摘 要：為了實(shí)現(xiàn)核苷酸多態(tài)性（SNP）的精準(zhǔn)分型，針對(duì)SLC39A13基因rs755555位點(diǎn)，建立基于熒光定量PCR的分子診斷技術(shù)。首先，分別設(shè)計(jì)rs755555位點(diǎn)及內(nèi)參基因peptidylprolyl isomerase A（PPIA）的Taqman熒光ARMS-PCR檢測引物和探針；其次，構(gòu)建陽性對(duì)照質(zhì)粒；最后，以基因分型精確度為指標(biāo)，優(yōu)化引物探針組合，以及檢測試劑的 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。結(jié)果表明：野生型最優(yōu)引物探針組合為WF1、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5，突變型最優(yōu)引物探針組合為FMF3、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5；每個(gè)檢測樣品的最優(yōu)反應(yīng)體系為SLC39A13基因上下游引物探針各0.1 μL，內(nèi)標(biāo)上下游引物探針各0.1 μL，10 μL PerfectStartⅡ Probe qPCR SuperMix UDG，5.4 μL純水，4 μL樣品基因組。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和70個(gè)樣品的檢測驗(yàn)證，確認(rèn)了檢測體系的可行性，為研發(fā)SLC39A13基因rs755555位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；人SLC39A13基因；ARMS-PCR；核苷酸多態(tài)性檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2024yx05005

Establishment of a method for detecting nucleotide polymorphism

of SLC39A13 gene based on ARMS-PCR

GUO Bingqian1，LI Mengyu2，WANG Rui3，WANG Shusong4， FENG Huiyong1，LI Tianming1

（1.School of Food and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018，China;

2.Forestry Institute，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150006，China;

3.Taiyuan Jinyu Clinical Inspection Office Company Limited，Taiyuan，Shanxi 030003，China;

4.Hebei Key Labratory of Reproductive Medicine， Hebei Hospital of Reproductive Health，

Shijiazhuang，Hebei 050071， China）

Abstract：In order to achieve its nucleotide polymorphism （SNP） accurate typing， this paper establishes a molecular diagnostic technique based on fluorescent quantitative PCR for accurate genotyping of the nucleotide polymorphism （SNP） at the rs755555 locus of the SLC39A13 gene. Firstly， Taqman fluorescent ARMS-PCR detection primers and probes were designed for the rs755555 locus and the internal reference gene peptidylprolyl isomerase A （PPIA）. Secondly， positive control plasmids were constructed. Finally， based on genotyping accuracy， the primer and probe combinations were optimized， and the PCR reaction system and conditions for the detection reagents were optimized. The optimal primer and probe combination for the wild-type was： WF1， R1， FP1， PIRF5， PIRR5， PIRP5; the optimal combination for the mutant type was： FMF3， R1， FP1， PIRF5， PIRR5， PIRP5. The optimal reaction system for detecting samples was： 01 μL each of upstream and downstream primers and probes for the SLC39A13 gene， 01 μL each of upstream and downstream primers and probes for the internal standard， 10 μL PerfectStart Ⅱ Probe qPCR SuperMix UDG， 54 μL purified water， and 4 μL sample genome. The feasibility of this detection system was confirmed through reproducibility experiments and the detection of 70 samples. This provides a technical foundation for the development of a detection kit for the polymorphism at the rs755555 locus of the SLC39A13 gene.

Keywords：molecular biology；human SLC39A13 gene；ARMS-PCR；nucleotide polymorphism detection；real-time fluorescence quantitative PCR

鋅是人體必需的微量元素，也是男性生殖的重要關(guān)聯(lián)因子[1]。已有研究證實(shí)，缺鋅會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生障礙、降低精液質(zhì)量和生育力

[2-4]。鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)存在個(gè)體差異，但其遺傳學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，臨床診治男性不育時(shí)，精準(zhǔn)補(bǔ)鋅也缺乏依據(jù)[5]。人

SLC39A13基因編碼鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體跨膜蛋白ZIP13[6]位于11號(hào)染色體p112，共有21個(gè)轉(zhuǎn)錄本，已知其表達(dá)水平與精子活力密切相關(guān)。通過對(duì)66例樣本的測序分析及精液質(zhì)量檢測，初步發(fā)現(xiàn)ZIP13 基因rs755555位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與精子活力高度關(guān)聯(lián)，但對(duì)于該結(jié)果仍需要擴(kuò)大樣本量，并采用高可靠度的SNP檢測技術(shù)進(jìn)一步加以確認(rèn)。

