本篇報道圍繞2022年度上海市自然科學(xué)獎一等獎項目“非人靈長類模式動物構(gòu)建”展開。

該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心研究員孫強領(lǐng)銜完成。

“拔一根毫毛，吹出猴萬個！”《西游記》小說中的這一情節(jié)生動地展示了什么是“克隆”。

克隆，可以通俗地被理解成“拷貝”，“像是復(fù)印出來”一個或一個個完全相同的個體、單元。

而這與“龍生九子”截然不同：克隆，跳過了兩性生殖過程，也跳過了前者可能發(fā)生的遺傳物質(zhì)的組合或

變異。

生命的繁衍，還掌握在上帝，或是神靈手中嗎？

2017年，一個世界級成果——全球首例體細胞克隆猴在中國誕生。相關(guān)論文于2018年1月25日在國際學(xué)術(shù)期刊《細胞》（Cell）上在線發(fā)表。這一消息當(dāng)時就激起了整個學(xué)術(shù)圈和科研界。

此前，全球科學(xué)家經(jīng)過數(shù)十年的努力，一直未能攻克非人靈長類動物體細胞克隆的難題。直到兩只體細胞克隆猴“中中”“華華”誕生。

對這一技術(shù)的攻克，意味著人類可以借助克隆猴技術(shù)，揭開更多生命科學(xué)的奧秘，比如靈長類的發(fā)育、大腦以及多種疾病相關(guān)難題。但即便到了今天，體細胞克隆猴技術(shù)依然存在瓶頸，成功率依然不高。

“我們做克隆的目標(biāo)是為了更好地構(gòu)建非人靈長類模式動物?！睂O強說。

為什么需要克隆猴？

在克隆猴誕生前，猴子也被用于轉(zhuǎn)基因或藥物測試等研究。這些猴子都是由受精卵發(fā)育來的。

“但它有一個問題，就是做出來基因型是不同的，每只猴子之間的遺傳背景也不同?！睂O強表示，“再舉個例子，比如說用考試去篩選一群學(xué)生，我們要給這些學(xué)生同樣的考卷，對不對？我們篩藥也是一樣的，你這個待‘考試’的藥物好不好，你得用同樣的試卷，這樣才能減少樣本間的誤差。否則100個人參加考試，有100張不同的考卷，你怎么評價誰的水平高，誰的水平低？考卷就是這些‘猴子’，做考卷的就是這些藥。這些猴模型，比如說基因編輯和轉(zhuǎn)基因的，它們的基因型不同，致病基因可能表達水平就有差異，遺傳背景也會產(chǎn)生影響，那么就把要研究的問題復(fù)雜化了?？寺〖夹g(shù)正好可以解決這一難題，讓它們遺傳背景一致，基因型一致。這樣就能夠讓它真正變成模式動物。所謂模式？就是用一個模子刻出來的?！?/p>

克隆猴提供了幾乎完美的模型。猴是靈長類，是生命演化中最接近人的動物。

“比如，如果我有一批A基因突變的猴子，其他所有背景都一樣，只是A基因有差異，如果跟對照相比，一個藥物能夠緩解A基因突變導(dǎo)致的癥狀，那么就可以確認這個藥是對的。”孫強說。

除了測試藥物，威力更強大的是，基于這一幾乎完美的動物模型，人們可以進行新藥物的研發(fā)，以及探索生命科學(xué)的未知疆域。

其實，“克隆”無處不在。植物的無性繁殖，比如插條、嫁接、落葉生根等，都是“克隆”。人類也在很早就開始嘗試克隆各種動物。但非人靈長類動物，比如猴子的克隆，始終是個難題。

早在20世紀(jì)初，德國動物學(xué)家、實驗胚胎學(xué)先驅(qū)漢斯 · 斯佩曼（Hans Spemann）已經(jīng)使用胚胎分裂技術(shù)克隆出了蠑螈。

