摘 要： 旨在研究馬立克病病毒（Marek′s disease virus， MDV）編碼的mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，將mdv1-miR-M4-5p模擬物、抑制物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后48 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，mdv1-miR-M4-5p模擬物轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)MDCC-MSB1細(xì)胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表達(dá)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，減少G1期細(xì)胞，增加S和G2細(xì)胞，降低細(xì)胞凋亡率。與對(duì)照組相比，mdv1-miR-M4-5p抑制物轉(zhuǎn)染后MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖、凋亡及其相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的結(jié)果與mdv1-miR-M4-5p模擬物轉(zhuǎn)染后的結(jié)果相反。綜上，Mdv1-miR-M4-5p可促進(jìn)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，這可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞： mdv1-miR-M4-5p；MDV；增殖；凋亡；TGF-β1/Smad2

中圖分類號(hào)：S858.31;Q255;Q279

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3678-10

收稿日期：2023-11-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（U1504308;31702207）；河南省科技研發(fā)計(jì)劃聯(lián)合基金資助項(xiàng)目（232103810029）；河南科技大學(xué)省部級(jí)科技創(chuàng)新平臺(tái)培育項(xiàng)目（2015SPT004）

作者簡(jiǎn)介：余祖華（1977-）女，河南商城人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物疫病病原與分子免疫學(xué)研究，E-mail： yzhd05@163.com

通信作者：丁 軻，主要從事動(dòng)物傳染病與微生態(tài)研究，E-mail： keding19@163.com

Effects of mdv1-miR-M4-5p Encoded by MDV on Proliferation and Apoptosis of MDCC-

MSB1 Cells

YU" Zuhua1，2， GAO" Mengru1，2， HEnbsp; Lei1，2， WEI" Ying1，2， CHEN" Jian1，2， CHEN" Songbiao1，2，

DING" Ke1，2，3*

（1.Laboratory of Functional Microbiology and Animal Health/The Key Laboratory of Animal Disease and Public Health， College of Animal Science and Technology，" Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023，" China; 2.Luoyang Key Laboratory

of Live Carrier Biomaterial and Animal Disease Prevention and Control， Luoyang 471023，" China;

3.College of Animal Science and Technology，

Henan UniversityInstitute of Science and Technology， Luoyang

471023Xinxiang 453003，" China）

Abstract：" The purpose of this experiment was to study the effects of mdv1-miR-M4-5p analog encoded by Marek′s disease virus （MDV） on proliferation and apoptosis of MDCC-MSB1 cells. In this study， mdv1-miR-M4-5p mimics， inhibitors and their negative controls were transfected into MSB1 cells for 48 h. Real-time quantitative fluorescent PCR （qRT-PCR） was used to detect the transcription of mdv1-miR-M4-5p， TGF-β1， Smad2 signaling molecules， caspase-9， caspase-3， cyt-c， cyclinD1， Bcl-2 et al other molecules related to proliferation and apoptosis in MDCC-MSB1 cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 and cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The results showed that compared with the control group， the transcription levels of mdv1-miR-M4-5p， cyclinD1 and Bcl-2 in MDCC-MSB1 cells transfected with mdv1-miR-M4-5p mimics was significantly up-regulated. The transcription of TGF-β1， Smad2， cyt-c， caspase-9 and caspase-3 was down-regulated， the proliferation of MDCC-MSB1 cells was promoted， the the number of G1 phase cells were decreased， the S and G2 cells were increased， and the apoptosis rate was decreased. Compared with the control group， the results of the proliferation and apoptosis of MDCC-MSB1 cells and the expression of related molecules transfected with mdv1-miR-M4-5p inhibitor were opposite to those transfected with mdv1-miR-M4-5p mimics. The results showed that Mdv1-miR-M4-5p could promote the proliferation and inhibit the apoptosis of MDCC-MSB1 cells. This may be conducted by inhibiting the TGF-β1/Smad2 signaling pathway.

