【摘要】

目的：通過維甲酸建立骨質(zhì)疏松小鼠模型，評價牛膝-續(xù)斷藥對的抗骨質(zhì)疏松作用，探索其抗骨質(zhì)疏松活性成分。方法：采用 HPLC法建立牛膝-續(xù)斷藥對提取物的指紋圖譜；使用“中藥色譜指紋圖譜相似度指紋評價系統(tǒng)（2004 A版）”對不同組別進行相似度評價。維甲酸誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松模型，計算肝腎指數(shù)與股骨干濕比，應(yīng)用酶標(biāo)法檢測不同提取物對維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型小鼠血清ALP、ACP水平；應(yīng)用Spss軟件進行牛膝-續(xù)斷提取物中各成分與模型小鼠股骨干濕比和血清中ALP和ACP酶含量的pearson相關(guān)性分析。結(jié)果：成功建立牛膝-續(xù)斷藥對提取物的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定9個共有峰。肝腎指數(shù)結(jié)果顯示模型組與給藥組無顯著差異，股骨干濕比結(jié)果顯示大部分治療組與模型組相比有顯著性差異。ELISA結(jié)果顯示，牛膝續(xù)斷藥對主要影響ACP水平。指紋峰與干濕比分析結(jié)果顯示，峰1可能為活性成分；與ACP相關(guān)性分析結(jié)果表明峰1、2、3、7可能為活性成分。結(jié)論：牛膝-續(xù)斷藥對提取物對骨質(zhì)疏松有治療作用，其抗骨質(zhì)疏松作用主要通過降低ACP水平實現(xiàn)，峰1可能為牛膝-續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松活性成分。

【關(guān)鍵詞】

骨質(zhì)疏松；牛膝；續(xù)斷

【中圖分類號】R285.6

【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）16-0042-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.16.zgmzmjyyzz202416010

Preliminary Study on the Antiosteoporosis Effect and Active Ingredients of Achyranthes Bidentata-Dipsacus

GUAN DongxueNING ZhonghaiYUAN KaizhiLI XinyueSUN Yantao*

College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China

Abstract：

Objective To establish an osteoporosis mouse model with retinoic acid， evaluate the anti-osteoporosis effect of Achyranthes bidentata and dipsacus， and explore its anti-osteoporosis active components. Method HPLC was used to establish the fingerprint of the extract of Achyranthes bidentata and dipsacus. The similarity of different groups was evaluated using the “TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A）”. The serum ALP and ACP levels of different extracts of retinoic acid-induced osteoporosis mice were measured by enzyme-label method. The liver and kidney index and the dry-wet ratio of femur were calculated. spss software was used to analyze the pearson correlation between components of the extract and the dry-wet ratio of femur and the content of ALP and ACP enzymes in serum of model mice. Results HPLC fingerprint of the extract of Achyranthes bidentata and dipsacus was established successfully， and 9 common peaks were identified. The results of liver and kidney index showed no significant difference between the model group and the administration group， and the results of dry and wet ratio of femur showed that most of the treatment groups had significant differences compared with the model group. ELISA results showed that achyranthes had a major effect on ACP levels. Fingerprint peak and dry-wet ratio analysis showed that peak 1 May be the active ingredient. The correlation analysis with ACP indicated that peak 1，2，3，7 might be the active components. Conclusion The extract of Achyranthes bidentata and dipsacus has therapeutic effect on osteoporosis， and its anti-osteoporosis effect is mainly achieved by reducing the level of ACP. Peak 1 may be the active ingredient of Achyranthes bidentata and dipsacus.

Keywords：

Osteoporosis; Achyranthes Bidentata; Dipsacus

中醫(yī)理論認(rèn)為“腎為先天之本”“腎生骨髓”“其充在骨”。骨的生長發(fā)育、強勁、衰弱與腎精盛衰關(guān)系密切，腎精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養(yǎng)而強健有力；腎精虧虛則骨髓生化無源，骨骼失養(yǎng)而萎弱無力。續(xù)斷與牛膝兩藥均入肝腎兩經(jīng)，有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經(jīng)之效。牛膝主降，引續(xù)斷與牛膝藥氣下行；續(xù)斷主升，與牛膝互補，調(diào)和藥性。牛膝藥性苦，具有堅陰作用，根據(jù)陰陽互根互用原則，對于腎陽的補充大有裨益；牛膝性苦，續(xù)斷性辛，陰陽調(diào)和。兩者在歷來典籍中的結(jié)合頗多，效果上佳，是治療骨質(zhì)疏松的兩樣良藥［1］?！段菏霞也胤健分惺褂门Ｏァ⒗m(xù)斷制成續(xù)斷散，治療老人風(fēng)冷、轉(zhuǎn)筋骨痛；堅骨方中取用牛膝10 g，川續(xù)斷15 g，輔以熟地、當(dāng)歸等藥材治療老年骨質(zhì)疏松，補腎益精，堅骨壯精；《證治準(zhǔn)繩》中的續(xù)斷丹，牛膝、續(xù)斷與萆薢、杜仲同用，用于治療肝腎不足、腰膝酸痛。二者功效相輔相成，彼此增益，在骨質(zhì)疏松的治療上具有良效。

