摘要 目的：探究原兒茶酸（PCA）對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的影響。方法：將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組、模型組、陽性藥物對(duì)照組（陽性組）、低PCA組和高PCA組，每組10只。對(duì)照組大鼠給予基礎(chǔ)對(duì)照飼料喂養(yǎng)，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠均給予45%高脂飼料喂養(yǎng)造模。建模第3周開始，陽性組大鼠每日給予阿伐他汀鈣溶劑（5 mg/kg）灌胃；低PCA組和高PCA組大鼠每日分別給予100 mg/kg和200 mg/kg的PCA溶劑灌胃；對(duì)照組和模型組大鼠每日分別灌胃等量的生理鹽水，各組大鼠均持續(xù)給藥4周。給藥過程中，每周分別測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量。給藥結(jié)束時(shí)，各組大鼠采用腹腔1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸腔后分離大鼠肝臟組織和采集腹主動(dòng)脈血，分離收集血清。通過全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。采用試劑盒檢測(cè)各組大鼠肝臟和血清中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）基因的相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中SREBP2、HMGCR、p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK）和磷酸化JNK（p-JNK）表達(dá)水平。采用蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)各組大鼠肝臟組織的病變情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟指數(shù)、TC、TG、LDL-C、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高（P＜0.05），HDL-C、SOD和GSH-Px水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟指數(shù)、TC、TG、LDL-C、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低（P＜0.05），HDL-C、SOD和GSH-Px水平均升高（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織中HMGCR和SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），p38MAPK、ERK和JNK蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織中HMGCR和SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），p38MAPK、ERK和JNK蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.05）。結(jié)論：原兒茶酸可有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，抑制肝臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥損傷，可能通過MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝水平，進(jìn)而發(fā)揮降血脂作用。

關(guān)鍵詞 高脂血癥；原兒茶酸；脂代謝；絲裂原活化蛋白激酶通路；炎癥；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.20.006

Effects of Protocatechuic Acid on Lipid Metabolism and MAPK Pathway in Hyperlipidemia Rats

CHEN Liyuan¹， MA Youwei²， DAI Qing¹， LIU Yang¹， ZHAO Xiaochen³

1.Lintong Rehabilitation Center of Joint Logistics Support Force， Xi′an 710699， Shaanxi， China; 2.Gansu Province Central Hospital， Lanzhou 730050， Gansu， China; 3.The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force， Lanzhou 730050， Gansu， China