單核苷酸多態(tài)性是指同一物種同一基因不同個(gè)體之間或不同亞型之間在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸不同所引起的DNA序列多態(tài)性[7-9]，該生物個(gè)體內(nèi)全部細(xì)胞的基因型相同，所以基因型具有可遺傳性，可以穩(wěn)定傳遞給下一代。該類生物在基因分型時(shí)，只有野生型、突變性、雜合型3種類型。在醫(yī)學(xué)上，不同SNP基因型的人群對(duì)于某種疾病的易感程度是有差別的[10]，所以SNP分型研究具有重要的醫(yī)學(xué)意義，是精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)[11]。目前，中國市場用于進(jìn)行基因檢測的技術(shù)主要包括全基因組測序技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。其中熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、普及度高、檢測時(shí)間短和成本低等優(yōu)勢[12-13]，在目前臨床分子診斷技術(shù)中應(yīng)用最為成熟。

ARMS-PCR（amplification refractory mutation system PCR）即擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR，通過引物3’末端引物設(shè)計(jì)控制等位基因特異性延伸，并結(jié)合Taqman探針的方法檢測熒光信號(hào)值，從而判斷野生型等位基因和突變型等位基因[14-15]。本研究采用ARMS-PCR和熒光定量PCR技術(shù)，以提高檢測靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性為目標(biāo)，設(shè)計(jì)、優(yōu)化引物探針組合，優(yōu)化檢測試劑的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體跨膜蛋白相關(guān)基因SLC39A13核苷酸多態(tài)性檢測方法，為研發(fā) SLC39A13 基因rs755555位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測試劑盒提供技術(shù)基礎(chǔ)。目前，SLC39A13基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法研究還屬空白，因此，本研究具有較好的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

質(zhì)粒小提中量試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司提供；DNA提取試劑盒，簡石生物技術(shù)（北京）有限公司提供；探針法qPCR試劑盒，含UDG（PerfectStart Probe qPCR SuperMix UDG），北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；pfu聚合酶、dNTPs及其他PCR反應(yīng)試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；SpectraMax QuickDrop超微量分光光度計(jì)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Quantstudio DX提供；DYY-6C電泳儀，北京市六一廠提供；PCR擴(kuò)增儀，T100TMThermal Cycler；2×PerfectStar Ⅱ Probe qPCR SuperMix UDG，引物由金唯智生物公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

本次實(shí)驗(yàn)所需要的全血樣本，由河北省生殖健康研究院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物和探針的設(shè)計(jì)

ARMS-PCR檢測方法是利用Taq DNA聚合酶（來自Thermus aquaticus）的擴(kuò)增特性來完成靶標(biāo)突變位點(diǎn)的檢測。Taq DNA聚合酶在擴(kuò)增過程中缺乏3’－ 5’外切酶活性，因此采用等位基因特異的2條上游引物，兩者在3’端核苷酸不同，一個(gè)對(duì)野生型等位基因特異，另一個(gè)對(duì)突變型等位基因特異。下游引物采用通用引物，在Taq DNA聚合酶作用下，與模板不完全匹配的上游引物將不能退火，不能生成PCR產(chǎn)物，而與模板匹配的引物體系則可擴(kuò)增出產(chǎn)物。ARMS-PCR需要設(shè)計(jì)Taqman探針，探針分別連有2種不同的熒光染料，5’端為熒光基團(tuán)，3’端連有通用的熒光淬滅基團(tuán)。在靶基因擴(kuò)增過程中，PCR引物和熒光標(biāo)記探針在退火時(shí)均會(huì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合，Taq酶在延伸模板鏈延伸時(shí)遇到與模板穩(wěn)定結(jié)合的探針，Taq酶的5’—3’外切核酸酶會(huì)將與模板結(jié)合的特異性探針降解，從而使探針上的熒光基團(tuán)因?yàn)槲锢砜臻g分離，淬滅效應(yīng)消失，發(fā)出熒光，而不能順利擴(kuò)增的則沒有熒光，因此，通過熒光定量PCR的Ct值的差異，確定SNP基因型。針對(duì)SLC39A13基因的rs755555位點(diǎn)，本研究野生基因型為CC，因此上游引物3’端為C；突變型基因型為TT，所以上游引物3’端為T；雜合型基因型為CT，2條引物均可擴(kuò)增，只是擴(kuò)增強(qiáng)度均減弱。根據(jù)上述原理，設(shè)計(jì)系列引物及探針，如表1所示。