目前關(guān)于續(xù)斷-牛膝藥對的研究多為脊柱炎、關(guān)節(jié)炎等方面，鮮少有骨質(zhì)疏松方面的報道［2］。李園園［3］通過數(shù)據(jù)挖掘得出胡蔭奇教授對強直性脊柱炎常用用藥組合含有續(xù)斷、牛膝，為其處方核心組成成分。馮興華治療強直性脊柱炎的前5位藥物為丹參、牛膝、赤芍、續(xù)斷以及當(dāng)歸。趙寶寶等［4］發(fā)現(xiàn)單味中藥及提取物與中藥復(fù)方可以通過調(diào)控SCFAs 影響骨代謝，從而起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。馬偉鳳等［5］在實驗中發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3能夠提高骨質(zhì)疏松老年大鼠骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，作用機制可能是通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路促進自噬發(fā)揮骨保護作用?？梢娕Ｏ?續(xù)斷具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用。為確定牛膝-續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松作用，并篩選其中活性成分，本研究采用HPLC確定10批不同來源牛膝-續(xù)斷藥對的指紋共有峰，采用維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型，分析給藥組的股骨干濕比，肝、腎指數(shù)，ALP（小鼠堿性磷酸酶）和ACP（小鼠酸性磷酸酶）等免疫指標(biāo)，通過色譜峰面積與藥效指標(biāo)相關(guān)性分析，探討藥對的抗骨質(zhì)疏松活性成分。

1儀器與材料

1.1儀器島津高效液相色譜儀（配置二元梯度泵，在線脫氣機，SPD-10AVP紫外檢測器）；Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；25 μL微量進樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；循環(huán)水式抽濾機（配有抽濾瓶，布氏漏斗，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；萬分之一天平（瑞士METTLER）；微量移液器（上海榮泰生化工程電熱恒溫有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試藥甲醇、乙腈（天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，天津市，色譜純）；維甲酸（北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司，純度>96%）ALP，ACP（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：m1002235）。阿侖膦酸鈉（云南萬裕藥業(yè)有限公司，批號：1704004）

牛膝、續(xù)斷經(jīng)藥學(xué)院鑒定教研室鑒定分別為莧科植物牛膝Achyranthes bidentateB1的干燥根和川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall.exHenry的干燥根，隨機分為10組。具體來源見表1。

1.3實驗動物SPF級KM小鼠，體重（20±5） g，試驗單位使用許可證編號：SYXK（遼）2013-0009， 實驗動物倫理許可證號：SCXK（遼）2015-0001，均為雄鼠。

2方法與結(jié)果

2.1牛膝續(xù)斷提取物指紋圖譜測定

2.1.1供試品溶液制備取牛膝，續(xù)斷粉末各11 g，精密稱定，回流6 h，過濾后將提取液濃縮至35 mL，精密吸取5 mL，揮干溶劑，加甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，收集續(xù)濾液，備用。剩余30 mL溶液作為給藥組溶液，備用。取阿侖膦酸鈉腸溶片，精密稱定，加蒸餾水，配置為0.3 g/mL的溶液。取維甲酸，精密G7KGwmSOCJdXehfb83Tw4Q==稱定，加蒸餾水，配置為0.02 g/mL的溶液。

2.1.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性條件Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動相：乙腈為A相，水為B相，總流速1.0 mL·min-1；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL，梯度洗脫時間程序見表2。

2.1.3方法學(xué)考察分別安排精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗，其結(jié)果均符合指紋圖譜測定要求。

2.1.4樣品測定按照“2.1.2”項下的色譜條件進樣測定，并記錄各批次樣品色譜數(shù)據(jù)。將10批牛膝-續(xù)斷藥對提物HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系（2004A版）”，設(shè)定參照圖譜，將譜峰自動匹配，生成疊加圖譜如圖1，見表3。