Key words： mdv1-miR-M4-5p; MDV; proliferation; apoptosis; TGF-β1/ Smad2

*Corresponding author：" DING Ke， E-mail： keding19@163.com

MicroRNAs （miRNAs）是一類保守的非編碼小RNA，大小為22～25 nt，它通過(guò)靶向腫瘤啟動(dòng)子或抑制基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要地調(diào)控作用，目前已成為近年來(lái)重要的研究熱點(diǎn)之一［1-3］，且病毒編碼的miRNAs在疾病和腫瘤發(fā)生過(guò)程中具有重要的調(diào)控功能［4-7］。

MiR-155是宿主編碼的具有多種功能的miRNA，它在維持細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是一種與多種腫瘤密切相關(guān)的miRNA［8-11］。馬立克病（Marek′s disease， MD）是由馬立克病病毒（Marek′s disease virus， MDV）感染引起的一種以雞T淋巴細(xì)胞增生為主要特征的高度傳染性免疫抑制病與腫瘤?。?2］。MDV1編碼的mdv1-miR-M4和由卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpes virus，KSHV）編碼的Mir-K12-11都是miR-155的功能性類似物。研究表明，mdv1-miR-M4-5p在MDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞、MDV誘導(dǎo)的腫瘤組織、MDV轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系和血清外泌體中表達(dá)上調(diào)［13-14］，在病毒感染潛伏期、溶細(xì)胞期和淋巴瘤轉(zhuǎn)化期間具有典型的表達(dá)模式［15］。缺失不同毒力MDV毒株的mdv1-miR-M4后，MDV的致瘤活性喪失或顯著降低［16-17］。近年來(lái)，研究者對(duì)許多mdv1-miR-M4-5p靶基因及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究和論證。如Zhao等［18］報(bào)道m(xù)dv1-miR-M4-5p可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PU.1、CEBPβ、HIVEP2、BCL2L13、PDCD6等宿主基因?qū)е聬盒约?xì)胞轉(zhuǎn)化。Chi等［19］通過(guò)TargetScan 和 RNAhybrid兩種生物信息學(xué)軟件對(duì)mdv1-miR-M4-5p 可能調(diào)控的宿主靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)潛伏TGF-β結(jié)合蛋白1 （Latent TGF-β-binding protein 1，LTBP1）是mdv1-miR-M4-5p的重要靶基因，mdv1-miR-M4-5p可通過(guò)靶向下調(diào)LTBP1的表達(dá)而顯著降低TGF-β1的分泌。TGF-β1是細(xì)胞或組織中TGF-β家族中最豐富、最有效的因子，它調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)特性的各個(gè)方面，包括細(xì)胞增殖、遷移、黏附、存活、分化和浸潤(rùn)［20-23］。Smads蛋白家族是TGF-β1信號(hào)的關(guān)鍵下游信號(hào)分子。一旦TGF-β1被激活，下游的Smad2和/或Smad3被磷酸化，與Smad4形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。該復(fù)合物在細(xì)胞核中積累，并在細(xì)胞核中傳遞TGF-β1信號(hào)以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。多項(xiàng)研究表明TGF-β1/Smad2 信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生過(guò)程［24-27］。FethiLouafi等［28］研究發(fā)現(xiàn)miR-155可抑制Smad2蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平，進(jìn)而影響TGF-β通路調(diào)控的下游基因的表達(dá)。Chi等［19］通過(guò)雞TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array等試驗(yàn)驗(yàn)證在MDV感染過(guò)程中，mdv1-miR-M4-5p可以抑制TGF-β通路的信號(hào)傳遞，促進(jìn)細(xì)胞增殖。但mdv1-miR-M4-5p抑制LTBP1、TGF-β1的表達(dá)是否繼續(xù)影響Smad2的表達(dá)以及mdv1-miR-M4-5p對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及其關(guān)鍵分子表達(dá)的影響還需明確。因此，本研究在馬立克病病毒轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系MDCC-MSB1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)mdv1-miR-M4-5p的基礎(chǔ)上，檢測(cè)mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)對(duì)TGF-β1、Smad2以及細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵分子表達(dá)轉(zhuǎn)錄的影響，為探究mdv1-miR-M4-5p在MDV致瘤中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