胚胎分裂技術(shù)作為早期探索階段的技術(shù)，當(dāng)然是不完美的，它的效率很低，因而沒有成為動物克隆領(lǐng)域研究的主要方向。孫強表示：“你可能在二細胞期或四細胞期分離，你最多也就分離出4個細胞。假如全部都變成個體，最多也就變成4個個體。但實際上，四細胞期有時候也就出生存活一個或者兩個，所以說目前胚胎級克隆的克隆數(shù)有限。而體細胞克隆，理論上是無限的?！?/p>

所以現(xiàn)代的動物克隆技術(shù)的主流是“核移植”——給卵母細胞（卵細胞）換一個細胞核。同樣因為胚胎細胞在數(shù)量上的局限性，其中翹楚還是體細胞的核移植。一個細胞核，對應(yīng)著克隆后代的一個小生命。

1928年，斯佩曼嘗試將蠑螈胚胎細胞核轉(zhuǎn)移到卵細胞中，雖然最終沒有克隆成功，卻是“移核”的首次實踐。

1962年，英國牛津大學(xué)的科學(xué)家約翰 · 戈登（John Gurdon）將非洲爪蟾腸上皮細胞的細胞核移植到蛙卵細胞里，并培養(yǎng)出蝌蚪。其實驗成功率只有2%。

1996年，克隆羊多利誕生。277次核移植，只產(chǎn)生29個胚胎，最后有且只有多利幸運地出生了，這個成功率比非洲爪蟾的2%還低。但多利的誕生，打破了“體細胞無法分化”的成見。

隨后，豬、牛、狗等動物的體細胞核移植克隆都被實現(xiàn)。但克隆猴一直“胎死腹中”。

克隆猴不僅僅是為了克隆猴?？寺『镎Q生之初，研究團隊負責(zé)人蒲慕明院士和孫強研究員說，制備克隆猴不是為了獵奇，更不是為了克隆人，而是為了建立非人靈長類疾病動物模型，為研究人類疾病機制和藥物研發(fā)帶來希望。

愚公“移核”與克隆猴的瓶頸

在體外人工構(gòu)建一個生命體，何其難？生命的繁衍過程太復(fù)雜了。

“挑戰(zhàn)太多了！”孫強說，“不用說培養(yǎng)一只猴子，就是從胚胎，不依賴任何母體，直接培養(yǎng)出一只老鼠，那都是非常震撼的事情，意味著（哺乳動物）生命可以在體外培育了，那是真正的試管了?！?/p>

他表示，目前，早期胚胎的所有發(fā)育還沒完全搞清楚，子宮是怎么保證胎兒營養(yǎng)的，器官在子宮內(nèi)是怎么分化的，什么誘導(dǎo)了器官的對稱發(fā)育……沒有回答的問題太多了?！半x開子宮還做不到，你怎么模擬一個子宮的環(huán)境？早產(chǎn)兒，畢竟在母體里待到250天或者更長時間，接近出生，各個器官都發(fā)育完成了，但是要真正變成從一個受精卵一個細胞開始完全培養(yǎng)、發(fā)育長出來很難。如果那個能做出來，遠比克隆要震撼得多！”

所以，現(xiàn)在要克隆猴，還是要“借腹”：依靠卵母細胞，以及其他沒有提供卵母細胞的雌猴“代孕”。

構(gòu)建一個重組細胞，激活，移植到代孕雌猴子宮內(nèi)，然后待產(chǎn)。

孫強介紹，2003年，美國匹茲堡大學(xué)的杰瑞 · 沙騰（Gerald Schatten）教授依靠美國俄勒岡靈長類中心，曾經(jīng)一次性做了700多枚卵，然后移植到30多只猴子體內(nèi)，最后都沒成功，他當(dāng)時很失望。俄勒岡靈長類中心的另一位教授——舒克拉特 · 米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）覺得這可能是技術(shù)問題。2007年，他接受一個雜志的采訪，說他已經(jīng)用了1.5萬枚卵來做這只猴子。到2010年的時候，他發(fā)了一篇論文，就是把克隆胚胎移到10只猴子體內(nèi)，但是只有1只懷孕，而且懷孕到81天，這只猴子就流產(chǎn)了。

