摘要：目的 探討生脈散治療2型糖尿?。═2DM）合并冠心?。–HD）的作用機(jī)制。方法 應(yīng)用TCMSP、BATMAN-TCM和Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索生脈散藥效成分及對應(yīng)靶點(diǎn)，應(yīng)用Genecards、Drugbank和TTD數(shù)據(jù)庫檢索T2DM和CHD靶點(diǎn)基因，運(yùn)用Venny2.1.0工具得到疾病交集靶點(diǎn)，采用Cytoscape3.9.1軟件，建立藥效物質(zhì)-成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖譜，通過STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并獲取排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，通過R語言ClusterProfiler包進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析，使用Discovery Studio軟件完成分子對接，最后完成SPR檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果 獲得生脈散207個(gè)藥效成分，對應(yīng)1643個(gè)相關(guān)作用靶點(diǎn);T2DM疾病靶點(diǎn)2663個(gè)，CHD疾病靶點(diǎn)1206個(gè)，疾病-藥物交集靶點(diǎn)337個(gè);最終獲得3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)：AKT1、CTNNB1、ESR1;GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)涉及的生物學(xué)通路主要有MAPK、AGE-RAGE、TNF等信號通路;將上述得到的結(jié)果進(jìn)行分子對接，并選取AKT1蛋白和相關(guān)有效成分完成表面等離子共振SPR結(jié)合檢測，結(jié)果顯示均有較好活性。結(jié)論 生脈散可能從多成分、多靶點(diǎn)和多途徑調(diào)控糖脂代謝、改善氧化應(yīng)激等方面來發(fā)揮治療T2DM合并CHD的作用。

關(guān)鍵詞：2型糖尿病;冠心病;生脈散;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);SPR檢測

中圖分類號：R259 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.20.001

文章編號：1006-1959（2024）20-0001-10

Mechanism of Shengmaisan in Treating Type 2 Diabetes Mellitus with Coronary Heart Disease

Based on Network Pharmacology and SPR Assay

CHEN Moliang1，WANG Xiaozhen2，XU Guanghui1，2，LI Zhijin1

（1.Xiamen Health and Medical Big Data Center/Xiamen Medicine Research Institute/Xiamen Key Laboratory of Natural Medicine Research and Development，Xiamen 361008，F(xiàn)ujian，China;

2.College of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：Objective To explore the mechanism of Shengmaisan on the treatment of type 2 diabetes mellitus （T2DM） with coronary heart disease （CHD）.Methods The TCMSP， BATMAN-TCM and Uniprot databases were used to retrieve the active components and corresponding targets of Shengmaisan. The Genecards， Drugbank and TTD databases were used to retrieve the target genes of T2 DM and CHD. The Venny2.1.0 tool was used to obtain the disease intersection targets. Cytoscape 3.9.1 software was used to establish a network map of active substances-components-targets. The PPI network was constructed by STRING， and the top 10 key target genes were obtained. GO function and KEGG pathway analysis were performed through the R voice ClusterProfiler package， and molecular docking was completed using Discovery Studio software. Finally， the SPR assay experiment was completed.Results There were 207 effective components in Shengmai Powder， corresponding to 1643 related targets. There were 2663 T2DM disease targets， 1206 CHD disease targets， and 337 disease-drug intersection targets. Finally， three key targets were obtained： AKT1， CTNNB1， ESR1; GO and KEGG analysis found that the biological pathways involved mainly include MAPK， AGE-RAGE， TNF and other signaling pathways; the above results were subjected to molecular docking， and AKT1 protein and related active ingredients were selected to complete the surface plasmon resonance SPR binding detection， and the binding results showed that all of them had good activity.Conclusion Shengmaisan may play a role in the treatment of T2DM complicated with CHD from the aspects of multi-component， multi-target and multi-channel regulation of glucose and lipid metabolism， improvement of oxidative stress， etc.