MDCC-MSB1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白胨磷酸肉湯（TPB）和RNase、Propidium Iodide購(gòu)自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司; TRIzol RNA提取試劑購(gòu)自Ambion公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqTM II、CCK-8檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司; 自Sigma公司；AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司；6孔細(xì)胞板、96孔細(xì)胞板、25 cm2細(xì)胞瓶、離心管等購(gòu)自廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 mdv1-miR-M4-5p模擬物、抑制物的合成

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中mdv1-miR-M4-5p成熟體序列委托廣州銳博生物科技有限公司合成mdv1-miR-M4-5p模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）及其陰性對(duì)照（mimic NC、inhibitor NC）。

1.2.2 熒光定量引物的設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)［11］方法設(shè)計(jì)mdv1-miR-M4-5p和U6的頸環(huán)熒光定量PCR擴(kuò)增引物。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)TGF-β1/Smad2信號(hào)分子、細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵分子的熒光定量PCR引物（表1）。設(shè)計(jì)的引物送通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液和10% TPB的 RPMI1640 培養(yǎng)基重懸MDCC-MSB1細(xì)胞，置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。按照5×105·孔-1的細(xì)胞量將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDCC-MSB1細(xì)胞加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。試驗(yàn)分為4組，分別為mdv1-miR-M4-5p mimic組、mdv1-miR-M4-5p mimic NC組、mdv1-miR-M4-5p inhibitor組和mdv1-miR-M4-5p inhibitor NC組。按照Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后48 h收獲各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.4 RNA的提取和Real-time PCR

使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Nanodrop-1000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA的濃度和純度后，用PrimeScriptTM RT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后用表1中的特異性的熒光定量PCR引物和TB Green Premix Ex TaqTM II對(duì)mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2、cyclinD1、caspase-3、caspase-9、Bcl-2和cyt-c進(jìn)行qRT-PCR。循環(huán)參數(shù)：50 ℃ 2 min， 95 ℃ 3 min， 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。分別以U6和GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中基因相對(duì)表達(dá)量的差異。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)

按照CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染處理后的各組MDCC-MSB1細(xì)胞，分別按照4 000個(gè)細(xì)胞·孔-1的密度接種到96孔板中，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（僅加細(xì)胞培養(yǎng)基）。分別在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h，于每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度（OD），統(tǒng)計(jì)分析并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 細(xì)胞周期測(cè)定

在轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞沉淀，用冷PBS潤(rùn)洗2次后，加入100 μL PBS重新懸浮細(xì)胞，再緩慢加入700 μL預(yù)冷的80%乙醇后，在4℃固定4 h；1 500 r·min-1離心5 min，細(xì)胞沉淀用冷PBS潤(rùn)洗2次，加入200 μL PBS重懸細(xì)胞，加入10 μL RNase（1 mg·mL-1），37℃孵育30min；然后加入10 μL PI（400 μg·mL-1）4℃下避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.7 AnnexinV-APC/7-AAD染色

采用annexin-apc/7-AAD染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDCC-MSB1細(xì)胞的凋亡情況。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，用冷PBS潤(rùn)洗2次，1 200 r·min-1離心5min后使用AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行染色。用500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL AnnexinV-APC和5μL 7-AAD后在室溫下避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，計(jì)算早期和晚期凋亡細(xì)胞的百分比。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0和GraphPad Prism （Version 6.0）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x-±s”表示。兩組間顯著性比較采用學(xué)生t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。*. Plt;0.05，代表數(shù)據(jù)差異顯著，**. Plt;0.01代表數(shù)據(jù)差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

