摘要：四川某飼養(yǎng)單位于2022年7月起陸續(xù)發(fā)現(xiàn)環(huán)尾狐猴開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、不好動(dòng)、食欲廢絕等癥狀，且病程短、死亡率較高。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷為弓形蟲(chóng)感染，選擇林可霉素、螺旋霉素、磺胺類等藥物進(jìn)行防治，取得了一定的治療效果。

關(guān)鍵詞：環(huán)尾狐猴；弓形蟲(chóng)；檢測(cè)；診斷；治療

環(huán)尾狐猴（Lemur catta）屬于原始靈長(zhǎng)類，分布于非洲馬達(dá)加斯加島南部和西部的干燥森林中，生活在疏林裸巖地帶。環(huán)尾狐猴被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》CITES附錄Ⅰ中。其性情溫和，身體背部的毛呈淺灰褐色，腹部為灰白色，額部、耳背和頰部為白色，與黑色的吻部和眼圈構(gòu)成了鮮明的對(duì)比色彩，十分有趣。很多動(dòng)物園和萌寵樂(lè)園都飼養(yǎng)有環(huán)尾狐猴。四川某飼養(yǎng)單位于2022年7月陸續(xù)發(fā)現(xiàn)環(huán)尾狐猴開(kāi)始發(fā)病，多數(shù)出現(xiàn)精神萎靡、不好動(dòng)、食欲廢絕、體溫升高或體溫變化不明顯，有些病程很短就死亡，取死亡動(dòng)物組織實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷為弓形蟲(chóng)感染，經(jīng)治療和預(yù)防投藥，取得一定效果。

1 發(fā)病情況

2022年7月5，飼養(yǎng)人員發(fā)現(xiàn)一亞成體環(huán)尾狐猴出現(xiàn)精神萎靡、不好動(dòng)、食欲廢絕、體溫升高，血液常規(guī)和生化無(wú)明顯異常，經(jīng)治療無(wú)效死亡，取該動(dòng)物血液及死亡后心、肝、脾、肺、腎做弓形體抗原核酸檢測(cè)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性。7月21日、7月27日相繼又有環(huán)尾狐猴發(fā)病，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合臨床特征，按照弓形蟲(chóng)感染進(jìn)行治療，7月21日發(fā)病的環(huán)尾狐猴，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)20 d的治療，動(dòng)物逐漸康復(fù)，7月27日發(fā)病個(gè)體治療無(wú)效死亡。

2 材料與方法

2.1 樣品采集及處理

血液樣本采集自發(fā)病環(huán)尾狐猴個(gè)體。在麻醉的情況下，使用含有EDTA的采血管從待測(cè)動(dòng)物后肢靜脈中采集全血樣本，分裝后至4 ℃保存至血漿分離及DNA提取。收集死亡動(dòng)物剖檢后心、肝、脾、肺、腎等組織樣本進(jìn)行組織病理切片及DNA提取。血液樣本DNA提取試劑盒采用QIAGEN的QIAamp DNA Blood Mini Kit；組織樣本DNA提取試劑盒采用QIAGEN的Blood & Tissue Kit；PCR預(yù)混液（包括DNA聚合酶，10×Buffer，dNTP等）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，DL2000 DNA Marker購(gòu)自Biosharp公司。

2.2 血清抗體檢測(cè)

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和改良凝集試驗(yàn)（modified agglutination test，MAT）對(duì)血漿樣本中弓形蟲(chóng)抗體IgG進(jìn)行檢測(cè)。ELISA試劑盒購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司，MAT試劑盒購(gòu)自美國(guó)田納西大學(xué)研究基金會(huì)，實(shí)驗(yàn)使用96孔U型板進(jìn)行，血漿樣本按1∶25～1∶200連續(xù)稀釋。具體實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果判定參照商用試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。當(dāng)MAT和ELISA結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，判斷檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，反之則為陰性；當(dāng)MAT與ELISA結(jié)果不同時(shí)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若結(jié)果仍不相同，則判斷結(jié)果為疑似陽(yáng)性。

2.3 抗原核酸檢測(cè)

參照Homan等[1]報(bào)道的弓形蟲(chóng)529 bp重復(fù)序列（AF146527.1），對(duì)提取的環(huán)尾狐猴組織及血液DNA進(jìn)行弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)，使用引物對(duì)：上游引物529ToxoF（5'-CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'）和下游引物529ToxoR（5'-CTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 ？滋L，其中包括12.5 ？滋L的PCR預(yù)混液（Dream Taq Green MM），8.5 ？滋L的雙蒸水，50 ？滋mol/L上下游引物各1 ？滋L，DNA模板2 ？滋L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火65 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析（120 V，35 min）。