Corresponding Author MA Youwei， E-mail： 78250989@qq.com

Abstract Objective：To explore the effects of protocatechuic acid on lipid metabolism and mitogen-activated protein kinase（MAPK） pathway in hyperlipidemia rats.Method：SD rats were randomly divided into control group，high fat model group，positive drug control group（positive group），low dose protocatechuic acid group（low PCA group） and high dose protocatechuic acid group（high PCA group） according to random number table，with 10 rats in each group.The rats in the control group were fed a basal control diet，while the rats in the model group，positive group，low PCA group，and high PCA group were fed a 45% high-fat diet for modeling.At the 3rd week of modeling，rats in the positive group were administered daily with atorvastatin calcium solvent（5 mg/kg）.The rats in the low PCA group and high PCA group were given PCA solvent 100 mg/kg and 200 mg/kg daily，respectively.Rats in the control group and model group were administered the same volume of normal saline intragastrically every day，and all rats in each group received continuous medication for 4 weeks.The body weight of each group was measured weekly.At the end of the administration，1% sodium pentobarbital was injected into the abdominal cavity for anesthetization.The liver tissue and abdominal aortic blood were then separated，and serum was collected after thoracotomy.The contents of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） and high-density lipoproteincholesterol（HDL-C） in serum of rats were detected by automatic biochemical analyzer.The contents of malonaldehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSH-Px） in liver and serum of rats in each group were detected by the kit，and the levels of interleukin（IL）-1β，IL-6 and TNF-α in serum were detected by the kit.The relative expression levels of cholesterol regulatory element binding protein 2（SREBP2） and 3-hy-droxy-3-methylglutaryl-coenzyme areductase（HMGCR） genes in liver tissues of each group were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.The expression levels of SREBP2，HMGCR，p38MAPK，phosphorylated p38MAPK（p-p38MAPK），extracellular signal-regulated kinase（ERK），phosphorylated ERK（p-ERK），JNK，and p-JNK in rat liver tissues of each group were detected by Western Blot.The pathological changes of rat liver tissue in each group were detected by hematoxylin-eosin（HE） staining.Result：Compared with control group，liver index and the levels of TC，TG， LDL-C，MDA，IL-1β，IL-6，and TNF-α in model group，positive group，low PCA group and high PCA group increased（P＜0.05），while the levels of HDL-C，SOD，and GSH-Px decreased（P＜0.05）.Compared with model group，liver index and the levels of TC，TG，LDL-C， MDA，IL-1β，IL-6，and TNF-α in positive group，low PCA group，and high PCA group decreased（P＜0.05），while the levels of HDL-C，SOD，and GSH-Px increased（P＜0.05）.Compared with the control group，the mRNA and protein expression levels of HMGCR and SREBP2 in liver tissues of model，positive，low PCA，and high PCA groups were increased（P＜0.05），and the protein phosphorylation levels of p38MAPK，ERK，and JNK were increased（P＜0.05）.Compared with model group，the mRNA and protein expression levels of HMGCR and SREBP2 in liver tissues of rats in positive，low PCA and high PCA groups were decreased（P＜0.05）， and protein phosphorylation levels of p38MAPK，ERK，and JNK were less（P＜0.05）.Conclusion：PCA can effectively regulate blood lipid levels in hyperlipidemia rats，inhibit oxidative stress response and inflammatory damage in liver tissue，and may regulate lipid synthesis and metabolism through MAPK signaling pathway，thus playing some role in lowering blood lipid.

Keywords hyperlipoidemia; protocatechuic acid; lipid metabolism; mitogen-activated protein kinase pathway; inflammatory; experimental study

基金項(xiàng)目 甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（創(chuàng)新基地和人才項(xiàng)目）（No.21JR7RA013）

作者單位 1.聯(lián)勤保障部隊(duì)臨潼康復(fù)療養(yǎng)中心（西安 710699）；2.甘肅省中心醫(yī)院（蘭州 730050）；3.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院（蘭州 730050）

通訊作者 馬有偉，E-mail：78250989@qq.com

引用信息 陳麗媛，馬有偉，戴慶，等.原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝及MAPK通路的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（20）：3689-3696.

高脂血癥（hyperlipoidemia，HLP）通常被稱為高血脂，主要由于機(jī)體內(nèi)脂代謝和運(yùn)行異常，導(dǎo)致血漿中一種或多種脂質(zhì)水平偏高或偏低而形成的一種全身代謝性疾病^［1-2］。目前臨床上對(duì)于高脂血癥的判定主要根據(jù)血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）這4種脂質(zhì)指標(biāo)的變化來確定。在成人中，高血脂已被證明是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和腦卒中等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素^［3］。因此，對(duì)于高脂血癥的預(yù)防和治療目前仍然是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的巨大難題。