1.3.2 DNA提取

DNA提取參考DNA提取試劑盒說明書。提取的核酸使用SpectraMax QuickDrop超微量分光光度計(jì)測定DNA的含量，于-20 ℃保存。

1.3.3 陽性對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建

以河北省生殖健康研究院提供的人類基因組DNA作為模板，分別擴(kuò)增 SLC39A13基因突變型、 SLC39A13 基因野生型，與擴(kuò)增的內(nèi)參基因PPIA融合，融合片段分別T克隆，獲得轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗(yàn)證，獲得野生型和突變型基因克隆陽性轉(zhuǎn)化子，提交測序，將測序正確的野生型對(duì)照質(zhì)粒和突變型對(duì)照質(zhì)粒冷凍保存，備用。將已經(jīng)構(gòu)建好的野生型和突變型質(zhì)粒等比例混合，獲得雜合基因型對(duì)照質(zhì)粒。

1.3.4 Taqman熒光ARMS-PCR反應(yīng)體系

每個(gè)檢測樣的ARMS-PCR反應(yīng)體系試劑配比如表2所示，其中DNA模板分別為SLC39A13野生型人工合成質(zhì)粒、SLC39A13突變型人工合成質(zhì)粒以及雜合質(zhì)粒和人類基因組DNA。采用表1中的引物和探針，依據(jù)實(shí)驗(yàn)不同進(jìn)行組合，每例DNA模板同時(shí)在野生反應(yīng)液和突變反應(yīng)液中分別進(jìn)行擴(kuò)增，DNA聚合酶采用2×PerfectStart Ⅱ Probe qPCR SuperMix UDG。首先，混合配制野生型反應(yīng)液的引物、探針，以及酶和突變型反應(yīng)液的引物、探針，配制體積為全部樣品所需的總量；然后，分裝到PCR管中，分別加入各個(gè)模板樣品。

1.3.5 Taqman熒光ARMS-PCR反應(yīng)條件

本研究使用儀器為Quantstudio DX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，配套使用軟件為Quant StudioTM Test Development Software v1.0.1 ，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)包括3個(gè)主要步驟，具體條件見表3。

1.3.6 檢測結(jié)果的判讀及分型

Ct值即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值線對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。若計(jì)算數(shù)值大于3，則該樣品為野生型；若計(jì)算數(shù)值小于-3，則該樣品為突變型；若計(jì)算數(shù)值小于3大于-3，則該樣品為雜合型。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 以基因分型準(zhǔn)確度為指標(biāo)確定引物探針組合

以制備的陽性對(duì)照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時(shí)選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例（基因組質(zhì)量濃度稀釋至10～15 ng/μL）樣品進(jìn)行檢測。將表1中野生型上游引物與共用下游引物和探針以及內(nèi)標(biāo)上下游引物和探針一一進(jìn)行組合，共16組，按照表2的體系分別配制野生型反應(yīng)液和突變型反應(yīng)液，引物探針加量0.2 μL。按照表3的反應(yīng)條件設(shè)置PCR儀進(jìn)行檢測，依據(jù)“1.3.6”所述判定方法進(jìn)行計(jì)算及判定分型結(jié)果，以分型準(zhǔn)確性為依據(jù)進(jìn)行優(yōu)選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1和表4。

表4結(jié)果顯示：有9組引物探針組合檢測不準(zhǔn)確（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略）；有6組引物探針組合雖然各樣品基因分型準(zhǔn)確，但其中有3組陰性對(duì)照的突變擴(kuò)增體系的Ct值介于36～38之間（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略）；有3組引物探針組合的個(gè)別Ct差值接近安全區(qū)間邊緣（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略）；有1組引物探針組合檢測分型準(zhǔn)確、Ct差值在安全區(qū)間內(nèi)且陰性對(duì)照的Ct值大于38。得到野生型最優(yōu)引物探針組合為WF1、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5，突變型最優(yōu)引物探針組合為FMF3、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5。

