摘要 ［目的］研究不同加工過(guò)程桶子雞所攜帶的微生物多樣性及菌落組成。［方法］采用PacBio三代全長(zhǎng)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)桶子雞樣本所攜帶細(xì)菌的16S rRNA的V1-V9區(qū)進(jìn)行測(cè)序后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。［結(jié)果］共獲得67 287條有效序列，2 300個(gè)OTU數(shù)目，不同加工環(huán)節(jié)的桶子雞中細(xì)菌群落存在差異。在門水平上，共獲得15個(gè)細(xì)菌門，優(yōu)勢(shì)菌主要為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、疣微菌門（Verrucomicrobia）；在屬水平上，共獲得250個(gè)細(xì)菌屬，優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、Janthinobacterium、黃桿菌屬（Flavobacterium）、希萬(wàn)氏菌屬（Shewanella）、Kaistella、冷桿菌屬（Psychrobacter）；在種水平上，共獲得621個(gè)細(xì)菌種，優(yōu)勢(shì)菌種為Sediminibacterium magnilacihabitans、慢生根瘤菌sp011516665、Bradyrhizobium sp011516665、Pseudomonas fragi、干酪巨球菌（Macrococcus caseolyticus）、希瓦氏菌（Shewanella baltica）等。［結(jié)論］同一加工環(huán)境中獲得的老湯復(fù)煮桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯3個(gè)樣本中攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群組成存在一定相似性，但相對(duì)豐度存在一定差異。生鮮雞及另一加工場(chǎng)所制作的剛出鍋桶子雞的優(yōu)勢(shì)菌組成與其他樣本有很大差異。

關(guān)鍵詞 桶子雞;細(xì)菌;16S rRNA;三代全長(zhǎng);高通量測(cè)序;微生物多樣性

中圖分類號(hào) TS 251.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）20-0148-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.037

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

High-Throughput Sequencing Analysis_{mqNTATb0YdfQTXiPGGpCj2e6+zk3dpHe0VZScsZqX50=} by 16S rRNA of Bacterial Diversity in Bucket Chicken

XU Yan-yan，DONG Yu

（Kaifeng Center for Food and Drug Quality and Safety，Kaifeng，Henan 475000）

Abstract ［Objective］To study the microbial diversity and the microbial community composition of bucket chicken at different processing.［Method］The V1-V9 region of 16S rRNA of the bacteria in the bucket chicken samples were sequenced by the PacBio full-length high-throughput sequencing technology.［Result］The 67 287 effective sequences and 2 300 OTU were obtained.There were some differences in the bacterial communities of the bucket chicken in different processing stages.A total of 15 bacterial phylum were obtained and the dominant bacteria are Proteobacteria，Bacteroidetes and Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes，Deinococcus-Thermus，Verrucomicrobia;at the genus level，a total of 250 bacterial genus were obtained，the dominant bacteria genus were Pseudomonas，Acinetobacter，Staphylococcus，Brochothrix，Mesorhizobium，Janthinobact erium，F(xiàn)lavobacterium，Shewanella，Kaistella，Psychrobacter;at the species level，a total of 621 bacterial species were obtained，and the dominant species were Sediminibacterium magnilacihabitans，Bradyrhizobium sp 011516665，Pseudomonas fragi，Macrococcus caseolyticus，Shewanella baltica.［Conclusion］The microbial communities in the three samples of recooked bucket chicken，12-hour bucket chicken and soup obtained in the same processing environment were similar，but there are some differences in relative abundance.The dominant bacterial composition of fresh bucket chicken produced at another processing site and fresh chicken was different from other samples.

Key words Bucket chicken;Bacterium;16S rRNA;Full-length;High-throughput sequencing;Microbial diversity

桶子雞是古都開(kāi)封的一道特色名菜，是我國(guó)傳統(tǒng)鹵禽肉制品的典型代表，因其形似圓桶而得名。桶子雞顏色鮮黃，口感咸香嫩脆，肥而不膩，越嚼越香，通常現(xiàn)做現(xiàn)食，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)［1］。雞肉本身富含蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分，水分活度較高，雖然桶子雞在煮制過(guò)程中采用高濃度鹽鹵，但煮制溫度較低，僅能殺死耐熱性較低的腐敗菌及致病菌的營(yíng)養(yǎng)體，而芽孢和耐熱性微生物仍可存在。在產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中，當(dāng)條件適宜時(shí)，極易因微生物的大量增殖而導(dǎo)致產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，因此常溫下其貨架期較短，貨架期問(wèn)題成為制約其跨地域發(fā)展的重要因素。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)熟肉制品GB 2726—2016中對(duì)熟肉制品的菌落總數(shù)、大腸菌群及致病菌等有明確的限量規(guī)定。劉欣等［2］（2019年）利用抗菌肽（乳酸鏈球菌素）對(duì)桶子雞的保鮮效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明，不同溫度下貯藏的桶子雞隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)、pH、TVB-N值、TBA值等指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)，可通過(guò)抑制桶子雞中微生物的繁殖進(jìn)而延長(zhǎng)桶子雞的貯藏時(shí)間。因此，桶子雞加工過(guò)程中細(xì)菌多樣性的研究對(duì)于從源頭把控細(xì)菌污染、繁殖及延長(zhǎng)桶子雞貨架期，進(jìn)而保障桶子雞的食品安全具有一定的理論指導(dǎo)意義。