原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）化學(xué)名為3，4-二羥基苯甲酸，是廣泛存在于蔬菜、水果和藥材中的一種酚酸類產(chǎn)物，花青素是其主要的來源之一^［4］。一些研究表明，原兒茶酸具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗菌、自由基清除、抗癌和抗菌等活性，具有降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)和保護(hù)肝臟和腎臟等作用^［5］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在不同劑量原兒茶酸喂飼處理的糖尿病模型大鼠中，PCA可以有效提高過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累^［6-7］。對(duì)載脂蛋白E（ApoE）基因缺陷型小鼠補(bǔ)充原兒茶酸飲食處理后，小鼠主動(dòng)脈中膽固醇的積累顯著減少^［8］。諸多研究結(jié)果表明，原兒茶酸存在通過抗炎或抗氧化等途徑調(diào)節(jié)血脂代謝的可能。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，如細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等^［9］，近年來，研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路與脂類代謝疾?。ㄈ缰靖危┐嬖诰o密關(guān)系。Nandipati等^［10］研究顯示MAPK及其亞型信號(hào)通路的激活能夠引起脂質(zhì)代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常，進(jìn)而引發(fā)非酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展。肥胖作為代謝類疾病的典型，也被認(rèn)為可能是由于病人體內(nèi)游離的脂肪酸和炎性因子過多而激活了MAPK途徑，進(jìn)而影響脂類代謝和胰島素的功能紊亂^［11］。有研究報(bào)道，原兒茶酸通過抑制MAPK途徑降低RAW264.7細(xì)胞中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等促炎因子水平而抑制炎癥的發(fā)生^［12］。但目前原兒茶酸對(duì)哺乳動(dòng)物血脂代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制以及是否可能與MAPK通路存在關(guān)聯(lián)尚未明確，本研究旨在通過不同濃度原兒茶酸處理高脂血癥模型大鼠，以探討原兒茶酸在大鼠中對(duì)于血脂代謝的調(diào)節(jié)作用以及與MAPK通路的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器

原兒茶酸（純度≥98%，貨號(hào)P104382）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿托伐他汀鈣片購自美國輝瑞制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字J20030047）；TC（貨號(hào)A111-1-1）、TG（貨號(hào)A110-1-1）、LDL-C（貨號(hào)A113-1-1）和HDL-C（貨號(hào)A112-1-1）試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；MDA（貨號(hào)BC0020）、超氧化物歧化酶（SOD，貨號(hào)BC0170）和GSH-Px（貨號(hào)BC1195）含量檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β（貨號(hào)PI303）、IL-6（貨號(hào)PI328）和TNF-α（貨號(hào)PT516）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RevertAid RT試劑盒（貨號(hào)K1691）購自美國Thermo公司；一抗膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）、p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、C-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和IgG-HRP二抗均購自英國Abcam公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號(hào)C0105S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PUZS-300全自動(dòng)生化分析儀購自上海帝博思生物科技有限公司。

1.1.2 動(dòng)物和飼料

無特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量195～210 g，購自陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)生物制品有限公司［SCXK（陜）2018-001］。飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境，溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%，12 h光暗交替，每日早晚喂食，不限制飲水。45%高脂飼料（貨號(hào)TP 23000）和基礎(chǔ)對(duì)照飼料（型號(hào)LAD3001G）均購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組處理與動(dòng)物建模

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組、模型組、陽性藥物對(duì)照組（陽性組，阿托伐他汀鈣片，每片10 mg）、低PCA組和高PCA組，每組10只大鼠。對(duì)照組大鼠給予基礎(chǔ)對(duì)照飼料喂養(yǎng)，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠均給予45%高脂飼料喂養(yǎng)造模。建模2周時(shí)，各組大鼠禁食12 h，分別取尾血，按照試劑盒所述步驟檢測(cè)血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，造模大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，則表示造模成功。第3周開始，陽性組大鼠每日給予阿伐他汀鈣溶劑灌胃，劑量為5 mg/kg；低PCA組和高PCA組大鼠每日分別給予劑量為100 mg/kg和200 mg/kg的原兒茶酸溶劑灌胃；對(duì)照組和模型組大鼠每日分別灌胃等量的生理鹽水。各組大鼠均持續(xù)給藥4周。

1.2.2 大鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量檢測(cè)

給藥過程中，每周分別測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量。給藥結(jié)束時(shí)，各組大鼠采用腹腔1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸腔后采集腹主動(dòng)脈血，然后血液樣品在3 500 r/min離心（4 ℃）10 min，分離血清保存于－80 ℃?zhèn)溆?。然后采集各組大鼠肝臟，采用生理鹽水處理洗凈后稱重，然后一部分于－80 ℃留存?zhèn)溆?，另一部分采?%的多聚甲醛固定，用于fdnsX6v/9VXpZ9/bqFY+7g==后續(xù)切片制作和組織學(xué)觀察。肝臟系數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.3 大鼠血清血脂指標(biāo)水平測(cè)定