3 結(jié)果與診斷

3.1 剖檢與病理組織切片分析

死亡動(dòng)物剖檢主要病變是肺充血、出血，胸腔積液增多，多數(shù)發(fā)病急的動(dòng)物組織器官剖檢無(wú)明顯肉眼所見(jiàn)病變。死亡動(dòng)物組織切片主要表現(xiàn)為肺組織出血、淤血、充血，肝細(xì)胞水腫、變性、多灶性壞死、肝細(xì)胞膽汁淤積，心臟灶區(qū)心肌纖維波浪樣變，腸系膜淋巴結(jié)凝固性壞死，其他組織病理變化不明顯。不同死亡個(gè)體組織病變也不完全相同，多數(shù)死亡動(dòng)物均有肺組織病變。

3.2 血清學(xué)檢查結(jié)果

對(duì)采集到的環(huán)尾狐猴血液樣本使用MAT和ELISA進(jìn)行弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，采集環(huán)尾狐猴血液樣本為弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性，其中MAT結(jié)果效價(jià)為1∶50。

3.3 PCR檢測(cè)及陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序

對(duì)提取的組織樣本DNA及血液樣本DNA進(jìn)行弓形蟲(chóng)529序列進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，環(huán)尾狐猴內(nèi)臟組織樣本均為弓形蟲(chóng)PCR陽(yáng)性（圖1），血液樣本弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性（圖2）。將陽(yáng)性樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，并將獲得的序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為弓形蟲(chóng)的529 bp重復(fù)序列。

3.4 診斷結(jié)果

根據(jù)病史、臨床癥狀、剖檢、病理組織切片和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，確診環(huán)尾狐猴死亡個(gè)體患有弓形蟲(chóng)病。

4 治療和預(yù)防

動(dòng)物發(fā)病后，通過(guò)靜脈及時(shí)補(bǔ)充電解質(zhì)和能量，早期選用磺胺類和林可霉素聯(lián)合進(jìn)行治療，病情緩解后，再用磺胺類藥物進(jìn)行鞏固治療。其中，7月21日發(fā)病的環(huán)尾狐猴完全康復(fù)，但也有動(dòng)物發(fā)病急，治療效果不明顯。發(fā)病高峰期，對(duì)其他猴群交替投喂磺胺類和螺旋霉素，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生消毒，加強(qiáng)滅鼠，制止流浪貓進(jìn)入動(dòng)物獸舍，整體情況得到控制，但動(dòng)物體內(nèi)弓形蟲(chóng)包囊殺滅和清除，存在反復(fù)感染的情況。

5 轉(zhuǎn)歸與預(yù)后

目前治療弓形蟲(chóng)的藥物有限，大多藥物具有毒副作用強(qiáng)的特點(diǎn)，用藥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，動(dòng)物機(jī)體會(huì)受到的影響比較大，需要很長(zhǎng)時(shí)間才能消除藥物副作用帶來(lái)的影響。發(fā)病急或發(fā)現(xiàn)比較晚的病例治療效果很不理想。

6 討論

該養(yǎng)殖單位環(huán)尾狐猴感染弓形蟲(chóng)的情況與國(guó)內(nèi)外資料報(bào)道的情況相似或相同，無(wú)論是臨床癥狀還是病理變化都基本吻合，且發(fā)病率和死亡率均很高[2-4]。充分說(shuō)明，環(huán)尾狐猴對(duì)弓形蟲(chóng)高度易感，該病對(duì)環(huán)尾狐猴種群影響非常大，提醒各動(dòng)物園、萌寵樂(lè)園或其他環(huán)尾狐猴飼養(yǎng)單位，做好弓形蟲(chóng)的防控任務(wù)十分緊迫。

按照當(dāng)前動(dòng)物疾病治療水平，可選擇的藥物大多為磺胺類、乙胺嘧啶、螺旋霉素、林可霉素、阿奇霉素等，藥物的副作用都比較大，再加上動(dòng)物體內(nèi)的弓形蟲(chóng)包囊難以殺滅及清除和/或疾病分期的問(wèn)題，其治療效果受限[5-6] 。今后在弓形蟲(chóng)敏感低毒藥物的篩選、弓形蟲(chóng)在環(huán)尾狐猴致病機(jī)理、治療方式方法、早期診斷和預(yù)防等方面加大研究力度，方可進(jìn)行有效防控。

弓形蟲(chóng)?。╰oxoplasmosis）是剛地弓形蟲(chóng)寄生于多種動(dòng)物和人的有核細(xì)胞內(nèi)引起的一種重要的人與動(dòng)物共患病。弓形蟲(chóng)宿主種類廣泛，幾乎所有的溫血?jiǎng)游锒伎赡艹蔀楦腥竟蜗x(chóng)的來(lái)源[7]。弓形蟲(chóng)可寄生在除紅細(xì)胞外的幾乎所有有核細(xì)胞內(nèi)，蟲(chóng)體整個(gè)生活史分為五個(gè)階段，分別是滋養(yǎng)期、包囊期、裂殖期、配子體和卵囊期。由于弓形蟲(chóng)病的臨床癥狀無(wú)明顯特異性，且多呈現(xiàn)隱性感染，故依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)難以作出診斷。目前弓形蟲(chóng)病主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷，主要方法有病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)[8]。

