摘要：本研究采用虎紅平板凝集試驗（RBT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT）、試管凝聚試驗（SAT）、免疫膠體金層析法（GICA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）檢測方法對327份奶牛血清和327份全乳進行奶牛布魯氏菌病檢測，以SAT為金標(biāo)準(zhǔn)，基于Kappa統(tǒng)計量評價不同檢測方法的靈敏度、特異度、符合率、一致性等相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，cELISA靈敏度、特異度、符合率、Kappa值最高，分別為100.00%、99.37%、99.39%、0.898，MRT各項指標(biāo)最差，但符合率在95%以上。研究表明5種檢測方法在靈敏度、特異度等方面各有優(yōu)缺點，但對于奶牛布魯氏桿菌病檢測均有重要應(yīng)用推廣價值。因此，要結(jié)合檢測需要采取多種方法綜合運用，以提高檢測準(zhǔn)確性，建議采用MRT、RBT和GICA初步篩選，對疑似患病奶牛再運用cELISA、SAT確診。研究為奶牛布魯氏桿菌病檢測方法應(yīng)用和凈化提供了技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：布魯氏桿菌?。谎鍖W(xué)；檢測；Kappa

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種可威脅公共衛(wèi)生安全和食品安全的嚴(yán)重人畜共患傳染病[1]。動物感染布魯氏菌后呈現(xiàn)急性或慢性經(jīng)過，通常表現(xiàn)母畜繁殖障礙和乳腺炎、公畜睪丸炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。人感染布魯氏菌病會引起流感樣癥候群及長期虛弱，嚴(yán)重危害人類健康和食品衛(wèi)生安全，是世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定通報的疾病，被我國列為二類動物傳染病[2-3]。

奶牛布魯氏菌病是奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中重點防控的疫病。加強監(jiān)測對于及時全面準(zhǔn)確了解奶牛布魯氏菌病流行趨勢，制定防控和凈化方案具有重要意義。動物布魯氏菌病實驗室檢測分為病原學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測和分子生物技術(shù)。病原學(xué)鑒定是檢測布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，但病原學(xué)鑒定操作較煩瑣、費時，且檢測環(huán)境生物安全要求較高。分子生物技術(shù)雖然靈敏度和特異性好，但試驗儀器昂貴，成本高，操作復(fù)雜，檢測人員專業(yè)要求，也難以在基層動物疫病防治中大面積推廣。血清學(xué)檢測方法快捷方便，操作比較簡單，靈敏度和特異性也較高，是目前動物布病檢測最常規(guī)的方法。我國《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T 18646—2018）》[5]重點規(guī)定了血清學(xué)檢測方法，其中包括虎紅平板凝集試驗（RBT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT）、試管凝聚試驗（SAT）、補體結(jié)合試驗（CFT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）。這些方法各有優(yōu)缺點和局限性，具體選擇何種方法，值得探討。本研究采用RBT、MRT、SAT、免疫膠體金層析法（GICA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）分別對奶牛布魯氏菌病檢測，并運用Kappa統(tǒng)計量檢驗5種方法一致性，以豐富奶牛布魯氏菌病檢測技術(shù)資料。

1 試驗材料與檢測方法

1.1 待檢樣本

2022年7月，選擇無乳房疾病健康泌乳奶牛327頭（受檢奶牛均未布魯氏菌疫苗免疫），每頭牛分別采集血清327份血清和全乳327份，對應(yīng)編號，牛血清樣本-20 ℃保存待檢，全乳室溫保存以備MRT檢測。

1.2 檢測試劑

RBT抗原，MRT抗原，SAT抗原，GICA檢測試紙，cELISA試劑盒，布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，均為上海快靈生物科技有限公司產(chǎn)品。所有檢測試劑在有效期內(nèi)使用。