將mdv1-miR-M4-5p模擬物、mdv1-miR-M4-5p抑制物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后48 h，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2、caspase-3、caspase-9、cyclinD1、Bcl-2、cyt-c的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。如圖1所示，與陰性對(duì)照（NC）相比，轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p mimic后，mdv1-miR-M4-5p的轉(zhuǎn)錄水平極其顯著升高（Plt;0.01），TGF-β1、Smad2、caspase-3、caspase-9和cyt-c的轉(zhuǎn)錄均顯著降低（Plt;0.01），cyclinD1和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄顯著升高（Plt;0.01）。轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p inhibitor后，mdv1-miR-M4-5p的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降（Plt;0.01），TGF-β1、Smad2、caspase-3、caspase-9和cyt-c的轉(zhuǎn)錄均顯著升高（Plt;0.01），cyclinD1和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄顯著降低（Plt;0.01）。

2.2 Mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖的影響

為了確定mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖的影響，采用CCK-8檢測(cè)各轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖情況。如圖2所示，在轉(zhuǎn)染后24～72 h，與陰性對(duì)照（NC）相比，轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p mimic后，MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（Plt;0.01），轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p inhibitor后，MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖能力極顯著降低（Plt;0.01）。

2.3 Mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞周期的影響

為了檢測(cè)mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞周期的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布。如圖3所示，與陰性對(duì)照（NC）相比，轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p mimic的MDCC-MSB1細(xì)胞G1期和G2期細(xì)胞比例顯著降低（Plt;0.05），S期細(xì)胞比例顯著增加（Plt;0.05）。而轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p inhibitor的MDCC-MSB1細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著增加（Plt;0.05），G2期細(xì)胞比例顯著降低（Plt;0.05），S期細(xì)胞比例差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 Mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞凋亡的影響

為了評(píng)估m(xù)dv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞凋亡的影響，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組MDCC-MSB1細(xì)胞的凋亡百分比。如圖4所示，與陰性對(duì)照（NC）相比，轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p mimic的細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例差異不顯著（Pgt;0.05），而轉(zhuǎn)染mdv1-miR-M4-5p inhibitor的細(xì)胞的凋亡細(xì)胞的比例顯著升高（Plt;0.01）。

3 討 論

在腫瘤疾病中某些miRNAs表達(dá)量呈現(xiàn)減少、缺失或顯著提高，表明miRNAs在腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演著重要的角色。miR-155在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［29-30］，可引發(fā)B細(xì)胞白血病和淋巴瘤［31］。HSV、KSHV和EBV等病毒miRNA可以通過(guò)靶向前凋亡基因抑制細(xì)胞凋亡［32-34］。MDV病毒編碼Mdv1-miR-M4-5p與miR-155具有保守的種子序列，是miR-155的同功分子，在MDV誘導(dǎo)的淋巴瘤中起重要作用［16-17］。

Chi等［19］研究表明，miR-M4-5p通過(guò)靶向抑制LTBP1的表達(dá)，導(dǎo)致TGF-β1的分泌和激活顯著降低，從而抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，最終激活宿主癌基因c-Myc的過(guò)表達(dá)。然而，mdv1-miR-M4-5p是否影響細(xì)胞增殖和凋亡以及抑制TGF-β1后是否抑制Smad2還需要試驗(yàn)驗(yàn)證。