Key words：Type 2 diabetes mellitus;Coronary heart disease;Shengmaisan;Network pharmacology;SPR assay

糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）已經(jīng)成為繼腫瘤之后對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅的慢性非傳染病，預(yù)計(jì)到2040年，全球?qū)⒓s有6.4億糖尿病患者，而在我國目前糖尿病發(fā)病率高達(dá)12%，給患者和家庭帶來巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1-3]。DM主要是由胰島素抵擋或胰島素分泌不足引起的，而2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）是糖尿病的主要類型，占糖尿病患者的90%～95%，是目前全球流行的疾病之一，發(fā)病率越來越高[4]。且T2DM作為心臟、血管、眼睛、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的危險(xiǎn)因素，不可避免地增加死亡風(fēng)險(xiǎn)和社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)。研究表明[5， 6]，T2DM患者發(fā)生心血管疾病（cardiovascular disease， CVD）的風(fēng)險(xiǎn)是非T2DM患者的2～6倍，這表明了T2DM與心血管疾病之間存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)。心血管疾病主要包括冠心?。╟oronary heart disease， CHD）、腦卒中、心力衰竭等，CHD是指心臟冠狀動脈血管變得狹窄或阻塞，即出現(xiàn)了動脈粥樣硬化病變，導(dǎo)致心肌缺血，從而引起心絞痛、心肌梗死等癥狀的一種心血管疾病，是我國居民死亡的主要病因之一[7]。DM患者的血糖水平與CHD密切相關(guān)，長期患DM的患者會對包括心臟在內(nèi)的多個(gè)器官和系統(tǒng)造成傷害，引發(fā)大血管和微血管并發(fā)癥[8-11]。目前，兩種疾病均無完全根治之法，僅能控制病情。研究表明[12， 13]，患有T2DM的患者合并CHD的風(fēng)險(xiǎn)是非患有T2DM的患者的2～4倍，因此T2DM的死亡率大幅增加?，F(xiàn)代臨床西醫(yī)主要使GiuPsLxhYKyU3/oAq31Wnw==用降血糖藥物、降壓藥、改善血脂和動脈介入等手段來治療T2DM合并CHD[14]，但這些方法普遍存在藥物依賴性強(qiáng)、副作用等問題，導(dǎo)致臨床療效不佳。近年來，中醫(yī)藥在治療T2DM、CHD等方面取得了重大進(jìn)展，在這類疾病上以其整體觀、辨證論治、中藥多靶點(diǎn)的作用，體現(xiàn)其獨(dú)特的治療優(yōu)勢，可達(dá)到標(biāo)本兼治的效果，顯示出良好的前景。生脈散是由人參、麥冬、五味子三味中藥組成的傳統(tǒng)中醫(yī)方劑?，F(xiàn)代臨床研究表明[15-17]，生脈散具有多種功能，包括擴(kuò)張冠脈和增強(qiáng)心肌收縮力、提高心肌耐氧量等能力，可以用于治療CHD、心絞痛等心血管疾病。此外，生脈散還具有降血糖、調(diào)脂、改善血管微循環(huán)等作用，在DM、高血脂等疾病的治療中也有較好的效果[18， 19]，其臨床應(yīng)用價(jià)值廣泛。但由于中藥復(fù)方各藥物之間的復(fù)雜性和多樣性，中藥及復(fù)方治療疾病的具體作用機(jī)制尚不明確。近年來，由于疾病、藥物有關(guān)的數(shù)據(jù)不斷增多，以及計(jì)算機(jī)技術(shù)、分析軟件的不斷改進(jìn)，使得網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，并逐漸成為中醫(yī)藥研究熱點(diǎn)[20， 21]。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對生脈散治療疾病的具體作用機(jī)制進(jìn)行的研究已經(jīng)越來越多，其在T2DM、CHD等領(lǐng)域也已取得了一定成果[22-25]，但目前生脈散同時(shí)治療T2DM和CHD兩種緊密關(guān)聯(lián)的疾病研究較少[26， 27]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和SPR實(shí)驗(yàn)檢測，探索生脈散治療T2DM合并CHD的作用機(jī)制，以期為其在臨床上的運(yùn)用提供理論依據(jù)，提高其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.1.1篩選生脈散有效成分及靶點(diǎn)預(yù)測 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）篩選生脈散活性成分，其中TCMSP數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選參數(shù)口服利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和生物利用度（drug-likeness， DL）≥0.18。BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選參數(shù)未Score cutoff≥20及P-value cutoff<0.05。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫所得到的生脈散活性成分以及相關(guān)蛋白靶點(diǎn)合并去重。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將蛋白靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2糖尿病和冠心病疾病靶點(diǎn)預(yù)測 根據(jù)T2DM和CHD兩類疾病，利用關(guān)鍵詞“type 2 diabetes mellitus”和“coronary heart disease”在Genecards（https：//www.genecards.org/ds）、Drugbank（https：//go.Drugbank.com/）和TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫中檢索，將結(jié)果合并去重獲得T2DM和CHD疾病相關(guān)靶點(diǎn)。其中，在Genecards數(shù)據(jù)庫中設(shè)置相關(guān)性得分≥20進(jìn)行篩選。利用Venny2.1.0在線繪圖工具，將已獲得的生脈散藥物靶點(diǎn)與T2DM、CHD疾病靶點(diǎn)繪制韋恩圖，取交集獲得生脈散干預(yù)T2DM合并CHD的潛在靶點(diǎn)基因。