病原學(xué)檢查以從病料中直接查到速殖子或卵囊為確診標(biāo)準(zhǔn)。采用直接涂片或者組織切片、動(dòng)物接種和卵囊等檢查法，該檢查結(jié)果準(zhǔn)確，但由于檢出率低、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于大熊貓弓形蟲(chóng)病的快速檢測(cè)和流行情況調(diào)查；免疫學(xué)檢測(cè)是從血清或腦脊液內(nèi)檢測(cè)到特異性抗體是診斷弓形蟲(chóng)病應(yīng)用廣泛的重要輔助手段。主要方法包括染色試驗(yàn)（sabin-Feldman dye test，DT）、間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination test，IHA）、乳膠凝集試驗(yàn)（latrx agglutination test，LAT）、間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescent assay，IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等[9]。其中IHA特異性高、假陽(yáng)性率低、診斷價(jià)值高和操作簡(jiǎn)便；ELISA具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、受檢樣本多等特點(diǎn)，有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于弓形蟲(chóng)病的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種弓形蟲(chóng)病基因診斷方法，主要有LAMP、DNA探針和PCR技術(shù)等。目前用于弓形蟲(chóng)檢測(cè)的探針多為特異性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探針，但其制備需要一定條件，且費(fèi)用較高，不易推廣。PCR技術(shù)自建立以來(lái)，以其靈敏、特異、高效而成為一項(xiàng)目前廣為應(yīng)用的診斷技術(shù)。為提高試驗(yàn)的敏感性和特異性，在PCR基礎(chǔ)上，又發(fā)展了巢式PCR（nested PCR）、PCR-ELISA和RT-PCR技術(shù)，并在弓形蟲(chóng)病診斷中得以應(yīng)用[10]。

目前關(guān)于圈養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)的研究仍然知之甚少，已證實(shí)首要風(fēng)險(xiǎn)因素是攜帶弓形蟲(chóng)卵囊的貓科動(dòng)物，而動(dòng)物種屬、館舍開(kāi)放程度和飼養(yǎng)管理等因素在不同地區(qū)的非人靈長(zhǎng)類感染中的權(quán)重也有所差異[11]?，F(xiàn)有研究表明新世界靈長(zhǎng)類對(duì)弓形蟲(chóng)具有較高的易感性，且急性弓形蟲(chóng)病易導(dǎo)致其死亡[12]。獲得性弓形蟲(chóng)的常見(jiàn)傳播方式是經(jīng)口感染其組織包囊或卵囊，導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病和傳播，因此，加大滅鼠工作力度，加強(qiáng)流浪貓的管控，是控制或防止弓形蟲(chóng)病發(fā)生的重要手段。■

參考文獻(xiàn)：

[1] Homan W L，Vercammen M ， Braekeleer J D，et al.Identification of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment in Toxoplasma gondii， and its use for diagnostic and quantitative PCR.[J].International Journal for Parasitology， 2000， 30（1）：69-75.

[2] SUREAU P， RAYNAUD JP， LAPEIRE C， et al. Preimer isolement de Toxoplasma gondii a Madagascar toxoplasmose spontanée et expérimentale du Lemur catta[J]. Bull Soc Pathol Exot，1962， 55：357-362.

[3] SPENCER J A， JOINER K S， HILTON C D， et al. Disseminated toxoplasmosis in a captive ring-tailed lemur （Lemur catta） [J]. Journal of Parasitology， 2004， 90（4）： 904-906.

[4] 單芬，李康信，徐春忠，等.環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)的檢測(cè)與鑒定[J].野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2016， 37（2）：118-125.

[5] 孫曉敬，張磊，田甜，等.弓形蟲(chóng)病治療：從傳統(tǒng)藥物到納米藥物[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（5）：1834-1844.

[6] ZHANG Y， ZHANG Q， LI H， et al. In vitro and in vivo anti-Toxoplasma activities of HDAC inhibitor Panobinostat on experimental acute ocular toxoplasmosis[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2022，12：1002817.

[7] MONTOYA J G， LIESENFELD O. Toxoplasmosis. [J]. Lancet， 2004， 363：1965-1976.

[8] 高正琴.弓形蟲(chóng)快速鑒定及國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染調(diào)查[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2018，35（05）：40-45.

[9] 沈繼龍，余莉.我國(guó)弓形蟲(chóng)病我國(guó)弓形蟲(chóng)病流行概況及防治基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志，2019，31（1）：71-76.

[10] 王萌，王艷華，蔡志杰，張德林.弓形蟲(chóng)病的分子診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26（12）：1160-1162.

[11] 張述義.非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的研究概況[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)， 1998（1）：57-59.

[12] EPIPHANIO S， SINHORINI I L， CAT？魨O-DIAS J L. Pathology of toxoplasmosis in captive new world primates [J]. Journal of Comparative Pathology， 2003， 129（2-3）： 238-246.