2.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 引物及探針濃度優(yōu)化

以制備的陽性對(duì)照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時(shí)選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例（基因組質(zhì)量濃度稀釋至10～15 ng/μL）進(jìn)行檢測，使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針組合。引物及探針濃度的優(yōu)化方案一：引物及探針加量為0.2 μL，模板加量為2 μL，其他加量見表2；優(yōu)化方案二：引物及探針加量為0.1 μL，模板加量為2 μL，其他加量見表2。使用“1.3.6”所述方法進(jìn)行計(jì)算及基因分型判定。方案一的分型結(jié)果雖然都準(zhǔn)確（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略），但陰性對(duì)照的突變反應(yīng)液Ct值為38.21，小于方案二，可能是因?yàn)橐锾结槤舛雀?，引物和探針之間存在的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等造成了非特異擴(kuò)增。為了減少對(duì)檢測結(jié)果的干擾，也為了減少檢測試劑用量，降低檢測成本，所以采用方案二，即在PCR反應(yīng)體系中引物及探針加量為0.1 μL更優(yōu)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表5，其擴(kuò)增曲線見圖2。

2.2.2 基因組加樣量優(yōu)化

以制備的陽性對(duì)照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時(shí)選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例（基因組濃度稀釋至10～15 ng/μL）進(jìn)行檢測，使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針組合。優(yōu)化方案一：引物及探針加量為0.1 μL，模板加量為2 μL，其他加量見表2；優(yōu)化方案二：引物及探針加量為0.1 μL，模板加量為4 μL，其他加量見表2。使用“1.3.6”所述方法進(jìn)行判定。方案一檢測結(jié)果，每個(gè)樣的3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，有個(gè)別樣出現(xiàn)沒有擴(kuò)增現(xiàn)象，造成分型不準(zhǔn)。分析原因可能是由于模板加樣量過少，容易造成取樣量不足；而方案二增加了模板加入量，避免了這種操作誤差，所有檢測結(jié)果都分型準(zhǔn)確?？梢?，方案二模板加樣量4 μL更優(yōu)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表6，擴(kuò)增曲線見圖3。

2.3 檢測方法的靈敏度研究

為給開發(fā)試劑盒提供數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了該檢測方法的靈敏度。使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針進(jìn)行熒光定量PCR，PCR體系為“2.2”優(yōu)化后的體系。以制備的陽性對(duì)照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時(shí)選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例，同一基因組選用稀釋到5、10～15 ng/μL以及基因組原濃度3種溶液同時(shí)進(jìn)行檢測，用“1.3.6”所述方法進(jìn)行判定。由分型準(zhǔn)確性可知，3種質(zhì)量濃度的溶液均可分型準(zhǔn)確，說明該方法對(duì)模板濃度的要求不苛刻，對(duì)于基因組提取條件及質(zhì)量要求更寬泛，適應(yīng)性更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示稀釋到10～15 ng/μL的結(jié)果最佳。靈敏度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表7，擴(kuò)增曲線見圖4。

2.4 PCR引物探針組合、檢測體系及檢測條件可行性研究

通過檢測大量不同基因組樣品，檢驗(yàn)該P(yáng)CR檢測體系及檢測條件的可行性。使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針，PCR體系為“2.2”優(yōu)化后的體系，進(jìn)行熒光定量PCR。首先，選用10例基因組測序樣品進(jìn)行SNP檢測，分型結(jié)果相符率達(dá)100%，見圖5。此外，選用70個(gè)已采用質(zhì)譜法SNP檢測的樣品（質(zhì)譜法實(shí)驗(yàn)由河北省生殖健康研究院完成），采用上述最優(yōu)條件及方法進(jìn)行SNP檢測，對(duì)其分型結(jié)果與質(zhì)譜法結(jié)果相比較可知，分型結(jié)果相符率達(dá)100%[7]，統(tǒng)計(jì)基因型數(shù)據(jù)見表8。通過大量樣品檢測，證明了該檢測方法的穩(wěn)定性和可行性，表明其有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的價(jià)值。

3 結(jié) 語

1）不孕不育癥發(fā)病率持續(xù)上升，其中男性不育主要與精子質(zhì)量有關(guān)，而鋅作為人體必需的微量元素，對(duì)于保持精子活力是至關(guān)重要的[16]。鋅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，是鋅參與各類生理活動(dòng)的重要環(huán)節(jié)。已有研究表明，鋅離子跨膜運(yùn)輸需要鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助[17-19]，包括

