。植物乳桿菌CICC6257是國家公布的可用于添加到食品中的益生菌之一[18]。本研究所用植物乳桿菌CICC6257是產(chǎn)細(xì)菌素的益生菌，Gao Quanxin等[19]指出植物乳桿菌CICC6257的脂磷壁酸還可以緩解由鰻弧菌誘導(dǎo)的銀鯧魚炎癥和凋亡。并不是所有的乳酸菌都具有作為生物保護(hù)菌的潛力，如Li Peijun等[20]測試6 株乳酸菌對(duì)新鮮雞胸肉中梭狀芽孢桿菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌雖然能夠抑制梭狀芽孢桿菌的生長，但是顯著降低了鮮雞肉的pH值，因此不適宜作為生物保護(hù)菌應(yīng)用在雞肉中。

2.2 植物乳桿菌CICC6257對(duì)豬肉pH值的影響

GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》[21]規(guī)定豬肉的pH值在5.8～6.2之間為新鮮肉，在6.3～6.6之間為次鮮肉，在6.7以上為變質(zhì)肉。由圖2可知，13 ℃貯藏72 h時(shí)，對(duì)照組豬肉的pH值顯著增加到6.75（P＜0.05），成為變質(zhì)肉；處理組豬肉的pH值先輕微下降，然后上升，處理組豬肉貯藏后期的pH值和貯藏初期無顯著差異（P≥0.05）。Huang Shirong等[22]研究超臨界CO2結(jié)合迷迭香對(duì)4 ℃貯藏豬肉品質(zhì)的影響，同樣發(fā)現(xiàn)在貯藏的第7天，對(duì)照組豬肉pH值從初始值5.75升高到7.20。朱亞[23]、Bohrer[24]、Vaskoska[25]等也發(fā)現(xiàn)豬肉貯藏期間pH值上升的現(xiàn)象。

在13 ℃貯藏初期，處理組豬肉的pH值呈下降趨勢。隨著貯藏時(shí)間延長，豬肉的pH值又呈現(xiàn)上升趨勢，這是因?yàn)橘A藏后期豬肉中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)[26]，中和了植物乳桿菌CICC6257產(chǎn)生的酸性物質(zhì)。Hernández-Aquino等[27]詳細(xì)研究多種植物乳桿菌CICC6257對(duì)豬肉品質(zhì)的影響，對(duì)豬肉進(jìn)行感官評(píng)定，并對(duì)豬肉pH值進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同植物乳桿菌CICC6257對(duì)豬肉品質(zhì)的影響效果不同。本研究所選植物乳桿菌CICC6257不僅在豬肉中生長狀態(tài)良好，且對(duì)豬肉pH值的影響較小，因此將該株植物乳桿菌CICC6257作為生物保護(hù)菌控制肉制品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

2.3 選擇性培養(yǎng)基的確認(rèn)

由圖3可知，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在MRSA培養(yǎng)基上不生長，植物乳桿菌CICC6257在MRSA培養(yǎng)基上為白色圓點(diǎn)狀。植物乳桿菌CICC6257在PALCAM培養(yǎng)基上不生長，只在一區(qū)（菌液最多的地方）形成黑色印記，沒有完整的單菌落形成。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在PALCAM選擇性培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形的黑灰色菌落，菌落外圍有棕黑色的水解圈，將整個(gè)培養(yǎng)基暈成黑色。

微生物一級(jí)生長模型的實(shí)質(zhì)是對(duì)細(xì)菌菌落數(shù)隨時(shí)間的變化進(jìn)行數(shù)學(xué)建模，需要在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段監(jiān)測目標(biāo)菌落隨時(shí)間的變化，細(xì)菌計(jì)數(shù)的精確性對(duì)模型的準(zhǔn)確性有很大影響。如果實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中只有1 種菌，用基礎(chǔ)的含有碳源、氮源和其他細(xì)菌所需成分的培養(yǎng)基即可。當(dāng)2 種甚至更多種細(xì)菌共同存在時(shí)，需要用選擇性培養(yǎng)基將目標(biāo)細(xì)菌選擇分離出來[28]。本實(shí)驗(yàn)所用豬肉為紫外輻照滅菌后經(jīng)檢驗(yàn)不含背景菌的豬肉，因此不考慮豬肉中含有其他雜菌的情況。由圖3可知，MRSA和PALCAM培養(yǎng)基能夠作為選擇性培養(yǎng)基，對(duì)混合培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257進(jìn)行分離計(jì)數(shù)。