高通量測(cè)序技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)可測(cè)序大量核酸分子，不僅可檢測(cè)出普通微生物還能檢測(cè)出不易培養(yǎng)、豐度低和一些難以分離的微生物［3-4］，能夠更好地解釋微生物菌群的組成和多樣性，具有檢測(cè)快速、通量高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［5］。二代、三代高通量測(cè)序技術(shù)被應(yīng)用于食品領(lǐng)域，其研究對(duì)象包括肉制品、水產(chǎn)品及發(fā)酵類食品。16S rRNA普遍存在于原核生物中，共有10個(gè)保守區(qū)和9個(gè)高可變區(qū)，因此兼具特異性和保守性的16S rRNA被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌高通量測(cè)序研究?；陔娦盘?hào)而不是光信號(hào)的三代高通量測(cè)序技術(shù)采用的是納米孔單分子技術(shù)，不需要 PCR 擴(kuò)增，測(cè)序讀長(zhǎng)比一代、二代測(cè)序技術(shù)長(zhǎng)［6］。通過(guò)多重比對(duì)方法獲取環(huán)形一致序列（circular consensus sequence，CCS）彌補(bǔ)了自身容易出現(xiàn)單個(gè)堿基錯(cuò)誤的缺陷，將其錯(cuò)誤率降低至可接受的范圍內(nèi)，選擇99%的相似度作為預(yù)聚類閾值可以排除錯(cuò)誤堿基的影響［7］。因三代測(cè)序技術(shù)可以覆蓋16S rRNA的9個(gè)高變區(qū)域，避免了僅選取V4、V3-V4、V4-V5、V1-V3、V3和V4-V6單個(gè)或多個(gè)可變區(qū)分段擴(kuò)增所帶來(lái)的局限性?；赟MRT測(cè)序技術(shù)的微生物16S rRNA基因全長(zhǎng)測(cè)序可以有效提高環(huán)境微生物研究的分辨率［8］，將更多微生物注釋到種水平，并提高物種豐度預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

目前，國(guó)內(nèi)外利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)桶子雞加工過(guò)程中細(xì)菌多樣性的研究較為少見(jiàn)。筆者利用三代全長(zhǎng)高通量測(cè)序技術(shù)分析不同加工環(huán)節(jié)中桶子雞所攜帶的細(xì)菌菌群組成情況，為后期生產(chǎn)加工中關(guān)鍵控制點(diǎn)的制訂，選擇有針對(duì)性的抑菌防腐劑，進(jìn)而延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品。桶子雞的制作選用生長(zhǎng)期1～3年的健康母雞，經(jīng)開(kāi)小口取內(nèi)臟、老湯浸煮等傳統(tǒng)工藝制作而成。為研究不同加工環(huán)節(jié)中桶子雞表面菌群多樣性，選取5個(gè)代表性樣本。剛出鍋桶子雞來(lái)源于河南省開(kāi)封某地區(qū)某桶子雞熟食店，為0號(hào)樣本，老湯復(fù)煮5 min桶子雞為1號(hào)樣本，于加工場(chǎng)所冷庫(kù)內(nèi)放置12 h桶子雞為2號(hào)樣本，煮制桶子雞專用老湯為3號(hào)樣本，用于加工桶子雞的冷鮮雞為4號(hào)樣本，4個(gè)樣本均來(lái)源于河南省開(kāi)封某地區(qū)某桶子雞加工廠，其中老湯復(fù)煮5 min桶子雞為研究專用樣本。

1.1.2 試劑。DNA抽提試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek公司）；瓊脂糖（法國(guó)Biowest公司）；PCR試劑盒（北京TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase）；凝膠回收試劑盒（美國(guó)Axygen）；建庫(kù)試劑盒（美國(guó)Pacific Biosciences）。