在本研究中，作者通過(guò)將mdv1-miR-M4-5p模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞，在調(diào)控mdv1-miR-M4-5p的表達(dá)水平的基礎(chǔ)上來(lái)檢測(cè)mdv1-miR-M4-5p對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，同時(shí)分析了TGF-β1、Smad2和細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。CCK-8和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，mdv1-miR-M4-5p過(guò)表達(dá)后，MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖能力極顯著增強(qiáng)；且處于分裂期的細(xì)胞比例顯著升高，而抑制mdv1-miR-M4-5p的表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力極顯著降低，且處于分裂期的細(xì)胞比例顯著降低。CyclinDl蛋白與細(xì)胞周期密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖調(diào)控中起關(guān)鍵作用［35-36］。在本研究中，過(guò)表達(dá)mdv1-miR-M4-5p可引起cyclinD1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，抑制mdv1-miR-M4-5p表達(dá)可引起cyclinD1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這表明mdv1-miR-M4-5p表達(dá)的變化會(huì)影響MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，mdv1-miR-M4-5p可能通過(guò)調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)促進(jìn)MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果可以看出，雖然mdv1-miR-M4-5p過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著性變化，但mdv1-miR-M4-5p抑制表達(dá)后細(xì)胞的凋亡率增加極顯著，表明mdv1-miR-M4-5p可抑制MDCC-MSB1細(xì)胞凋亡。Bcl2是細(xì)胞凋亡的抑制劑，作為最重要的抗凋亡因子，其高表達(dá)可以阻止cyt-c的釋放，并有效抑制caspase-9和caspase-3的激活，防止細(xì)胞凋亡［37］。在本研究中，mdv1-miR-M4-5p過(guò)表達(dá)上調(diào)了Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)了cyt-c、caspase-9、caspase-3的轉(zhuǎn)錄，相反，mdv1-miR-M4-5p的抑制表達(dá)引起B(yǎng)cl-2轉(zhuǎn)錄的下調(diào)，cyt-c、caspase-9、caspase-3轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。在前期研究中，作者發(fā)現(xiàn)雞TGF-β1可抑制MDCC-MSB1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，促進(jìn)其凋亡［38］，而在本研究中，過(guò)表達(dá)mdv1-miR-M4-5p可引起TGF-β1和Smad2轉(zhuǎn)錄的下調(diào)，而抑制mdv1-miR-M4-5p的表達(dá)引起TGF-β1和Smad2轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，這表明mdv1-miR-M4-5p可抑制TGF-β1、Smad2的轉(zhuǎn)錄。結(jié)合Chi等［19］研究表明，mdv1-miR-M4-5p靶向下調(diào)LTBP1表達(dá)后，抑制TGF-β1、Smad2信號(hào)分子的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和凋亡。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，mdv1-miR-M4-5p可促進(jìn)MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，同時(shí)調(diào)節(jié)增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ SZCZEPANEK J， SKORUPA M， TRETYN A. MicroRNA as a potential therapeutic molecule in cancer［J］. Cells， 2022， 11（6）：1008.

［2］ LIANG C， YANG J B， LIN X Y， et al. Recent advances in the diagnostic and therapeutic roles of microRNAs in colorectal cancer progression and metastasis［J］. Front Oncol， 2022， 12：911856.

［3］ CHATTERJEE B， SAHA P， BOSE S， et al. MicroRNAs： as critical regulators of tumor-associated macrophages［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（19）：7117.

［4］ HULL R， MARIMA R， ALAOUNA M， et al. Viral encoded miRNAs in tumorigenesis： theranostic opportunities in precision oncology［J］. Microorganisms， 2022， 10（7）：1448.

［5］ VOJTECHOVA Z， TACHEZY R. The role of miRNAs in virus-mediated oncogenesis［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（4）：1217.

［6］ MACHADO C B， DA CUNHA L S， DA SILVA MAUéS J H， et al. Role of miRNAs in human T cell leukemia virus type 1 induced T cell leukemia： a literature review and bioinformatics approach［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（10）：5486.

［7］ TENG M， ZHU Z J， YAO Y X， et al. Critical roles of non-coding RNAs in lifecycle and biology of Marek′s disease herpesvirus［J］. Sci China Life Sci， 2023， 66（2）：251-268.

［8］ CHEN L， GAO D， SHAO Z Z， et al. miR-155 indicates the fate of CD4+ T cells［J］. Immunol Lett， 2020， 224：40-49.