1.3 檢測方法

按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T 18646—2018）》規(guī)定進行RBT、MRT、SAT、cELISA檢測和結(jié)果判定；其中，327份全乳用于MRT檢測，且當(dāng)日進行檢測，棄用腐敗、發(fā)酸全乳。GICA檢測試紙檢測按照試紙條說明書操作。

1.4 KAPPA統(tǒng)計量評價

Kappa是描述和評價診斷一致性比較理想的測量指標(biāo)，用來比較兩個或多個觀測者對同一事物，或者觀測者對同一事物的兩次或多次觀測結(jié)果是否一致，以由于機遇機會造成的一致性和實際觀測的一致性之間的差別大小作為評價基礎(chǔ)的統(tǒng)計指標(biāo)[6]。本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件計算4種檢測方法的Kappa統(tǒng)計量進行一致性檢驗，評價指標(biāo)和結(jié)果判斷采用配對設(shè)計的四表格列表。見表1。

靈敏度為評價檢測方法正確判定陽性結(jié)果一致性的指標(biāo)，以sen=A/P1×100%表示；特異度為反映檢測方法正確判定陰性結(jié)果一致性的指標(biāo)，以spe=D/N1×100%表示；漏診率為反映實際錯判為陰性的指標(biāo)，也稱為假陰性率，以p-=C/P1×100%表示；誤診率反映實際錯判為陽性的指標(biāo)，也稱為假陽性率，以p+=B/N1×100%表示；符合率反映總樣本結(jié)果的一致性，以coin=（A+D）/S×100%表示。Kappa=（PA-PE）/（1-PE），式中PA=（A+D）/S，PE=[（A+B）（A+C）+（B+D）（C+D）]/S2 。Kappa值介于﹣1～+1之間，一般說來，若Kappa≥0.75為一致性良好，0.40<Kappa<0.75為一致性中等，Kappa<0.4為缺乏一致性[7]。

2 結(jié)果

2.1 奶牛布魯氏菌病5種檢測陽性結(jié)果

MRT檢測327份全乳和RBT、SAT、GICA、cELISA分別檢測327份血清，陽性率介于2.75%～5.20%，SAT陽性率最低，GICA陽性率最高。見表2。

2.2 5種檢測方法一致性和相關(guān)性比較

《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》GB/T 18646—2018規(guī)定SAT、cELISA和CFT用于確診，未規(guī)定布魯氏菌病血清學(xué)檢測金標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究中選取SAT作為金標(biāo)準(zhǔn)，利用Kappa檢驗RBT、MRT、GICA、cELISA檢測方法與SAT一致性，同時評價它們相關(guān)性（靈敏度、特異度、誤診率、漏診率和符合率）。見表3。SAT與RBT、MRT、GICA、cELISA的符合率分別為98.47%、96.33%、97.86%、99.39%；cELISA靈敏度最高，為100%，漏診率最低，為0，對SAT檢出的9份陽性樣本，全部檢出，MRT靈敏度最低，為77.78%，漏診率最高，為22.22%，對SAT檢出的9份陽性樣本檢出7份；cELISA特異度最高，為99.37%，誤診率最低，為0.63%，對SAT檢測出318份陰性樣本，檢出316份；MRT特異度最低，為96.86%，誤診率最高為3.14%，對SAT檢測出318份陰性樣本，檢出310份。

利用Kappa統(tǒng)計量檢驗其他RBT、MRT、GICA、cELISA檢測方法與SAT方法的一致性，結(jié)果見表4。按照Kappa判斷標(biāo)準(zhǔn)，與SAT比較，RBT、MRT、GICA、cELISA的Kappa值中，MRT、GICA的Kappa值均<0.75，分別為0.519、0.691，而RBT、cELISA的Kappa值均>0.75，以GICA最高，為0.932。