1.1.3 儀器。微量冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo）；臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo）；磁力架（美國(guó)Invitrogen）；蛋白電泳儀（美國(guó) Bio-Rad）；超聲波核酸打斷儀（美國(guó) Covaris）；凝膠成像儀（中國(guó)Tanon）；核酸電泳儀（中國(guó)Tanon）;PCR儀（美國(guó)ABI GeneAmp 9700型）；測(cè)序儀（美國(guó)Pacific Biosciences）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理。于某桶子雞熟食店選取剛出鍋桶子雞（0號(hào)樣本），于某桶子雞加工廠選取冷庫(kù)放置12 h桶子雞（2號(hào)樣本），冷庫(kù)放置12 h桶子雞再經(jīng)老湯復(fù)煮5 min后制得老湯復(fù)煮桶子雞（1號(hào)樣本），制作桶子雞的冷鮮雞（4號(hào)樣本）數(shù)只，分別用無(wú)菌棉簽擦拭其表面，后用無(wú)菌棉簽蘸取適量制作桶子雞的老湯（3號(hào)樣本），共5個(gè)樣本分別置于無(wú)菌袋中常溫運(yùn)輸，于4 ℃保存。

1.2.2 樣品DNA的提取和擴(kuò)增子的制備。 參照E.Z.N.A. Soil DNA Kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.） 試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取5個(gè)樣本中的微生物組總DNA。采用16S rRNA全長(zhǎng)通用引物，27F（上游引物） 5′-barcode-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）-3′和1492R（下游引物） 5′-CRGYTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本的擴(kuò)增引物含有8堿基標(biāo)簽序列，用以區(qū)分樣本。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL∶4.0 μL的5×FastPfu Buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，上、下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，以及10 ng模板 DNA。 PCR擴(kuò)增試驗(yàn)程序如下：95 ℃下進(jìn)行5 min;在95 ℃下進(jìn)行30 s，在58 ℃下進(jìn)行30 s，在72 ℃下進(jìn)行45 s，上述步驟進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃保持10 min，臨用前置于10 ℃。每個(gè)樣本3次重復(fù)，后將同一樣本的3個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris HCl洗脫;后采用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.） 試劑盒參照說(shuō)明書(shū)操作流程進(jìn)行純化。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.3 測(cè)序和數(shù)據(jù)處理。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)（Pacific Biosciences）從擴(kuò)增的DNA中制備SMRTbell文庫(kù)。將每個(gè)樣本連接特定的barcode序列后等質(zhì)量混合，擴(kuò)增子混合物使用Pacific Biosciences SMRTbellTM Template Prep kit 1.0試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并在PacBio Sequel Ⅱ上進(jìn)行測(cè)序。所有擴(kuò)增子測(cè)序均由上海凌恩生物科技有限公司（中國(guó)上海）承擔(dān)。

獲取環(huán)形一致性序列（CCS reads）及OTU聚類分析：使用SMRT Link Analysis軟件V9版處理PacBio原始序列reads，以獲得環(huán)形一致性序列：參數(shù)設(shè)置最小通過(guò)次數(shù)為3，最小預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)到99%。使用UPARSE（7.1版，http：//drive5.com/uparse/）將OTU按照98.65%的相似性閾值聚類［9］，并使用UCHIME鑒定并去除嵌合序列。

采用uclust algorithm（v1.2.22q版本），置信度閾值為0.8，對(duì)OTU代表序列按照domain（域）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）共7個(gè)分類水平進(jìn)行分類，進(jìn)而分析各樣本的細(xì)菌群落組成，比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（Release138.1 http：//www.arb-silva.de），分析桶子雞不同加工環(huán)節(jié)中細(xì)菌的群落組成?；贛othur版本v.1.35.1［10］軟件進(jìn)行的稀釋曲線分析，以揭示Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao、Richness、Simpson和Shannon多樣性指數(shù)。Beta多樣性分析使用主成分分析PCA［11］比較群落差異，主要分析軟件為R版本3.6.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 將樣本測(cè)序后所得細(xì)菌群落的原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，去除不合格的序列后，5個(gè)樣本的有效序列主要集中在1 301～1 500 bp，共67 287條，占全部序列的98.47%，大于1 500 bp的非有效序列占全部序列的1.5%。不同加工環(huán)節(jié)桶子雞的微生物群落有效序列有較大差異。有效序列見(jiàn)表1。