“我們總共用了接近5年時間去解決這些問題，前邊都是失敗，最大的失敗出現(xiàn)在2017年的8月?！薄?月的時候，我們就得到了兩只克隆猴，一只在140多天的時候生出來，活了3個小時，沒有肺呼吸，死掉了；另一只活了30個小時也死掉了。那個時候我們的失望達到了極點，就像買彩票，彩票中獎號碼是10個，第1個號碼到第9個號碼都是對的，然后到第10個號碼突然錯了?！?/p>

從失敗中走出來，2017年年底，他們終于成功做出了克隆猴。

孫強介紹：“實際上，體細胞很小。猴子的卵母細胞直徑110微米，很大，體細胞直徑大概就十幾個微米。我們沒有取核，它帶的細胞器和線粒體也很少。我們是直接把整個體細胞融合進去了。我們檢測過，華華細胞中來自供體體細胞的線粒體接近20%，中中的大約不到3%?！?/p>

“現(xiàn)在的問題是，克隆的效率還是很低的。猴子體細胞的表觀重建的機制，以及早期胚胎的表觀遺傳學(xué)變化還不清楚。我覺得，最主要的，也是首先要做的，是把猴子的表觀遺傳學(xué)機制解析清楚，在此基礎(chǔ)上，真正提升體細胞克隆的效率——希望能把現(xiàn)在大概3%左右的水平，提升到10%或以上?！?/p>

孫強說：“在2024年年初，我們發(fā)了一篇文章，在克隆恒河猴時，我們解決了胎盤的發(fā)育問題，通過滋養(yǎng)層細胞置換，把重構(gòu)效率從2%提升到9%左右，提升了4倍多。”

孫強表示，克隆不是一個自然發(fā)育的過程，要打破很多障礙。通過這個克隆過程，人們可以了解胚胎早期發(fā)育，尤其表觀遺傳學(xué)層面的生物學(xué)機制，這也是對生命的認識。

目前，孫強團隊正在用多組學(xué)和測序的方法來分析細胞基礎(chǔ)表觀的變化是什么樣的、克隆時什么樣，來觀察各種調(diào)控過程的振蕩。

科研三階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

“有人跟我聯(lián)系，說他養(yǎng)的寵物狗不行了，能不能把它克隆出來。這太簡單了，國內(nèi)有公司在做。我做的是克隆猴?！睂O強說。

在一次演講中，孫強提到他研究歷程中的三個階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

他說，在云南省的西雙版納州瀾滄江畔的一座山上，他工作了4年，一直待到2008年。

那是一個973國家重點研發(fā)項目，他接手的時候，項目已經(jīng)執(zhí)行了一半。因為2001年轉(zhuǎn)基因猴技術(shù)體系已經(jīng)建立了，所以項目的目標(biāo)是希望做出轉(zhuǎn)基因猴。他是半途去的，目標(biāo)是至少要做出試管猴，如果能做出轉(zhuǎn)基因猴更好。

他記得非常清楚，2007年立春的2月4日當(dāng)天，他們就做出了中國第一只試管猴，之后又做了十幾只猴子，但是很遺憾，沒有一只是轉(zhuǎn)基因陽性的。項目結(jié)束以后，由于沒有資金的支持，他從山上撤回來了。

回來以后，在上海待了半年多。很幸運，一個機會出現(xiàn)了。中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所（簡稱神經(jīng)所）的蒲慕明先生找到他，讓他繼續(xù)研究猴子。

這次是蘇州太湖的西山島，上面有一個很大的猴場，1萬多只猴子，他就到島上去陪猴子了。

在孫強的講述里，工作人員要做的一件事情是要看猴子的月經(jīng)。島上實驗室大概有1000多只猴子，每年看猴子的月經(jīng)累計要看5萬多次。每次猴子“超排卵”都要打針，從月經(jīng)來的第一天開始，一般要打12天，一天打2針。