取采集的各組大鼠血清，分別采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

1.2.4 大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平測(cè)定

稱取各組大鼠備用肝臟組織各1 g，與預(yù)冷的1×磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混合后冰浴充分勻漿，懸濁液于8 000 r/min低溫離心10 min，取上清液－20 ℃保存待檢測(cè)。分別取各組大鼠保存的血清和肝臟組織勻漿上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明步驟檢測(cè)各組大鼠肝臟和血漿中MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.2.5 大鼠血清炎性指標(biāo)水平測(cè)定

分別取各組大鼠保存的血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明步驟檢測(cè)各組大鼠血清中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)SREBP2和 HMGCR基因表達(dá)

分別取各組大鼠保存的肝臟組織，采用Trizol試劑提取總RNA。然后使用Thermo Scientific RevertAid RT試劑盒以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過TB Green^TM Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）試劑盒按照50 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增程序條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性35 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參蛋白，采用2^－ΔΔCt法計(jì)算SREBP2和 HMGCR基因的相對(duì)表達(dá)量。SREBP2引物序列：正向引物為5′-CTGACCACAATGCCGGTAAT-3′，反向引物為5′-CTTGTGCATCTTGGCATCTG-3′；HMGCR引物序列：正向引物為5′-TGGCAGGACGCAACCTCTAC-3′，反向引物為5′-AATAGTTACCACTGACCGCCAGAA-3′；GAPDH引物序列：正向引物為5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，反向引物為5′-ATCCGTTCACACCGACCTTC-3′。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)SREBP2、HMGCR、p38MAPK、ERK和JNK蛋白表達(dá)

分別取各組大鼠保存的肝臟組織，加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中置于冰上充分勻漿處理，懸濁液于8 000 r/min低溫離心10 min，取上清液通過二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析。各組分別取等量蛋白上樣，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將膜與含有5% BSA的TBS-T溶液于室溫下封閉孵育處理2 h。然后分別加入按比例稀釋后的一抗SREBP2（1∶2 000）、HMGCR（1∶2 000）、p38MAPK（1∶1000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、ERK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000），于4 ℃下孵育過夜處理。第2天采用TBS-T溶液洗膜3次，然后加入IgG-HRP二抗（1∶2 000）于室溫下孵育處理1 h后TBS-T溶液沖洗。采用電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影后凝膠成像，通過Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行灰度值分析。

1.2.8 大鼠肝臟組織HE染色

分別取各組大鼠采用4%多聚甲醛固定的肝臟組織，蒸餾水洗滌后，再經(jīng)過乙醇脫水、透明和石蠟包埋，制備4 μm切片，按照HE染色試劑盒的說明方法進(jìn)行HE染色，每組隨機(jī)選擇5個(gè)切片，在光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察大鼠肝臟病變情況。

1.3 倫理審查

本研究得到聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2021KYLL178）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 18.0軟件用于數(shù)據(jù)作圖分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間數(shù)據(jù)差異分析采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長。給藥處理后，與對(duì)照組比較，陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），但增長速率降低；與模型組比較，陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟指數(shù)降低（P＜0.05）。詳見圖1、圖2。

2.2 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響

給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠TC、TG和LDL-C水平升高（P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠TC、TG和LDL-C水平降低（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px水平均降低（P＜0.05），MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px水平均升高（P＜0.05），MDA水平降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.4 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠炎癥水平的影響

給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組、高PCA組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低（P＜0.05）。詳見圖3。

2.5 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織中HMGCR和SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織中HMGCR和SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織中HMGCR和SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。詳見圖4。