2.2 OTU聚類分析 通過(guò)UPARSE軟件對(duì)5個(gè)樣本的序列進(jìn)行歸類操作（cluster）及聚類分析，將全長(zhǎng)序列相似水平達(dá)到98.65%歸為一個(gè)操作分類單元（OTU），對(duì)所得的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，共獲得2 300個(gè)OTU，其中放置12 h 桶子雞中獲得的OTU數(shù)量最多，為741個(gè)，老湯中獲得的OTU數(shù)最少，為443個(gè)。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用uclust算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，分別在各個(gè)分類水平：domain（域），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，通過(guò)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（Release138.1 http：//www.arb-silva.de）進(jìn)行比對(duì)。由圖1可知，5個(gè)樣本的稀釋曲線均呈先增加后趨于相對(duì)平穩(wěn)趨勢(shì)，繼續(xù)增大數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生較為少量新的OTU，說(shuō)明5個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量均較為合理，測(cè)序數(shù)據(jù)量能夠?qū)颖局薪^大部分的物種覆蓋［6，12］。

由圖2可知，5個(gè)樣本的Shannon曲線［13］略有差異，但均趨于平坦，說(shuō)明5個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

等級(jí)聚類曲線圖（Rank-abundance）中橫坐標(biāo)的寬度反映物種的豐富性，縱坐標(biāo)的平滑程度代表物種的均勻分布情況。由圖3可知，5個(gè)樣本的等級(jí)聚類曲線均呈較平緩趨勢(shì)，說(shuō)明5個(gè)樣本所帶細(xì)菌種類都較為均勻。冷庫(kù)放置12 h桶子雞在橫軸上的范圍最大，其次是復(fù)煮5 min桶子雞、生鮮雞、老湯及剛出鍋桶子雞，說(shuō)明放置12 h桶子雞中微生物的物種豐度最高，其次是復(fù)煮5 min桶子雞，而老湯和剛出鍋桶子雞的物種豐度均較低。在冷庫(kù)放置12 h桶子雞經(jīng)過(guò)復(fù)煮5 min桶子雞寬度明顯低于放置12 h桶子雞，說(shuō)明老湯煮制可部分降低該樣本中微生物的物種豐度，但復(fù)煮5 min桶子雞的寬度明顯寬于老湯，可見(jiàn)，經(jīng)老湯煮制5 min桶子雞表面的微生物仍具有較高的物種豐度，高鹽的老湯難以將放置12 h 桶子雞表面的微生物殺滅。剛出鍋桶子雞的寬度最低，表明剛出鍋桶子雞的微生物物種豐度最低。

2.3 Alpha 多樣性分析 采用Alpha多樣性分析評(píng)估5個(gè)樣本中細(xì)菌群落的物種豐度和多樣性，其中Chao指數(shù)和Richness指數(shù)用來(lái)反映物種豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映物種多樣性。

由表2可知，放置12 h桶子雞的Chao指數(shù)和Richness指數(shù)均最高，復(fù)煮5 min桶子雞的Chao指數(shù)和Richness指數(shù)處于第2位，剛出鍋桶子雞的Chao指數(shù)和Richness指數(shù)均為最低。放置12 h桶子雞中攜帶的細(xì)菌豐富度最高，所含的物種種類多，這可能是由于放置12 h的桶子雞表面已引入部分外源細(xì)菌。加工桶子雞所用的老湯，其Chao指數(shù)高于生鮮雞，老湯中所含的細(xì)菌種類總數(shù)高于生鮮雞中的物種總數(shù)。桶子雞在加工過(guò)程中采用反復(fù)使用的老湯及煮制過(guò)程中加入的食用鹽、八角、花椒、丁香、蔥和姜等調(diào)味料，使生鮮雞在煮制過(guò)程引入了其他種類的細(xì)菌，導(dǎo)致桶子雞老湯中細(xì)菌物種豐富度指數(shù)升高。

由表2可知，生鮮雞的Shannon指數(shù)最高，達(dá)7.86，而Simpson指數(shù)最低，僅0.010，表明生鮮雞中所攜帶的細(xì)菌群落多樣性最高；老湯的Shannon指數(shù)最低，僅4.85，而Simpson指數(shù)最高，為0.120，表明老湯中的細(xì)菌群落多樣性最低。放置12 h桶子雞的Shannon指數(shù)高于復(fù)煮桶子雞，而其Simpson指數(shù)低于復(fù)煮桶子雞，表明將放置12 h的桶子雞再次放入老湯復(fù)煮會(huì)降低桶子雞表面所攜帶的部分細(xì)菌群落多樣性。剛出鍋桶子雞的Shannon指數(shù)低于生鮮雞，且其Simpson指數(shù)高于生鮮雞，表明剛出鍋桶子雞表面攜帶的細(xì)菌群落多樣性低于生鮮雞，但高于其他3個(gè)樣本，可見(jiàn)不同加工場(chǎng)所，桶子雞表面攜帶的細(xì)菌群落有較大差異。