2.4 植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用

陰性對(duì)照組中無菌落檢出，說明豬肉滅菌效果良好。由圖4可知，和對(duì)照組相比，處理組單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長緩慢，且Nmax較低，這是因?yàn)樘幚斫M的益生菌植物乳桿菌CICC6257發(fā)酵糖類后，產(chǎn)生乳酸和乙酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸可與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的磷脂及脂多糖作用，進(jìn)而破壞該菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終抑制細(xì)菌的生長[29]。另外，食品基質(zhì)pH值降低導(dǎo)致H＋在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌細(xì)胞內(nèi)聚集，細(xì)胞膜上質(zhì)子電化學(xué)勢梯度的改變破壞了細(xì)菌的跨膜運(yùn)輸系統(tǒng)[30]；H＋聚集在細(xì)胞內(nèi)造成胞內(nèi)滲透壓升高，胞內(nèi)微環(huán)境的改變影響細(xì)菌酶的活性，干擾DNA合成、RNA轉(zhuǎn)錄等進(jìn)程[31]；細(xì)菌主動(dòng)運(yùn)輸H＋會(huì)消耗大量能量、使其生長代謝速率降低等原因都會(huì)造成處理組單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長緩慢[32]。處理組中植物乳桿菌CICC6257到達(dá)穩(wěn)定期后，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌繼續(xù)生長一段時(shí)間后停止生長。這是因?yàn)橹参锶闂U菌CICC6257生長到穩(wěn)定期后，通過與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌競爭營養(yǎng)、接觸時(shí)的信號(hào)分子交流、產(chǎn)生大量抑菌代謝產(chǎn)物抑制了該菌的生長[3]。

為更深入研究植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長特性的影響，需要進(jìn)一步對(duì)一級(jí)模型擬合得到的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌λ、μmax和Nmax進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5 植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌λ、μmax和Nmax的影響

用Baranyi模型擬合單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌CICC6257單獨(dú)及混合培養(yǎng)時(shí)的生長曲線，得到兩菌的λ、μmax和Nmax見表1。和對(duì)照組相比，處理組單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的λ較長，μmax也較低，但是沒有顯著差異（P≥0.05）；而處理組單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的Nmax比對(duì)照組顯著降低0.75（lg（CFU/g））（P＜0.05）。初始接種量約為5（lg（CFU/g））的植物乳桿菌CICC6257可以在13 ℃條件下顯著降低單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的Nmax（P＜0.05）。根據(jù)Jameson-effect理論，處于同一系統(tǒng)中的微生物種群會(huì)競爭有限的資源，當(dāng)優(yōu)勢菌群達(dá)到最大濃度時(shí)，會(huì)抑制劣勢菌群的生長[33-36]。將植物乳桿菌CICC6257接種較高的濃度使其成為優(yōu)勢菌群以抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長，同時(shí)，植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌細(xì)胞接觸時(shí)的信息交流及植物乳桿菌CICC6257產(chǎn)生的抑菌代謝產(chǎn)物也抑制了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長[37]。本研究結(jié)果還表明，植物乳桿菌CICC6257的生長不受單核細(xì)胞增生李斯特氏菌影響（圖1、4），有潛力作為生物保護(hù)菌抑制豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長。

2.6 植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌抑制模型的建立及評(píng)價(jià)

由表2可知，植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的γ為0.79，說明在植物乳桿菌CICC6257達(dá)到穩(wěn)定期后，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落總數(shù)增加。由圖4可知，植物乳桿菌CICC6257達(dá)到穩(wěn)定期后，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌繼續(xù)緩慢生長了一段時(shí)間后才停止生長。