2.6 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織病理的影響

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，無病理狀態(tài)，肝細(xì)胞內(nèi)也無脂肪滴分布。模型組大鼠肝臟組織病變嚴(yán)重，細(xì)胞混亂排列，肝細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量多、體積大的透明空泡，主要為脂肪滴，同時(shí)出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤。陽性組大鼠肝臟組織病變程度較輕，細(xì)胞排列較為整齊，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量的脂肪滴。與模型組比較，低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織病變程度降低，也未發(fā)現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞漿內(nèi)也出現(xiàn)部分大小不一的透明空泡，但數(shù)量和分布密度比模型組低，同時(shí)高PCA病變程度也更輕。詳見圖5。

2.7 原兒茶酸對(duì)高脂血癥大鼠MAPK通路的影響

給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組、陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織中p38MAPK、ERK和JNK蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、低PCA組和高PCA組大鼠肝臟組織中p38MAPK、ERK和JNK蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.05）。詳見圖6、圖7。

3 討 論

高脂血癥作為一種全身性的代謝疾病，已被證明是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和腦卒中等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。高脂血癥發(fā)生可能存在先天性遺傳的因素，如家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H）；而更多的是受到年齡、不良飲食和作息習(xí)慣、精神和情緒活動(dòng)以及其他未知環(huán)境因素的影響引發(fā)血脂異常導(dǎo)致的^［2］。目前臨床上以血清中脂質(zhì)指標(biāo)（TG、TC、LDL-C和HDL-C）其中有異于正常值的，可初步認(rèn)定為高脂血癥^［13］，而對(duì)于高脂血癥的治療效果的判斷也多是參考該4項(xiàng)指標(biāo)的變化。薛婧^［14］通過聯(lián)合用藥治療高脂血癥老年病人，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后病人TC、TG和LDL-C水平降低，而HDL-C水平明顯升高；而Saadat等^［15］也通過TG、TC、LDL-C和HDL-C水平的變化來確定高脂血癥大鼠模型構(gòu)建成功與否。本研究中，首先在建模第2周檢測(cè)大鼠尾血中脂質(zhì)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TG、TC和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，表示高脂血癥大鼠模型構(gòu)建成功。通過給予降脂藥物阿伐他汀鈣和不同濃度原兒茶酸治療后，相較于模型組，接受藥物治療的大鼠血清中TG、TC和LDL-C水平均明顯降低，HDL-C水平明顯升高，表明原兒茶酸具有潛在的降低脂質(zhì)指標(biāo)功能。

臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，代謝疾病的發(fā)生發(fā)展多與自由基代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)紊亂密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體內(nèi)血脂水平升高時(shí)，細(xì)胞和組織中多不飽和脂肪酸容易受到自由基的攻擊而引發(fā)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，最終導(dǎo)致代謝異常^［16］。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷和破壞作用^［17］。SOD和GSH-Px作為機(jī)體內(nèi)的抗氧化成員，都具有清除氧自由基的作用^［18］。原兒茶酸已在過往的研究中被證明具有優(yōu)良的抗氧化和抗炎癥能力，王麗惠等^［19］研究發(fā)現(xiàn)原兒茶酸能夠提高免疫性肝損傷小鼠肝組織中內(nèi)源性抗氧化酶活力，以及增強(qiáng)對(duì)氧自由基的清除能力。本研究中，高血脂模型大鼠血清和肝臟中SOD和GSH-Px水平均降低，且MDA水平升高，說明高脂飲食引發(fā)的機(jī)體血脂水平異常導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平升高。給予原兒茶酸治療后，大鼠血清和肝臟中SOD和GSH-Px水平均升高，且MDA水平降低，說明大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程受到抑制調(diào)控，這也進(jìn)一步證實(shí)了原兒茶酸的抗氧化能力。