Coverage值是指測(cè)的序列對(duì)樣本的覆蓋率，其值越高，表明測(cè)出的樣本序列概率越高，可以準(zhǔn)確地反映樣品中微生物多樣性的情況。由表2可知，Coverage值均達(dá)到0.96以上，其中生鮮雞的Coverage值最大，達(dá)0.983 6，而放置12 h桶子雞的Coverage值最小，為0.963 7，表明該測(cè)序結(jié)果基本可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

結(jié)合5個(gè)樣本的 Coverage值、稀釋曲線圖、Shannon曲線圖及等級(jí)聚類曲線圖來(lái)看，該測(cè)序結(jié)果已覆蓋到樣本中絕大多數(shù)微生物，5個(gè)樣本的OTU分類基本能夠真實(shí)反映樣品中微生物的群落多樣性，但各樣本的OTU存在一定差異，表明不同加工環(huán)節(jié)桶子雞細(xì)菌群落存在一定差異。

2.4 細(xì)菌OTU分布 由圖4可知，5個(gè)樣本共有12個(gè)OTU，其中剛出鍋桶子雞獨(dú)有的OTU數(shù)量最多，達(dá)558個(gè)，其次是生鮮雞中獨(dú)有的OTU數(shù)量，為512個(gè)，放置12 h桶子雞獨(dú)有的OTU數(shù)量為362個(gè)，復(fù)煮5 min桶子雞獨(dú)有的OTU數(shù)量為167個(gè)，老湯獨(dú)有的OTU數(shù)量為154個(gè)，表明各樣本之間菌群結(jié)構(gòu)具有明顯差異。

2.5 不同加工環(huán)節(jié)桶子雞中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成 在門水平上，5個(gè)樣本共獲得15個(gè)細(xì)菌門，單個(gè)樣本獲得的細(xì)菌門數(shù)量依次為13、6、6、7、4個(gè)。如圖5所示，在不同加工過(guò)程中，5個(gè)樣本在門水平上優(yōu)勢(shì)菌主要為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中，變形菌門（Proteobacteria）在生鮮雞中相對(duì)豐度最高，達(dá)79.32%，在剛出鍋桶子雞中相對(duì)豐度最低，僅36.98%。擬桿菌門（Bacteroidetes）在剛出鍋桶子雞、復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯中相對(duì)豐度均大于20%，在生鮮雞中相對(duì)豐度最低，僅5.80%。厚壁菌門（Firmicutes）在剛出鍋桶子雞和生鮮雞中均為前2位優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度分別為29.74%和14.75%，而在老湯中未達(dá)到1%，放置12 h桶子雞達(dá)到11.69%，復(fù)煮5 min桶子雞為2.76%，可見(jiàn)放置12 h桶子雞表面存在較多的厚壁菌門，再次放入鍋中復(fù)煮可使表面的厚壁菌門菌群降低。放線菌門（Actinobacteria）在復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯中相對(duì)豐度均高于2%，而在生鮮雞和剛出鍋桶子雞中相對(duì)豐度較低，分別為0.38%和0.07%。可見(jiàn)，不同加工環(huán)境桶子雞表面攜帶的菌群有較大差異。宋相宇等［14］（2020年）在研究白切雞細(xì)菌群落時(shí)，發(fā)現(xiàn)42個(gè)樣品中均存在上述4個(gè)細(xì)菌門，海丹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）也是鴨皮表面主要的細(xì)菌門。異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）在剛出鍋桶子雞和生鮮雞表面未檢出，而在老湯中相對(duì)豐度高于1%，而在放置12 h桶子雞中最低，僅0.21%，在復(fù)煮5 min桶子雞提高到0.48%?？梢?jiàn)，復(fù)煮5 min桶子雞和放置12 h桶子雞中的異常球菌-棲熱菌門可能是老湯中引入的，而剛出鍋桶子雞表面未攜帶異常球菌-棲熱菌門。疣微菌門（Verrucomicrobia）是剛出鍋桶子雞獨(dú)有的，相對(duì)豐度為1.33%。這表明不同加工環(huán)境，桶子雞表面攜帶的菌群有一定差異。

在屬的水平上，5個(gè)樣本共獲得250個(gè)細(xì)菌屬，單個(gè)樣本獲得的細(xì)菌屬數(shù)量依次為155、97、127、119、82和40個(gè)，5個(gè)樣本的物種豐度如圖6所示。由圖6可知，生鮮雞所攜帶的細(xì)菌屬與剛出鍋桶子雞、復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞、老湯的菌屬差異較大，其優(yōu)勢(shì)菌屬按相對(duì)豐度大小依次為假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、Janthinobacterium、黃桿菌屬（Flavobacterium）、希萬(wàn)氏菌屬（Shewanella）、Kaistella、冷桿菌屬（Psychrobacter）。