包含γ的Jameson-effect模型能夠更好地描述優(yōu)勢菌群對(duì)劣勢菌群的抑制作用，如董慶利等[38]用改良的Jameson-effect模型建立5 種溫度條件下植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型，Mejlholm等[13]應(yīng)用含有γ的Jameson-effect模型構(gòu)建蛋黃醬海鮮沙拉中乳酸菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型，Quinto等[39]應(yīng)用含有γ的Jameson-effect模型建立肉汁中不同清酒乳桿菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型，M?ller等[40]應(yīng)用含有γ的Jameson-effect模型建立鮮肉中背景菌和沙門氏菌的交互模型。Marc等[41]發(fā)現(xiàn)，修正后的Jameson-effect模型更適用于描述牛奶中乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。以上研究表明，在混合培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)勢菌達(dá)到穩(wěn)定期后，γ可以對(duì)劣勢菌的濃度變化作出準(zhǔn)確的預(yù)測。建立植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制模型后，可以根據(jù)一級(jí)Baranyi模型得到的植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的λ和μmax預(yù)測任意時(shí)刻植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制情況，進(jìn)而監(jiān)控兩菌的生長動(dòng)態(tài)。

由圖5可知，改良的Jameson-effect模型能夠很好地描述植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用，兩菌的生長都呈現(xiàn)出遲滯期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期3 個(gè)階段。植物乳桿菌CICC6257和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌共培養(yǎng)時(shí)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落總數(shù)遠(yuǎn)低于植物乳桿菌CICC6257。在豬肉中，植物乳桿菌CICC6257作為優(yōu)勢菌抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長，植物乳桿菌CICC6257生長到達(dá)穩(wěn)定期后，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌繼續(xù)生長，這和γ的預(yù)測結(jié)果一致。建立的抑制模型RMSE為0.26，Af和Bf分別為1.05和0.96，說明Jameson-effect模型能夠很好地描述植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用[42]。

為滿足消費(fèi)者對(duì)“輕加工”及“安全、營養(yǎng)”食品的要求，生物抑菌法引起越來越多人的關(guān)注。益生菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的抑制作用已在乳制品、肉制品及果蔬等食品中得到驗(yàn)證。目前在進(jìn)行理論研究時(shí)往往會(huì)去除背景菌，且不考慮食品基質(zhì)和背景菌群對(duì)建模結(jié)果的影響，以期更準(zhǔn)確地探究乳酸菌作為抑菌手段的有效性，但是這可能會(huì)影響模型的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致高估或低估單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的風(fēng)險(xiǎn)[39-41]。真實(shí)食品基質(zhì)營養(yǎng)成分復(fù)雜，且在實(shí)際食品環(huán)境中往往多菌共存，這些環(huán)境條件對(duì)致病菌的生長存在一定的影響[35]，后續(xù)可在兩菌交互模型建立的理論基礎(chǔ)上將這些環(huán)境參數(shù)都納入模型，對(duì)模型進(jìn)行修正擴(kuò)展，以期對(duì)實(shí)際食品中益生菌與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的關(guān)系作出更準(zhǔn)確的預(yù)測。

3 結(jié) 論

應(yīng)用在食品中的益生菌需具有較高的活性，能夠在食品中生存和繁殖，并且不能對(duì)食品的感官品質(zhì)產(chǎn)生較大的負(fù)面影響。植物乳桿菌CICC6257在豬肉中生長良好，并且在貨架期內(nèi)對(duì)豬肉pH值無顯著影響（P≥0.05）。植物乳桿菌CICC6257可以將13 ℃貯藏豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的Nmax降低0.75（lg（CFU/g）），但是對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的λ和μmax無顯著影響（P≥0.05），可將植物乳桿菌CICC6257與其他抑菌技術(shù)如氣調(diào)包裝、益生元和苯甲酸鈉等聯(lián)用，以更好地提高食品的微生物安全。另外，本研究建立的Jameson-effect模型能夠很好地描述將食品基質(zhì)背景菌消除后植物乳桿菌CICC6257對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用，但是實(shí)際食品中多種微生物共存，它們之間相互影響。后續(xù)可在兩菌交互模型建立的理論基礎(chǔ)上研究實(shí)際食品狀態(tài)下益生菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制作用，并且評(píng)估食品中菌群結(jié)構(gòu)的改變及食品品質(zhì)的變化，這對(duì)推進(jìn)益生菌在保護(hù)肉類產(chǎn)品安全領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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收稿日期：2024-06-27

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳一般項(xiàng)目（2024JC-YBQN-0236）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（303-124020069）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（S202410716005）

第一作者簡介：張文敏（1992—）（ORCID： 0009-0003-9853-2143），女，講師，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品安全與質(zhì)量控制。E-mail： zwenmin0309@163.com

*通信作者簡介：董慶利（1979—）（ORCID： 0000-0001-9019-0001），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇踩?。E-mail： qdong@usst.edu.cn