2.2牛膝續(xù)斷藥對抗骨質(zhì)疏松作用研究

2.2.1小鼠骨質(zhì)疏松模型復(fù)制及分組給藥KM小鼠，隨機分為13組，每組10只。分別為空白對照組、模型組、陽性藥（阿侖膦酸鈉腸溶片）組和實驗組。使用維甲酸構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，灌胃量0.2 mL/只，空白對照組灌等量安慰劑（生理鹽水），為期14 d。造模同時，對實驗組小鼠灌入牛膝續(xù)斷提取物，灌胃量0.2 mL/只；陽性藥組灌入等量阿侖膦酸鈉腸溶片溶液；對照空白組灌等量安慰劑（生理鹽水）。為期14 d。

2.2.2實驗結(jié)果末次給藥12 h后，對本實驗13組小鼠稱量體重后采血，稱取肝，腎及右后股骨濕重。將股骨烘干后稱取干重，進行計算得肝、腎指數(shù)（肝、腎指數(shù)即為肝、腎重量與小鼠體重之比）和骨干濕比（股骨干濕比即為股骨干重與濕重之比），按ELISA試劑盒操作流程測定小鼠血清樣本中ALP及ACP的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，肝、腎指數(shù)無顯著差異。與空白組相比，模型組股骨干濕比明顯降低。與模型組相比，陽性組及大部分治療組股骨干濕比明顯升高。小鼠血清樣本中ALP的含量無顯著變化。與空白組相比，模型組ACP含量顯著升高，與模型組相比，陽性組及各治療組ACP含量顯著下降。

2.3牛膝續(xù)斷藥對各成分與藥效關(guān)系雙變量相關(guān)分析可以描述兩變量間線性關(guān)系的密切程度、相關(guān)性大小及方向。相關(guān)系數(shù)的大小反映兩變量相關(guān)性的大小，正負表明方向。采用SPSS 19.0中雙變量相關(guān)分析方法， 計算各樣品共有峰的相對峰面積與ACP，ALP及骨干濕比的相關(guān)系數(shù)，詳情見表5。結(jié)果表明，組分給藥后體內(nèi)色譜峰與藥效相關(guān)性較大。

3討論

骨質(zhì)疏松是老年患者常見的疾病，隨著我國老齡化趨勢的不斷上漲，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也逐年增加［6-7］。因此，如何預(yù)防以及治療此類疾病成為現(xiàn)代研究的首要問題。有文獻報道牛膝［8］和續(xù)斷［9］具有治療骨質(zhì)疏松的功效，本研究基于維甲酸建立骨質(zhì)疏松小鼠模型，探究了牛膝-續(xù)斷配伍藥對的抗骨質(zhì)疏松作用。

堿性磷酸酶（ALP）作為骨代謝和骨形成的標(biāo)志物，其指標(biāo)可評價骨轉(zhuǎn)換與成骨細胞QuTtvUNsbJpS+vOwXidNig==分化程度，主要存在于成骨細胞胞漿中，與成骨細胞的成熟及分化呈正相關(guān)，是調(diào)節(jié)骨形成的重要物質(zhì)。酸性磷酸酶（ACP）由破骨細胞分泌，存在于重吸收小囊泡中。ACP作為反映骨吸收的指標(biāo)，對骨吸收有促進作用，具有潛在調(diào)節(jié)破骨細胞與骨結(jié)合的功能?？梢夾LP值愈高，ACP值愈小，越能體現(xiàn)出對骨質(zhì)疏松的治療效果。牛膝-續(xù)斷藥對治療骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨干濕比結(jié)果顯示，模型組與空白組有顯著性差異，說明本實驗?zāi)Ｐ徒⒊晒Α＝Y(jié)果表明，各組提取物對股骨干濕比和ACP均具有顯著的影響。由此得出，牛膝-續(xù)斷藥對具有良好抗骨質(zhì)疏松作用，可能通過降低破骨作用來治療骨質(zhì)疏松。

通過建立指紋圖譜，體現(xiàn)了牛膝續(xù)斷藥對的成分，提高了活性成分篩選的準(zhǔn)確性。通過分析藥對中相關(guān)化學(xué)成分與股骨干濕比，ACP相關(guān)性的結(jié)果可知，藥對提取物中相關(guān)化學(xué)成分與股骨干濕比和ACP呈現(xiàn)良好相關(guān)性。特別是峰1與股骨干濕比呈良好相關(guān)性，且其與ACP呈明顯負相關(guān)，說明其含量越高，ACP結(jié)果越小，抗骨質(zhì)疏松作用越好，值得對其進行進一步深入研究。藥對提取物對骨質(zhì)疏松有治療作用，對肝腎影響較小，其直接作用于骨，對骨吸收影響較大，可明顯降低ACP水平，從而達到治療小鼠骨質(zhì)疏松的作用。

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（收稿日期：2024-11-20編輯：陶希睿）