同一加工場(chǎng)所的3個(gè)樣本復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞、老湯所攜帶的細(xì)菌組成在屬水平上較為接近，但相對(duì)豐度有一定差距，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為土壤桿菌屬（Sediminibacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、甲基病毒古菌屬（Methylovirgula）、希萬(wàn)氏菌屬（Shewanella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、副伯克霍爾德菌屬（Paraburkholderia）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、巨球菌屬（Macrococcus）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、Rhodanobacter、冷桿菌屬（Psychrobacter）、Chitinophaga、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）。

另一加工場(chǎng)所制作的剛出鍋桶子雞所攜帶的細(xì)菌組成在屬水平上與其他桶子雞在菌群組成上有一定差異，其優(yōu)勢(shì)菌屬為巨球菌屬（Macrococcus）、土壤桿菌屬（Sediminibacterium）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Duncaniella、冷桿菌屬（Psychrobacter）、擬桿菌屬（Bacteroides）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、腸球菌屬（Enterococcus）、嗜膽菌（Bilophila）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、甲基卵古菌屬（Methylovirgula）、不動(dòng)桿菌屬 （Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、阿克曼菌（Akkermansia）。

土壤桿菌屬（Sediminibacterium）在剛出鍋桶子雞、復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯中為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為8.17%、32.09%、17.53%、21.52%，而在生鮮雞中相對(duì)豐度僅為0.16%。假單胞菌屬（Pseudomonas）是生鮮雞的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到57.74%，在其他樣本中相對(duì)豐度均低于3%。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）是復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞、老湯的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為19.52%、8.10%、29.17%，而在剛出鍋桶子雞及生鮮雞中相對(duì)豐度僅為3.59%和0.07%。甲基病毒古菌屬（Methylovirgula）是復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞、老湯的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為6.91%、3.28%、9.92%，而在剛出鍋桶子雞中相對(duì)豐度較低，僅為1.76%，在生鮮雞中未檢出。希萬(wàn)氏菌屬（Shewanella）是放置12 h桶子雞的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到15.15%，在復(fù)煮5 min桶子雞中相對(duì)豐度僅為0.33%，在老湯中相對(duì)豐度為0.40%，在剛出鍋桶子雞中未檢出。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）是生鮮雞的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到8.46%，在剛出鍋桶子雞、復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯中相對(duì)豐度較低，分別為1.50%、2.21%、3.78%和0.69%。副伯克霍爾德菌屬（Paraburkholderia）是老湯的是優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到10.12%，在剛出鍋桶子雞、復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和生鮮雞中相對(duì)豐度較低，分別為0.38%、2.07%、2.76%和0.02%。可推測(cè)采用老湯煮制可引入副伯克霍爾德菌屬。中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）在5個(gè)樣本中均有檢出，相對(duì)豐度差異不大，在1.95%～4.11%。巨球菌屬（Macrococcus）是剛出鍋桶子雞獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到14.42%，而在其他4個(gè)樣本中其相對(duì)豐度均僅0.03%。分枝桿菌屬（Mycobacterium）在復(fù)煮5 min桶子雞和老湯中的相對(duì)豐度為7.60%和3.85%，而在放置12 h桶子雞中相對(duì)豐度較低，僅2.19%，在剛出鍋桶子雞中相對(duì)豐度僅為0.07%，而在生鮮雞中未檢出。