1.1.3構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape 3.9.1軟件（http：//www.cytoscape.org），構(gòu)建“藥物-活性成分-共有靶點(diǎn)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中包含藥物、成分和靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，通過邊表示藥物-成分、成分-靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，并基于網(wǎng)節(jié)點(diǎn)絡(luò)度值進(jìn)行篩選前10個(gè)的活性成分節(jié)點(diǎn)。度值表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)連線的數(shù)量，節(jié)點(diǎn)度值越大，說明其參與作用越強(qiáng)。

1.1.4構(gòu)建蛋白質(zhì)互作PPI網(wǎng)絡(luò) 將篩選的生脈散與T2DM合并CHD的共有靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），選擇“Multiple Proteins”，且物種選定為“Homo sapiens”，設(shè)置置信度分?jǐn)?shù)（highest confidence）大于0.9，并去除游離節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)均為默認(rèn)值，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并以此PPI網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值獲得排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因;另外，利用Cytoscape 3.9.1軟件插件cytohubba，根據(jù)最大集團(tuán)中心度（maximal clique centrality，MCC）值篩選出前10的靶點(diǎn)基因節(jié)點(diǎn)，兩者取交集后得到潛在治療T2DM合并CHD的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

1.1.5 GO富集分析和KEGG通路富集 利用R語言中ClusterProfiler包對生脈散與T2DM合并CHD的共有核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)定P值<0.05。GO分析主要包括生物過程（biological process， BP）、細(xì)胞成分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF），以此來分析靶點(diǎn)主要是通過何種信號通路和生物功能調(diào)控T2DM和CHD。

1.1.6分子對接 根據(jù)上述分析結(jié)果，篩選得到核心成分及靶點(diǎn)基因，將藥效成分作為配體，核心靶點(diǎn)作為對接位點(diǎn)完成分子對接。分子對接主要分為3個(gè)步驟：①準(zhǔn)備靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)：利用蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白PDB文件，再運(yùn)用Discovery Studio軟件將蛋白去除結(jié)晶水、加氫，并對蛋白進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化。②準(zhǔn)備小分子化合物：小分子化合物的二維結(jié)構(gòu)從TCMSP數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得，TCMSP數(shù)據(jù)庫可直接獲得化合物的mol2文件，但由于部分化合物TCMSP數(shù)據(jù)庫中沒有收錄，需從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得化合物的sdf文件，再通過OpenBabel軟件轉(zhuǎn)換成mol2文件，最后再利用Discovery Studio軟件對核心化合物成分進(jìn)行加氫、能量最低化等優(yōu)化處理。③分子對接：采用Discovery Studio軟件中的Dock Ligands（LibDock）進(jìn)行分子對接，以驗(yàn)證上述流程得到的結(jié)論。