［9］ 靳睿哲， 王迪嫻， 趙 乾， 等. miR-155-5p在腫瘤中的表達(dá)、功能以及調(diào)控作用［J］. 腫瘤防治研究， 2023， 50（3）：309-315.

JIN R Z， WANG D X， ZHAO Q， et al. miR-155-5p expression， function and regulation in tumors［J］. Cancer Research on Prevention and Treatment， 2023， 50（3）：309-315. （in Chinese）

［10］ 楊 攀， 王 萍， 周細(xì)武. 循環(huán)miR-155作為腫瘤生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 38（10）：1281-1287.

YANG P， WANG P， ZHOU X W. Recent advances in circulating miR-155 as tumor biomarker［J］. Chinese Journal of Cell Biology， 2016， 38（10）：1281-1287. （in Chinese）

［11］ 余祖華， 丁 軻， 郁 川， 等. gga-miR-155對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 49（11）：2496-2504.

YU Z H， DING K， YU C， et al. Effect of gga-miR-155 on the biological behavior of MDCC-MSB1 cells［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2018， 49（11）：2496-2504. （in Chinese）

［12］ DAVISON A J， EBERLE R， EHLERS B， et al. The order Herpesvirales［J］. Arch Virol， 2009， 154（1）：171-177.

［13］ ZHUANG G Q， SUN A J， TENG M， et al. A tiny RNA that packs a big punch：the critical role of a viral miR-155 ortholog in lymphomagenesis in Marek′s disease［J］. Front Microbiol， 2017， 8：1169.

［14］ ZHANG Y Y， TANG N， LUO J， et al. Marek′s disease virus-encoded microRNA 155 ortholog critical for the induction of lymphomas is not essential for the proliferation of transformed cell lines［J］. J Virol， 2019， 93（17）：e00713-19.

［15］ LUO J， SUN A J， TENG M， et al. Expression profiles of microRNAs encoded by the oncogenic Marek′s disease virus reveal two distinct expression patterns in vivo during different phases of disease［J］. J Gen Virol， 2011， 92（Pt 3）：608-620.

［16］ ZHAO Y G， XU H T， YAO Y X， et al. Critical role of the virus-encoded microRNA-155 ortholog in the induction of Marek′s disease lymphomas［J］. PLoS Pathog， 2011， 7（2）：e1001305.

［17］ YU Z H， TENG M， SUN A J， et al. Virus-encoded miR-155 ortholog is an important potential regulator but not essential for the development of lymphomas induced by very virulent Marek′s disease virus［J］. Virology， 2014， 448：55-64.

［18］ ZHAO Y G， YAO Y X， XU H T， et al. A functional microRNA-155 ortholog encoded by the oncogenic Marek′s disease virus［J］. J Virol， 2009， 83（1）：489-492.

［19］ CHI J Q， TENG M， YU Z H， et al. Marek′s disease virus-encoded analog of microRNA-155 activates the oncogene c-Myc by targeting LTBP1 and suppressing the TGF-β signaling pathway［J］. Virology， 2015， 476：72-84.

［20］ WANG J M， XIANG H J， LU Y F， et al. Role and clinical significance of TGF-β1 and TGF-βR1 in malignant tumors （Review）［J］. Int J Mol Med， 2021， 47（4）：55.

［21］ KUHIKAR R， KHAN N， PHILIP J， et al. Transforming growth factor β1 accelerates and enhances in vitro red blood cell formation from hematopoietic stem cells by stimulating mitophagy［J］. Stem Cell Res Ther， 2020， 11（1）：71.

［22］ BELKOURCHIA F， DESROSIERS R R. The protein L-Isoaspartyl （D-Aspartyl） methyltransferase regulates glial-to-mesenchymal transition and migration induced by TGF-β1 in human U-87 MG Glioma cells［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（10）：5698.