在種的水平上，5個(gè)樣本共獲得621個(gè)細(xì)菌種，單個(gè)樣本獲得的細(xì)菌種數(shù)量依次為273、210、285、174和148個(gè)。由圖7可知，相同加工環(huán)境中獲得的復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯3個(gè)樣本中攜帶的優(yōu)勢(shì)菌種存在一定相似性，但相對(duì)豐度存在一定差異，與另一加工場(chǎng)所制作的剛出鍋桶子雞及生鮮雞的優(yōu)勢(shì)菌種組成有較大差異。Sediminibacterium magnilacihabitans菌由LPSN原核生物標(biāo)準(zhǔn)命名列表（https：//www.bacterio.net/）中查詢顯示，是一種需氧、中溫（28 ℃最適）、革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌。Sediminibacterium magnilacihabitans在4個(gè)樣本中均為優(yōu)勢(shì)菌種，同一加工場(chǎng)所的復(fù)煮5 min桶子雞、放置12 h桶子雞和老湯中均存在大量Sediminibacterium magnilacihabitans，冷庫(kù)中放置12 h的桶子雞表面攜帶的Sediminibacterium magnilacihabitans相對(duì)豐度低于復(fù)煮5 min和老湯，可推測(cè)低溫環(huán)境及其他細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，導(dǎo)致Sediminibacterium magnilacihabitans的豐度降低。慢生根瘤菌sp011516665 （Bradyrhizobium sp011516665）的相對(duì)豐度在老湯中最高，而在生鮮雞中并未檢出，冷庫(kù)放置12 h后經(jīng)老湯復(fù)煮，該種菌的相對(duì)豐度升高，結(jié)合慢生根瘤菌的生活特性推測(cè)是在老湯中添加香辛料的過(guò)程中引入的。草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）也是一種嗜溫菌，在有氧條件下可加速食品腐敗變質(zhì)［16］，在生鮮雞中所占豐度比最高，達(dá)27.98%，而在復(fù)煮5 min桶子雞和老湯中的相對(duì)豐度均低于1%，在放置12 h桶子雞中的相對(duì)豐度達(dá)到1.3%。可見(jiàn)，老湯煮制過(guò)程可將草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）控制在較低水平，但放置12 h后草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）的比例在桶子雞樣本中有所升高。生鮮雞的其余16個(gè)優(yōu)勢(shì)菌在其他3個(gè)樣本中所占比例均未達(dá)到0.6%，屬于生鮮雞中特有菌種?？梢?jiàn)，桶子雞采用老湯浸煮工藝可以將生鮮雞中大部分優(yōu)勢(shì)菌種降低到較低水平。干酪巨球菌（Macrococcus caseolyticus）是革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌科中的嗜中溫菌，是剛出鍋桶子雞獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌種，在其他4個(gè)樣本中的相對(duì)豐度均低于0.02%。剛出鍋桶子雞的其他優(yōu)勢(shì)菌種佛里德蘭德氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）又稱肺炎克雷伯菌，Duncaniella freteri，Psychrobacter sp.YP14，Enterobacter hormaechei_A，Bacteroides congonensis，Enterococcus cecorum，Prevotella ruminicola在其他4個(gè)樣本中相對(duì)豐度均較低，可見(jiàn)不同加工場(chǎng)所桶子雞所攜帶的優(yōu)勢(shì)菌種有一定差異。優(yōu)勢(shì)菌種希瓦氏菌（Shewanella baltica）在放置12 h桶子雞中相對(duì)豐度達(dá)到9.52%，在其他3個(gè)樣本中所占比例均少于1%。希瓦氏菌是革蘭氏陰性桿菌中的兼性厭氧且耐低溫細(xì)菌，可在不同的溫度、大氣壓強(qiáng)及鹽濃度等環(huán)境條件中生存和繁殖，可導(dǎo)致食品腐敗。Shewanella sp002966515也屬于希瓦氏菌屬，其在放置12 h 桶子雞中相對(duì)豐度達(dá)到3.94%，在其他樣本中所占比例也均少于1%。

2.6 多樣本PCA分析 為比較不同加工環(huán)節(jié)桶子雞的菌群多樣性差異，對(duì)5個(gè)樣本攜帶微生物的OTU（98.65%相似性）進(jìn)行Beta多樣性分析。5個(gè)樣本表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況如圖8所示，復(fù)煮5 min桶子雞和老湯所在區(qū)域最近，表明二者的菌群組成最為接近，剛出鍋桶子雞、生鮮雞分別在另外2個(gè)區(qū)域，冷庫(kù)放置12 h桶子雞樣本點(diǎn)位于中心位置，與其他4個(gè)樣本點(diǎn)相差較遠(yuǎn)，說(shuō)明其菌群組成與其他樣本相差較大。煮制桶子雞用的老湯中含有大量的油脂、鹽、香辛料，較為濃稠，在煮制過(guò)程中均勻地包裹在桶子雞表面，使得復(fù)煮5 min桶子雞的菌群組成與老湯中的菌群最為接近。可推測(cè)，另一加工場(chǎng)所制作的剛出鍋桶子雞，因其制作時(shí)使用的老湯不同，因此攜帶的菌群多樣性有較大差異。