1.2 SPR親和力檢測實(shí)驗(yàn)步驟和方法

1.2.1材料和儀器 樣品：通過分子對接結(jié)果，選擇結(jié)合效果較好的蛋白和小分子化合物進(jìn)行SPR親和力檢測實(shí)驗(yàn)。材料儀器：CM5芯片（廠家：Cytiva，貨號：BR100530，批號：10329008），氨基偶聯(lián)試劑盒（廠家：Cytiva，貨號：BR100050，批號：31206），10 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.0）（廠家：Cytiva，貨號：BR100349，批號：31483），自制的PBS+（10×）pH7.4，DMSO（廠家：Sigma，貨號：D4540-1L，批號：BCCG1271）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 ①試劑準(zhǔn)備：配制PBS（10×）緩沖液母液（20 mmol/L KH2PO4，1.37 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2HPO4，27 mmol/L KCl，pH7.4），用超純水將PBS母液稀釋10倍，pH調(diào)節(jié)至7.4，作為運(yùn)行緩沖液（2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，pH7.4），0.22 μmol/L濾膜過濾后使用。氨基偶聯(lián)試劑盒，包含：115 mg N-羥基丁二酰亞胺（NHS），750 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和10.5 ml 1 mol/L乙醇胺（pH 8.5）。將每管EDC和NHS分別加入10 ml去離子水，分裝保存到-18 ℃至更低溫度，并在2個(gè)月內(nèi)用完。②芯片準(zhǔn)備：將配體蛋白以10 mmol/L醋酸鈉（pH 4.0） 稀釋至11.7 μg/ml。首先，在10 μl/min的流速下，用400 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS激活CM5芯片表面480 s。接下來，以10 μl/min的流速在實(shí)驗(yàn)通道（Fc）中多次加入11.7 μg/ml的配體蛋白，固定量約1000 RU。最后，使用1 mol/L乙醇胺將芯片進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間為480 s，流速為10 μl/min。參比通道（Fc1）與實(shí)驗(yàn)通道（Fc2）進(jìn)行相同的操作。③親和力測定：?配制5% DMSO-PBS作為運(yùn)行緩沖液2 （2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，5% DMSO，pH 7.4）;?配制不同DMSO濃度的溶劑校準(zhǔn)品，見表1;?先用DMSO將分析物溶解成10 mmol/L母液，再使用PBS（10×）及超純水將分析物配制成500 μmol/L，緩沖液組分與運(yùn)行緩沖液2保持一致（2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，5% DMSO，pH7.4），將稀釋后的分析物，在60 s內(nèi)，以30 μl/min的流速分別注入實(shí)驗(yàn)通道（Fc2）與參比通道（Fc1），并在60 s內(nèi)進(jìn)行解離，結(jié)合解離步驟均在運(yùn)行緩沖液2中進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1生脈散潛在活性成分和靶點(diǎn)篩選 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫有效成分并集后去重，其中人參122個(gè)、五味子76個(gè)、麥冬18個(gè)，最終三味藥材合并去重，得到生脈散的有效成分共207個(gè)，有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因1643個(gè)，見表2。

2.2疾病靶點(diǎn)篩選 通過Genecards、Drugbank和TTD三個(gè)數(shù)據(jù)庫中篩選到的結(jié)果合并再刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到T2DM相關(guān)靶點(diǎn)2663個(gè)，CHD相關(guān)靶點(diǎn)1206個(gè)，見表3。將生脈散有效成分的1643個(gè)作用靶點(diǎn)與T2DM、CHD相關(guān)靶點(diǎn)取交集繪制韋恩圖，得到共有交集靶點(diǎn)基因337個(gè)，可認(rèn)為是生脈散治療T2DM合并CHD的潛在靶標(biāo)基因集，見圖1。

2.3構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將所獲得的生脈散有效成分、對應(yīng)疾病靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape3.9.1軟件中，得到“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有546個(gè)節(jié)點(diǎn)（3個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)、106個(gè)成分節(jié)點(diǎn)和337個(gè)交集基因節(jié)點(diǎn)）和2464條邊，其中節(jié)點(diǎn)平均度值為9.02。通過篩選網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值大于平均度值的節(jié)點(diǎn)，最終繪制“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值，篩選排名前10的生脈散有效成分，分別是維生素B1（Vitamin B1）、長葉烯（Longifolene）、月桂烯（Myrcene）、?；撬崴兀═auremisin）、五味子酚[（+）-Gomisin K3]、去氧哈林通堿（Deoxyharringtonine）、麥芽糖（Maltose）、山奈酚（Kaempferol）、20（R）-人參皂苷Rg3[20（R）-Ginsenoside Rg3]、戈米辛L2[（-）-Gomisin L2]，見表4。