3 討論

本研究中采用上述5種方法對327份奶牛血清和327份全乳檢測，奶牛布魯氏菌病陽性率結(jié)果均不相同，以SAT為最高，為5.20%，GICA最低，為2.75%。表明檢測方法、檢測者人為因素、其他偶然因素等影響了結(jié)果差異。陽性率高低不能說明檢測方法靈敏度、特異度，可能存在誤診、漏診情況，以及我國沒有規(guī)定檢測金標(biāo)準(zhǔn)，缺乏對比性，難以反映真實性。因此，需要對這5種方法運用Kappa檢驗它們的一致性、相關(guān)性。

本研究以SAT為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT與RBT、MRT、GICA、cELISA比較，符合率、靈敏度、特異度均以cELISA最高，分別為99.39%、100%、99.37%，表明與SAT檢測出的真陽性和真陰性比例最高，存在誤診和漏診的情況最少。MRT符合率、靈敏度、特異度均最低，分別為96.33%、77.78%、96.86%。從Kappa值看，cELISA最高，為0.898，表明一致性最高，MRT、GICA最低，表明一致性最差。綜上分析可以看出，cELISA各項指標(biāo)最佳。需明確指出，本研究是在SAT為金標(biāo)準(zhǔn)條件下進行Kappa檢驗一致性，盡管一定程度反映了每種方法的各項指標(biāo)高低，但研究用不同生產(chǎn)企業(yè)甚至不同批次的商品化試劑之間敏感性、特異性、符合率等都存在差異，存在診斷結(jié)果的多樣性和不確定性[1]。

RBT通過血清樣本中的布魯氏菌抗體與虎紅抗原結(jié)合，觀察是否產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，能夠快速、簡單地診斷動物布病，檢測敏感性較高，但是凝集時間、抗原的標(biāo)準(zhǔn)化影響其敏感性，易受到非特異性抗體的干擾，假陽性較多，常被用于基層現(xiàn)場大量樣品的布病初篩。SAT檢測原理是血清IgM抗體與布魯氏菌發(fā)生凝聚反應(yīng)，不易受其他干擾因子影響，特異性較強，陽性結(jié)果比較準(zhǔn)確，GB/T 18646—2018規(guī)定SAT可以作為確診檢測方法，但SAT需要大量試管等耗材，且24 h培養(yǎng)，步驟煩瑣，結(jié)果判斷受檢測者主觀因素影響，需要綜合判定檢測結(jié)果。MRT主要通過檢測牛奶樣本中的抗體來實現(xiàn)布病檢測，僅適用于泌乳母牛，適用范圍小，對某一頭奶牛的全乳或者多頭奶牛的混合牛奶均可以檢測，采樣方便，避免了血清采樣造成的驅(qū)趕、保定等應(yīng)激影響，但是靈敏度較低，本研究中僅為77.78%，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外，對樣本要求必須是沒有產(chǎn)酸、變質(zhì)或者凍融的全乳，適合大規(guī)?，F(xiàn)場初篩。GICA是一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，檢測時間短，數(shù)分鐘判斷結(jié)果，操作方便，樣本無需預(yù)處理，專業(yè)技術(shù)要求低，檢測結(jié)果易于判定，特異性好，在基層有很強的實用性，但靈敏度較差，高度依賴于抗體的特異性。cELISA靈敏度、特異度均高，借助酶標(biāo)儀判定結(jié)果，克服了肉眼隨意性帶來的判定結(jié)果偏差，數(shù)據(jù)再現(xiàn)性更高。本研究中cELISA一致性等相關(guān)指標(biāo)最佳，但檢測儀器昂貴、檢測成本較高等限制了該方法在基層推廣應(yīng)用，可作為實驗室檢測手段。

因此，對于奶牛布魯氏菌病要運用多種方法檢測方法，結(jié)合疫病流行現(xiàn)狀、檢測技術(shù)、田間檢測規(guī)模及成本等多種因素考慮，一般先用RBT、MRT、GICA進行大面積現(xiàn)場初篩，再運用SAT、cELISA等靈敏度和特異度高的方法確診，有效提高檢測真實性，有利于布魯氏桿菌病凈化。

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