3 結(jié)論

桶子雞的制作工藝：屠宰→煺毛（65～70 ℃）→開(kāi)口整形→浸煮（80～90 ℃，2 h）［1］，采用的殺菌工藝屬于低溫長(zhǎng)時(shí)消毒法（巴氏殺菌），可使食品中的酶失活，并破壞食品中熱敏性的微生物和致病菌，浸煮時(shí)采用的老湯，其中高濃度的鹽不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而較高程度地保留食物的營(yíng)養(yǎng)及色香味；但雞肉本身營(yíng)養(yǎng)豐富且殺菌工藝難以將耐熱細(xì)菌及芽孢殺滅，導(dǎo)致桶子雞貨架期短，銷售范圍受限。該研究采用3代全長(zhǎng)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同加工環(huán)境及不同加工環(huán)節(jié)對(duì)桶子雞所攜帶的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)生鮮雞的菌群組成與其他樣本差異較大，表明桶子雞的制作工藝可將生鮮雞中攜帶的大多數(shù)細(xì)菌殺滅，但由于制作過(guò)程中老湯、輔料（蔥、姜、花椒、八角、桂皮等）的添加、人員操作、環(huán)境等因素可引入部分嗜中溫菌、耐熱菌，導(dǎo)致桶子雞表面攜帶一定的微生物群落。同一加工環(huán)境下獲得的老湯復(fù)煮桶子雞與老湯中的菌群組成非常相似，因此，老湯中微生物的控制對(duì)成品桶子雞有重要影響。剛出鍋桶子雞表面攜帶的細(xì)菌菌群在門和屬的分類水平上均多于其他樣本，可見(jiàn)，加工環(huán)境對(duì)桶子雞表面攜帶的細(xì)菌群落組成有一定影響。該研究采用三代測(cè)序技術(shù)，可將桶子雞表面攜帶的細(xì)菌群落鑒定到種，但由于OTU聚類分析閾值較低，可能導(dǎo)致物種數(shù)量被低估［7］。

參考文獻(xiàn)

［1］ 董宇，葛敏敏，李健，等.開(kāi)封市傳統(tǒng)食品制作技藝 桶子雞：DB4102/T 020—2021［S］.開(kāi)封：開(kāi)封市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，2021：1-3.

［2］ 劉欣，王文艷，王娟，等.乳酸鏈球菌素對(duì)桶子雞的保鮮效果［J］.食品工業(yè)，2019，40（7）：6-10.

［3］ LABRIE S J，EL HADDAD L，TREMBLAY D M，et al.First complete genome sequence of Staphylococcus xylosus，a meat starter culture and a host to propagate Staphylococcus aureus phages［J］.Genome announcements，2014，2（4）：1-2.

［4］ FIORE-DONNO A M，RIXEN C，RIPPIN M，et al.New barcoded primers for efficient retrieval of cercozoan sequences in high-throughput environmental diversity surveys，with emphasis on worldwide biological soil crusts［J］.Molecular ecology resources，2018，18（2）：229-239.

［5］ DIAS M F，REIS M P，ACURCIO L B，et al.Changes in mouse gut bacterial community in response to different types of drinking water［J］.Water research，2018，132：79-89.

［6］ 黃志強(qiáng)，邱景璇，李杰，等.基于16S rRNA基因測(cè)序分析微生物群落多樣性［J］.微生物學(xué)報(bào)，202 61（5）：1044-1063.

［7］ 唐勇，劉旭.基于SMRT測(cè)序技術(shù)的16S rRNA基因全長(zhǎng)測(cè)序及其分析方法［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（8）：34-39.

［8］ SCHLOSS P D，JENIOR M L，KOUMPOURAS C C，et al.Sequencing 16S rRNA gene fragments using the PacBio SMRT DNA sequencing system［J］.PeerJ，2016，4：1-16.

［9］ KIM M，OH H S，PARK S C，et al.Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes［J］.International journal of systematic and evolutionary microbiology，2014，64（2）：346-351.

［10］ SCHLOSS P D，WESTCOTT S L，RYABIN T，et al.Introducing mothur：Open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75（23）：7537-7541.

［11］ LOZUPONE C，LLADSER M E，KNIGHTS D，et al.UniFrac：An effective distance metric for microbial community comparison［J］.ISME J，201 5（2）：169-172.

［12］ 郝卓莉.酸菜發(fā)酵期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化分析［J］.中國(guó)釀造，2020，39（7）：56-61.

［13］ AMATO K R，YEOMAN C J，KENT A，et al.Habitat degradation impacts black howler monkey （Alouatta pigra） gastrointestinal microbiomes［J］.The ISME journal，2013，7（7）：1344-1353.

［14］ 宋相宇，李鳴，王虎虎，等.高通量測(cè)序分析白切雞菌群多樣性［J］.食品科學(xué)，2020，41（17）：246-252.

［15］ 海丹，喬明武，宋蓮軍，等.高通量測(cè)序技術(shù)分析鴨皮中耐熱菌群［J］.肉類研究，2022，36（5）：1-6.

［16］ NYCHAS G J E，SKANDAMIS P N，TASSOU C C，et al.Meat spoilage during distribution［J］.Meat science，2008，78（1/2）：77-89.