2.4構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 將生脈散與T2DM合并CHD的337個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用PPI的網(wǎng)絡(luò)分析，可視化結(jié)果見圖3。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值，篩選排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)，另外使用Cytoscape3.9.1軟件中cytoHubba插件的MCC算法獲取前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見表5;兩種算法結(jié)果取交集后得到3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，即AKT1、CTNNB1、ESR1，這些靶點(diǎn)基因可能是和生脈散治療T2DM合并CHD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析 通過R語言中clusterProfiler包，對337個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行信號通路富集分析。GO富集分析結(jié)果根據(jù)P值排序，分別篩選出BP、CC和MF中富集顯著的前10個(gè)生物學(xué)功能，其中BP包括對外界刺激的反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、氧氣水平調(diào)節(jié)、細(xì)菌源分子的反應(yīng)、肌肉系統(tǒng)過程、脂多糖作用、上皮細(xì)胞增殖、氧含量降低的反應(yīng)和血液循環(huán)的調(diào)節(jié)等;CC包括膜微區(qū)、膜筏、神經(jīng)元細(xì)胞體、囊腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜筏、陽離子通道配合物、小窩胞膜以及肌纖維膜等;MF包括受體激活活性、受體配體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、四吡咯結(jié)合、生長因子活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇結(jié)合等，見圖4。KEGG通路富集得到191條結(jié)果，根據(jù)P值和基因數(shù)量選取前20的通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生脈散治療T2DM合并CHD的途徑包括多種顯著富集的信號通路，如糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、MAPK、TNF、IL-17、HIF-1信號通路和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等，表明生脈散治療T2DM合并CHD可能涉及代謝、凋亡等多方面信號通路的影響，見圖5。

2.6分子對接分析 利用Discovery Studio軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)和小分子化合物的計(jì)算機(jī)模擬對接，對接結(jié)果得到絕對自由能、相對自由能、對接姿式數(shù)和LibDockScore綜合分?jǐn)?shù)。將從藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出的度值排名前10的化學(xué)成分與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示20（R）-Ginsenoside Rg3、Deoxyharringtonine、Kaempferol、Maltose與AKT1、CTNNB1、ESR1均有較好活性，見表6。生脈散中的4種活性化合物[20（R）-Ginsenoside Rg3、Deoxyharringtonine、Kaempferol、Maltose]與T2DM合并CHD的3個(gè)核心靶點(diǎn)（AKT1、CTNNB1、ESR1）通過靜電作用、氫鍵、范德華力、π-π相互作用等分子間作用力很好地結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，具體結(jié)果見圖6?；诜肿訉咏Y(jié)果推測該研究可能通過作用于上述幾種關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療T2DM合并CHD的作用，同時(shí)闡明了生脈散調(diào)控T2DM合并CHD具有“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的機(jī)制特點(diǎn)。

2.7 SPR親和力檢測

2.7.1實(shí)驗(yàn)樣品選擇 基于分子對接結(jié)果，選取AKT1蛋白進(jìn)行SPR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，由于小分子化合物Deoxyharringtonine有毒性，目前無市售，因此選擇購買Maltose、（20R）-Ginsenoside Rg3、Kaempferol這三種小分子化合物。蛋白：AKT1（廠家：義翹神州，目錄編號：10763-H08B）;小分子化合物：Maltose （廠家：上海源葉，貨號：B20834-20mg）、（20R）-Ginsenoside Rg3 （廠家：MCE，貨號：HY-N1376）、Kaempferol（廠家：上海源葉，貨號：B21126-20mg）。

2.7.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ①AKT1蛋白偶聯(lián)結(jié)果：配體偶聯(lián)量約為12 000 RU。②化合物單濃度篩選結(jié)果：使用分析軟件Biacore T200 Evaluation Software對不同分析物結(jié)合信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，檢測得到3種化合物的結(jié)合散點(diǎn)圖，篩選得到結(jié)合值大于cutoff的化合物有2個(gè)，即Kaempferol和（20R）-Ginsenoside Rg3，見圖7;通過分析物與配體結(jié)合傳感圖，發(fā)現(xiàn)以上2個(gè)小分子化合物解離速度都較快，見圖8。從傳感圖可知，Kaempferol與AKT1蛋白結(jié)合要高于（20R）-Ginsenoside Rg3與AKT1結(jié)合，與AKT1有明顯結(jié)合信號。

3討論

中醫(yī)療法注重?fù)P長避短，毒副作用小，辨證論治與整體觀念獨(dú)具特色，使得中醫(yī)藥在治療T2DM合并CHD上發(fā)揮了強(qiáng)大的作用。但中藥復(fù)方各藥物之間的藥效機(jī)制較復(fù)雜，難證實(shí)中藥復(fù)方中的活性成分通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)來治療疾病[2]。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對生脈散干預(yù)T2DM合并CHD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及可能作用的靶點(diǎn)和通路進(jìn)行了深入研究，并對其可能作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)生脈散中的多個(gè)藥效物質(zhì)不僅可以對一個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，也可對多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，表現(xiàn)其多途徑的協(xié)同增效作用。