近年來，原兒茶酸的抗炎作用研究報(bào)道逐漸增多，潘敏等^［4］研究發(fā)現(xiàn)原兒茶酸可以抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并抑制血管生成；Zhang等^［20］研究結(jié)果顯示，原兒茶酸能夠降低3T3-L1細(xì)胞中的炎癥水平。本研究中，模型組大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高，表明高脂飲食引發(fā)大鼠機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。給予原兒茶酸治療后，大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低，表明原兒茶酸一定程度上抑制了大鼠機(jī)體內(nèi)炎癥水平。同時(shí)通過對(duì)大鼠肝臟組織進(jìn)行HE染色分析病理變化發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)模型組大鼠的肝臟組織出現(xiàn)明顯的嚴(yán)重病變，由于機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞和組織中脂質(zhì)氧化變性，形成大量脂質(zhì)空泡，還伴有炎性細(xì)胞浸潤。給予原兒茶酸治療的大鼠，肝臟組織病變程度降低，脂質(zhì)空泡的比例明顯降低，提示原兒茶酸影響了高脂血癥大鼠的肝臟組織病變進(jìn)程。

HMGCR是體內(nèi)肝臟中催化膽固醇合成的限速酶，直接關(guān)系膽固醇的合成速度和機(jī)體內(nèi)含量^［21］。 SREBP2是體內(nèi)膽固醇合成和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子^［22］。Hu等^［23］研究顯示，阿托伐他汀酯可能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號(hào)通路和HMGCR基因的表達(dá)來改善高脂血癥大鼠的代謝紊亂。Shimano等^［24］研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平降低時(shí)，調(diào)節(jié)因子SREBP2會(huì)促進(jìn)HMGCR表達(dá)水平升高，進(jìn)而上調(diào)膽固醇的合成水平。本研究中，高脂血癥大鼠給予原兒茶酸治療后，肝臟組織中HMGCR和SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低。由此推測(cè)原兒茶酸有效下調(diào)了大鼠肝組織中SREBP2的表達(dá)水平，進(jìn)而降低了膽固醇合成限速酶HMGCR及其他相關(guān)基因的表達(dá)，從而表現(xiàn)出降低血脂水平的功能。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路與脂類代謝疾病（如脂肪肝）存在緊密關(guān)系，Nandipati等^［10］認(rèn)為非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生發(fā)展可能與MAPK信號(hào)通路被磷酸化激活有關(guān)，如JNK和p38MAPK等亞型通路被激活后會(huì)引發(fā)脂質(zhì)合成和分解相關(guān)蛋白的表達(dá)異常而最終發(fā)病。有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MAPK通路的激活，可以降低NAFLD大鼠肝細(xì)胞中炎癥反應(yīng)水平，調(diào)節(jié)大鼠機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的紊亂情況。本研究中，高脂血癥模型大鼠的肝臟組織中p38MAPK、ERK和JNK蛋白磷酸化水平均升高，通過給予原兒茶酸治療后，大鼠肝臟組織中p38MAPK、ERK和JNK蛋白磷酸化水平均明顯降低。說明高脂血癥的發(fā)生發(fā)展與MAPK信號(hào)通路的過度激活有關(guān)，而原兒茶酸能夠一定程度上抑制MAPK信號(hào)通路上p38MAPK、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而改善高脂血癥的病理進(jìn)展。

綜上所述，原兒茶酸可有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，抑制肝臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥損傷，可能通過MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝水平，進(jìn)而發(fā)揮改善高脂血癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的功能。

參考文獻(xiàn)：

［1］ STEWART J，MCCALLIN T，MARTINEZ J，et al.Hyperlipidemia［J］.Pediatrics in Review，2020，41（8）：393-402.

［2］ 劉燕紅.中國人群高脂血癥遺傳風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境因素調(diào)查［D］.合肥：安徽大學(xué)，2017.

［3］ 李洪銘，謝曉瑩，陳振華，等.中藥降血脂機(jī)制研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2021，33（7）：37-40.

［4］ 潘敏，王曉莉，胡婷，等.原兒茶酸對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠炎癥反應(yīng)及血管生成的作用機(jī)制研究［J］.河北醫(yī)學(xué)，2023，29（1）：81-85.

［5］ ZHANG J L，F(xiàn)U B，CHEN X L，et al.Protocatechuic acid attenuates anterior cruciate ligament transection-induced osteoarthritis by suppressing osteoclastogenesis［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2020，19（1）：232-240.