［23］ DEVAN A R， PAVITHRAN K， NAIR B， et al. Deciphering the role of transforming growth factor-beta 1 as a diagnostic-prognostic-therapeutic candidate against hepatocellular carcinoma［J］. World J Gastroenterol， 2022， 28（36）：5250-5264.

［24］ KIM N， RYU H， KIM S， et al. CXCR7 promotes migration and invasion in head and neck squamous cell carcinoma by upregulating TGF-β1/Smad2/3 signaling［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）：18100.

［25］ DONG Z H， SUN Y Y， WEI G W， et al. Ergosterol ameliorates diabetic nephropathy by attenuating mesangial cell proliferation and extracellular matrix deposition via the TGF-β1/Smad2 signaling pathway［J］. Nutrients， 2019， 11（2）：483.

［26］ WU S， JI L A， FAN X M， et al. Jieduquyuzishen prescription attenuates renal fibrosis in MRL/lpr mice via inhibiting EMT and TGF-β1/Smad2/3 pathway［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2022， 2022：4987323.

［27］ ZHANG Y Q， HUA L P， LIN C F， et al. Pien-Tze-Huang alleviates CCl4-induced liver fibrosis through the inhibition of HSC autophagy and the TGF-β1/Smad2 pathway［J］. Front Pharmacol， 2022， 13：937484.

［28］ LOUAFI F， MARTINEZ-NUNEZ R T， SANCHEZ-ELSNER T. MicroRNA-155 targets SMAD2 and modulates the response of macrophages to transforming growth factor-β［J］. J Biol Chem， 2010， 285（53）：41328-41336.

［29］ MAHESH G， BISWAS R. MicroRNA-155： a master regulator of inflammation［J］. J Interferon Cytokine Res， 2019， 39（6）：321-330.

［30］ XU W D， FENG S Y， HUANG A F. Role of miR-155 in inflammatory autoimmune diseases： a comprehensive review［J］. Inflamm Res， 2022， 71（12）：1501-1517.

［31］ COSTINEAN S， ZANESI N， PEKARSKY Y， et al. Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high-grade lymphoma in Eμ-miR155 transgenic mice［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（18）：7024-7029.

［32］ RILEY K J， RABINOWITZ G S， YARIO T A， et al. EBV and human microRNAs co-target oncogenic and apoptotic viral and human genes during latency［J］. EMBO J， 2012， 31（9）：2207-2221.

［33］ LIU Y， YANG H L， ZHONG F F， et al. Anti-apoptotic function of herpes simplex virus-2 latency-associated transcript RL1 sequence and screening of its encoded microRNAs［J］. Clin Exp Dermatol， 2016， 41（7）：782-791.

［34］ LIU X Y， HAPPEL C， ZIEGELBAUER J M. Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus microRNAs target GADD45B to protect infected cells from cell cycle arrest and apoptosis［J］. J Virol， 2017， 91（3）：e02045-16.

［35］ QIE S， DIEHL J A. Cyclin D1， cancer progression， and opportunities in cancer treatment［J］. J Mol Med （Berl）， 2016， 94（12）：1313-1326.

［36］ MONTALTO F I， DE AMICIS F. Cyclin D1 in cancer： a molecular connection for cell cycle control， adhesion and invasion in tumor and stroma［J］. Cells， 2020， 9（12）：2648.

［37］ DADSENA S， ZOLLO C， GARCíA-SáEZ A J. Mechanisms of mitochondrial cell death［J］. Biochem Soc Trans， 2021， 49（2）：663-674.

［38］ 余祖華， 丁 軻， 賈艷艷， 等. 雞TGFβ1對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2020， 51（10）：2567-2575.

YU Z H， DING K， JIA Y Y， et al. Effect of Gallus TGFβ1 on the proliferation， apoptosis， migration and invasion of MDCC-MSB1 cells［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2020， 51（10）：2567-2575. （in Chinese）

（編輯 白永平）