SLC30A家族（ZNT）和SLC39A家族（ZIP）。圍繞著這2個(gè)家族已經(jīng)有大量研究。其中，人的SLC39A13基因編碼鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體跨膜蛋白，是ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的LIV-1亞家族的一個(gè)成員，SLC39A13基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）影響了鋅轉(zhuǎn)運(yùn)的強(qiáng)弱，進(jìn)而影響了男性的精子質(zhì)量。

2）本研究基于ARMS-PCR技術(shù)建立了鋅轉(zhuǎn)運(yùn)基因核酸多態(tài)性分析方法，與其他檢測技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于成本低、操作方便、穩(wěn)定性好、閉管操作，降低了交叉污染風(fēng)險(xiǎn)（每一個(gè)位點(diǎn)：3條引物、1條探針；對(duì)于MGB-PCR方法需要2條引物、2個(gè)探針，探針成本高）。此外，采用融合PCR制備各檢測位點(diǎn)基因與內(nèi)標(biāo)基因融合的陽性對(duì)照品，簡化了試劑配制操作，降低了檢測信噪比。該方法在目前的文獻(xiàn)和專利中未見報(bào)道。

3）本研究以提高檢測靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性為目標(biāo)，分別設(shè)計(jì)、評(píng)估和優(yōu)選了SLC39A13基因rs755555位點(diǎn)及內(nèi)參基因PPIA的檢測引物和探針。通過優(yōu)化引物、探針和模板加量，提高了檢測的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，降低了試劑成本。

4）通過檢測大量樣品，檢驗(yàn)了方法的穩(wěn)定性和可行性，為研發(fā)SLC39A13 基因rs755555位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

開發(fā)SLC39A13基因rs755555位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒，可為診斷和治療男性不育癥精準(zhǔn)用藥提供一種檢測手段和工具。

5）未來擬進(jìn)一步建立高效的篩選評(píng)價(jià)體系，完成靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、特異性、重復(fù)性和貨架期穩(wěn)定性等性能指標(biāo)的驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)/References：

[1] LUDMILA O，MAXIM K，ALEXANDER O.Effects of cigarette smoking on semen quality，reproductive hormone levels，metabolicprofile，zinc and sperm DNA fragmentation in men：Results from a population-based study[J].Frontiers in Endocrinology，2023. DOI：10.3389/fendo.2023.1255304.

[2] 張琴，蘇占營，吳成亮.嚴(yán)重少弱精子癥患者血液和精液中微量元素含量分析及相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2023，39（20）：3459-3462.

ZHANG Qin，SU Zhanying，WU Chengliang.Correlation of trace elements in blood and semen of patients with severe oligozoospermia[J].Journal of Modern Medicine & Health，2023，39（20）：3459-3462.

[3] 李秀秀，周黎明，史海躍，等.精漿中重金屬元素含量對(duì)精液常規(guī)參數(shù)的影響[J].浙江醫(yī)學(xué)，2023，45（6）：572-576.

LI Xiuxiu，ZHOU Liming，SHI Haiyue，et al.Relationship between heavy metal contents in seminal plasma and routine parameters of semen[J].Zhejiang Medical Journal，2023，45（6）：572-576.

[4] VASSAL M，PEREIRA C D，MARTINS F，et al.Different strategies to attenuate the toxic effects of zinc oxide nanoparticles on spermatogonia cells[J].Nanomaterials，2022. DOI： 10.3390/NANO12203561.

[5] AKBARI H，ELYASI L，KHALEGHI A A，et al.The effect of zinc supplementation on improving sperm parameters in infertile diabetic men[J].Journal of Obstetrics and Gynaecology of India，2023，73（4）：316-321.

[6] CHENG Xinxin，WANG Jie，LIU Chunling，et al.Zinc transporter SLC39A13/ZIP13 facilitates the metastasis of human ovarian cancer cells via activating Src/FAK signaling pathway[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2021. DOI： 10.1186/S13046-021-01999-3.

[7] 李逸豪，石冰潔，馮婭茹，等.AS-PCR法檢測CLU基因SNP位點(diǎn)方法的建立[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2019，23（12）：2163-2169.

LI Yihao，SHI Bingjie，F(xiàn)ENG Yaru，et al.Establishment of AS-PCR method for detecting SNP locus of CLU gene[J].Chinese Journal of Laboratory Diagnosis，2019，23（12）：2163-2169.