孫強介紹，小白鼠連續(xù)20代近交，得到近交系，即遺傳背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，連續(xù)20代也就頂多10年時間，這件事在20世紀(jì)初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟時間、傳代時間要5年，做20代就要100年，“沒人能做得成”。這就是人們?yōu)槭裁葱枰寺『铩炔黄疬@

100年。

在世界首個體細胞克隆猴成果新聞發(fā)布會的報告中，孫強表示，體細胞克隆總結(jié)下來有4個節(jié)點：構(gòu)建胚胎、激活胚胎、啟動核基因組、著床后發(fā)育。除了最后一個節(jié)點無法控制，前3個節(jié)點都可以干預(yù)。只不過，每一個節(jié)點都是一座“大山”。

起初，團隊里其他成員都是獸醫(yī)，包括取卵在內(nèi)的大部分精密實驗操作都由孫強一人承擔(dān)，即使在2010年國慶假期，孫強在雨夜騎車出車禍、鎖骨骨折，他也忍著劇痛花十天做完原定的取卵實驗才住院手術(shù)。絕大多數(shù)時候，大多數(shù)目標(biāo)都不值得以健康為代價的投入，但在該項卓絕的研究面前，孫強認為他必須這么做。幸運的是，研究生劉真在同一年加入孫強帶領(lǐng)的靈長類研究平臺，次年（2011年）開始島上的生活，很快成為團隊的骨干，分擔(dān)了壓力。

劉真花了兩年練習(xí)并優(yōu)化構(gòu)建胚胎的流程，“剛開始是在小鼠卵母細胞上練習(xí)，差不多連續(xù)三四個月每天練習(xí)8到10個小時”。后來轉(zhuǎn)到了更難的猴細胞上精進磨練，眼睛看著顯微鏡，兩只手操作，腳也要同時操縱任務(wù)?！吧锊煌谖锢砗蛿?shù)學(xué)，既要動腦，也要動手?！闭f起當(dāng)時選擇生物技術(shù)作為大學(xué)專業(yè)的原因，劉真這么回答。但他當(dāng)時應(yīng)該沒想過，在未來還要動腳。手腳并用地練到了2014年底，劉真的實驗操作爐火純青，去一個核平均只要10秒，而注入核同樣用時甚短。

孫強主任說：“我們的團隊成員可以做到15秒內(nèi)實現(xiàn)體細胞注入操作，只有精湛的技術(shù)才可以保證對卵母細胞損傷最??；另外體外時間越短，損傷也越小?！眲⒄娌┦坎皇菆F隊唯一一個如此付出、如此熟練的人，后來神經(jīng)所有一支能熟練操作細胞核移植的隊伍。

體細胞克隆的研究就是這樣，大部分時間都在漫長的等待和重復(fù)的實驗中度過。重復(fù)的實驗不僅是一種體力活。劉真說：“其實并不是大家理解的，你每天坐在那兒苦練就行，更重要的是，要在這過程中不斷調(diào)試和尋找更好的技術(shù)方法和流程?！倍黄频膶崿F(xiàn)，靠的就是在每一個環(huán)節(jié)試錯，在每個動作細節(jié)中摳出百分之幾的改進空間，累積而成。

為了提高激活胚胎的成功率，團隊嘗試了多種激活條件，一開始使用只有13%囊胚率的離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）。后來使用組蛋白乙?；敢种苿┨幚?，囊胚率提高到16%。效仿2014年一篇文章的條件，用組蛋白3賴氨酸9三甲基化（H3K9me3）去甲基化酶（Kdm4）處理后，囊胚率升到45%。

團隊還嘗試了不同的體細胞，因為不同來源的細胞成功率不同。最后他們發(fā)現(xiàn)成纖維細胞是最好的選擇，也正是用成纖維細胞核，克隆出了中中和華華。

孫強表示，他覺得克隆猴“中中”“華華”只是個新起點，他希望在這個基礎(chǔ)上能做更好的模式動物?！白非笳胬?，保持好奇心。我還要感謝一下我的家人，因為這些年跟猴子在一起的時間，比跟他們在一起的時間都多。”