［6］ SEMAMING Y，KUMFU S，PANNANGPETCH P，et al.Protocatechuic acid exerts a cardioprotective effect in type 1 diabetic rats［J］.The Journal of Endocrinology，2014，223（1）：13-23.

［7］ TAKEUCHI O，AKIRA S.Pattern recognition receptors and inflammation［J］.Cell， 2010，140（6）：805-820.

［8］ WANG D L，WEI X Y，YAN X，et al.Protocatechuic acid， a metabolite of anthocyanins， inhibits monocyte adhesion and reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（24）：12722-12728.

［9］ ASL E R，AMINI M，NAJAFI S，et al.Interplay between MAPK/ERK signaling pathway and microRNAs：a crucial mechanism regulating cancer cell metabolism and tumor progression［J］.Life Sciences，2021，278：119499.

［10］ NANDIPATI K C，SUBRAMANIAN S，AGRAWAL D K.Protein kinases： mechanisms and downstream targets in inflammation-mediated obesity and insulin resistance［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2017，426（1/2）：27-45.

［11］ LAWAN A，BENNETT A M.Mitogen-activated protein kinase regulation in hepatic metabolism［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，2017，28（12）：868-878.

［12］ KHAN R S，BRIL F，CUSI K，et al.Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatology，2019，70（2）：711-724.

［13］ 李庚，曹文聰，譚俊，等.中醫(yī)藥治療高脂血癥臨床研究中復(fù)合結(jié)局指標(biāo)應(yīng)用情況分析［J］.中醫(yī)雜志，2022，63（11）：1037-1042.

［14］ 薛婧.脂必泰膠囊聯(lián)合普羅布考治療高脂血癥臨床研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2023，38（2）：346-349.

［15］ SAADAT S，BOSKABADY M H.Anti-inflammatory and antioxidant effects of rosuvastatin on asthmatic，hyperlipidemic，and asthmatic-hyperlipidemic rat models［J］. Inflammation，2021，44（6）：2279-2290.

［16］ 張森，洪芬芳，楊樹龍.肝脂質(zhì)代謝與動(dòng)脈粥樣硬化治療［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2021，31（8）：122-127.

［17］ 吳瑾，李寧，宋囡，等.基于脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)線粒體能量損傷的痰阻氣機(jī)與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系探討［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2021，32（2）：408-411.

［18］ LIAO C Y，WU L Y，ZHONG W T，et al.Cellular antioxidant properties of Ischnoderma resinosum polysaccharide［J］.Molecules，2022，27（22）：7717.

［19］ 王麗惠，張佳祥，劉雙平，等.原兒茶酸對(duì)刀豆蛋白A所致的免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、NO、SOD和GSH-Px表達(dá)的影響［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2021，24（3）：323-326.

［20］ ZHANG Q Z，GONZALEZ DE MEJIA E.Protocatechuic acid attenuates adipogenesis-induced inflammation and mitochondrial dysfunction in 3T3-L1 adipocytes by regulation of AMPK pathway［J］.Journal of Functional Foods，2020，69：103972.

［21］ LU X Y，SHI X J，HU A，et al.Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis［J］.Nature，2020，588（7838）：479-484.

［22］ OTENG A B，KERSTEN S.Mechanisms of action of trans fatty acids［J］.Advances in Nutrition，2020，11（3）：697-708.

［23］ HU N，CHEN C Y，WANG J H，et al.Atorvastatin ester regulates lipid metabolism in hyperlipidemia rats via the PPAR-signaling pathway and HMGCR expression in the liver［J］.International Journal of Molecular Sciences，2021，22（20）：11107.

［24］ SHIMANO H，SATO R.SREBP-regulated lipid metabolism： convergent physiology-divergent pathophysiology［J］.Nature Reviews Endocrinology，2017，13（12）：710-730.

（收稿日期：2023-04-16）

（本文編輯 王麗）