[8] 馬成鳳，李帆，吳曦，等.雄激素代謝相關(guān)基因AKR1C3、SHBG、SRD5A2單核苷酸多態(tài)性與指長比的相關(guān)性[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，45（10）：994-1001.

MA Chengfeng，LI Fan，WU Xi，et al.Correlation between single nucleotide polymorphisms of androgen metabolism-related genes AKR1C3，SHBG，SRD5A2 and digit ratio[J].Journal of Ningxia Medical University，2023，45（10）：994-1001.

[9] CHENG Chen，LI Shuzhen，WANG Boshi，et al.CATS derived SNPs discovery in the golden snub-nosed monkey （Rhinopithecus roxellanae）[J].Conservation Genetics Resources，2014，6：1-3.

[10]HANNEMANN J，RENDANT-GANTZBERG L，ZUMMACK J，et al.Single nucleotide polymorphisms in the arginase 1 and 2 genes are differentially associated with circulating l-Arginine concentration in unsupplemented and l-Arginine–supplemented adultss[J].The Journal of Nutrition，2021，151（4）：763-771.

[11]沈影，夏霽，韓鳳娟.基因單核苷酸多態(tài)性在卵巢癌精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用探析[J].中南藥學(xué)，2020，18（4）：627-629.

SHEN Ying，XIA Ji，HAN Fengjuan.Single nucleotide polymorphism in the precise treatment of ovarian cancer[J].Central South Pharmacy，2020，18（4）：627-629.

[12]謝秀菊，夏啟玉，劉帥，等.數(shù)字PCR和熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因番木瓜中外源基因拷貝數(shù)方法的建立及其應(yīng)用[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2024，45（4）：663-673.

XIE Xiuju，XIA Qiyu，LIU Shuai，et al.Establishment and application of digital PCR and fluorescence quantitative PCR for detection of the copy numbers of exogenous gene in transgenic papaya[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2024，45（4）：663-673.

[13]FILGUEIRA C P B，MOREIRA O C，CANTANHDE L M，et al.Comparison and clinical validation of qPCR assays targeting Leishmania 18S rDNA and HSP70 genes in patients with American Tegumentary Leishmaniasis[J].PLoS Neglected Tropical Diseases，2020.DOI： 10.1371/journal.pntd.0008750.

[14]VERENA P，ANTOINE S，REBECCA R L，et al.A novel tetra-primer ARMS-PCR approach for the molecular karyotyping of chromosomal inversion 2Ru in the main malaria vectors Anopheles gambiae and Anopheles coluzzii[J].Parasites & Vectors，2023. DOI： 10.1186/S13071-023-06014-6.

[15]YANG Hao，YANG Sen，XIA Xuhan，et al.Sensitive detection of a Single-Nucleotide polymorphism in foodborne pathogens using CRISPR/Cas12a-Signaling ARMS-PCR[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2022，70（27）：8451-8457.

[16]溫馨.鋅介導(dǎo)鋅敏感受體GPR39調(diào)節(jié)精子活力的機(jī)制研究[D].唐山：華北理工大學(xué)，2022.

WEN Xin.Mechanism of Zinc-mediated Regulation of Sperm Motility by Zinc-sensitive Receptor GPR39[D].Tangshan：North China University of Science and Technology，2022.

[17]辛儲(chǔ)林，陳名陽，胡亞榮，等.鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-9抑制高脂食物誘導(dǎo)小鼠前列腺炎的機(jī)制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2024，26（3）：8-13.

XIN Chulin，CHEN Mingyang，HU Yarong，et al.Zinc transporter 9 inhibiting prostatitis induced by high-fat food in mice[J].Modern Medicine Journal of China，2024，26（3）：8-13.

[18]臧杰，高明，虞武斌，等.鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用及機(jī)制研究[J].浙江創(chuàng)傷外科，2024，29（1）：1-6.

ZANG Jie，GAO Ming，YU Wubin，et al.Analysis of the regulatory role and mechanism of ZIP4 in the occurrence and development of breast cancer[J].Zhejiang Journal of Traumatic Surgery，2024，29（1）：1-6.

[19]MORI H，GOJI A，HARA M.Upregulation of intracellular Zinc ion level after differentiation of the neural stem/progenitor cells in vitro with the changes in gene expression of Zinc transporters[J].Biological Trace Element Research，2024.DOI：10.1007/s12011-023-04033-z.