本研究篩選了生脈散106個(gè)復(fù)方成分，藥物疾病共同作用靶點(diǎn)337個(gè)，通過分析得到可能起治療作用的核心化合物有維生素B1（Vitamin B1）、長葉烯（Longifolene）、月桂烯（Myrcene）、牛磺酸素（Tauremisin）、五味子酚[（+）-Gomisin K3]、去氧哈林通堿（Deoxyharringtonine）、麥芽糖（Maltose）、山奈酚（Kaempferol）、20（R）-人參皂苷Rg3[20（R）-Ginsenoside Rg3]、戈米辛L2[（-）-Gomisin L2]，通過作用于RAC-ɑ絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、兒茶素β-1（CTNNB1）、雌激素受體（ESR1）等關(guān)鍵靶點(diǎn)，根據(jù)調(diào)控MAPK信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等多個(gè)途徑，來調(diào)節(jié)血糖血脂水平，改善氧化應(yīng)激等，從而對T2DM合并CHD進(jìn)行干預(yù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與我國中醫(yī)藥學(xué)中的系統(tǒng)整體觀和辨證論治理念不謀而合，將其運(yùn)用到中醫(yī)藥研究可為疾病的控制和用藥提供更多選擇和可能性，也為中藥復(fù)方新藥的研發(fā)及醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化發(fā)展提供技術(shù)支持[23]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，本研究采用了分子對接技術(shù)，選取生脈散中的4種活性化合物[20（R）-Ginsenoside Rg3、Deoxyharringtonine、Kaempferol、Maltose]與T2DM合并CHD的3個(gè)核心靶點(diǎn)（AKT1、CTNNB1、ESR1）完成分子對接，根據(jù)絕對自由能、相對自由能、對接姿式數(shù)和LibDockScore綜合分?jǐn)?shù)這幾個(gè)參數(shù)來評估成分與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的親和程度，結(jié)果均顯示對接成功?；诜肿訉拥慕Y(jié)果，本研究另通過SPR親和力檢測實(shí)驗(yàn)，使用Biacore T200檢測AKT1蛋白與分析物Maltose、（20R）-Ginsenoside Rg3、Kaempferol的結(jié)合情況，根據(jù)分析物與配體結(jié)合信號散點(diǎn)圖所示，在運(yùn)行緩沖液2稀釋分析物時(shí)，Maltose和（20R）-Ginsenoside Rg3在200 μmol/L時(shí)可溶，Maltose與AKT1無明顯結(jié)合信號，（20R）-Ginsenoside Rg3與AKT1結(jié)合信號較弱;Kaempferol在25 μmol/L時(shí)可溶，與AKT1有明顯結(jié)合信號。分析物與配體結(jié)合傳感圖得知，Kaempferol和（20R）-Ginsenoside Rg3的解離速度都較快，通過比較響應(yīng)值可知，Kaempferol與AKT1蛋白結(jié)合要高于（20R）-Ginsenoside Rg3與AKT1結(jié)合。

綜上所述，本研究初步探討了生脈散治療T2DM合并CHD的作用機(jī)制，為闡述中藥方劑生脈散治療T2DM合并CHD的作用機(jī)制提供了重要數(shù)據(jù)，即通過生脈散中的多種活性成分介導(dǎo)T2DM及CHD相關(guān)的多靶點(diǎn)、多通路來發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)“靶標(biāo)-受體-配體-復(fù)合物-靶標(biāo)-受體”的相互作用和作用機(jī)制的可視化，對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得出結(jié)果的精確性進(jìn)行驗(yàn)證，從而揭示生脈散治療T2DM合并CHD的藥效基礎(chǔ)，為后續(xù)的細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)研究提供思路和參考依據(jù)，為臨床提供理論依據(jù)。

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編輯/杜帆

基金項(xiàng)目：廈門市醫(yī)療衛(wèi)生指導(dǎo)性項(xiàng)目（編號：3502Z20214ZD1304）

作者簡介：陳沫良（1988.8-），男，湖南武岡人，博士，助理研究員，主要從事計(jì)算生物、中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘研究