關(guān)鍵詞 食源性病原菌；CRISPR/Cas；生物傳感器；評述

食源性病原菌是可引起食物中毒或以食品為媒介傳播的細(xì)菌、病毒和真菌。食源性病原菌通過污染食品原材料（蔬菜、水果、牛奶和肉類等）和水源，或在食品生產(chǎn)、加工、儲存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)對食品造成污染。常見的食源性病原菌主要有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、彎曲桿菌和大腸桿菌等[1]。人類直接食用或因接觸被病原菌污染的食品而間接攝入病原菌，可出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、頭痛、惡心等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致死亡[2]。因此，建立快速、準(zhǔn)確和靈敏的食源性病原菌檢測方法對保障食品安全和人類健康具有重要意義。

傳統(tǒng)的菌落平板計(jì)數(shù)法結(jié)合生化鑒定被認(rèn)為是檢測食源性病原菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”。雖然這種方法準(zhǔn)確度很高，但檢測通常需要3～5d，并且難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測[3]。為了克服檢測時(shí)間過長的問題，研究者開發(fā)了許多方法，如熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）和酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）等方法[4]。熒光定量PCR 方法的靈敏度較高，在病原菌檢測過程中被廣泛采用。但是， PCR 過程中產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，限制了PCR 的應(yīng)用[5]?；诳乖涂贵w之間的免疫反應(yīng)的ELISA 具有操作簡單和檢測時(shí)間短等優(yōu)勢，但是準(zhǔn)確性和靈敏度較低[6]。為滿足即時(shí)檢測食源性病原菌的需求，需要開發(fā)特異性好、準(zhǔn)確度和靈敏度更高的檢測方法。

規(guī)則成簇的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）/CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)（CRISPR-associated systems， Cas）是細(xì)菌及古細(xì)菌用于抵御病毒入侵的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過引導(dǎo)RNA 與靶核酸的堿基互補(bǔ)配對原則確保特異性，并借助Cas 蛋白實(shí)現(xiàn)基因剪切與修飾。隨著各種功能性Cas 蛋白的發(fā)現(xiàn)和改造，以及越來越多具有可設(shè)計(jì)和可編程特點(diǎn)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列核糖核酸（CRISPR RNA， crRNA）被發(fā)現(xiàn)， CRISPR/Cas 系統(tǒng)在分子診斷領(lǐng)域的潛能被逐漸開發(fā)，并被廣泛應(yīng)用[7-11]。將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與不同種類的技術(shù)相結(jié)合，已構(gòu)建了多種用于食源性病原菌檢測的生物傳感器[12-16]。

CRISPR/Cas 生物傳感器是在引導(dǎo)RNA 的作用下，使Cas 蛋白與RNA 形成核糖核酸復(fù)合體，對靶標(biāo)基因進(jìn)行特異識別，并將分子間的化學(xué)反應(yīng)經(jīng)信號放大，最后轉(zhuǎn)化為可檢測的電信號、光學(xué)信號和色相信號等。CRISPR/Cas 由于其設(shè)計(jì)和使用靈活，在生物傳感的信號識別、放大和輸出過程中都發(fā)揮了重要作用（圖1）。本文介紹了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的分類、作用機(jī)制及其在生物傳感中的作用，分別闡述了其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用，總結(jié)了現(xiàn)有的基于CRISPR/Cas 的多重食源性病原菌檢測方法以及其近年來的研究進(jìn)展，分析了其在實(shí)際應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)，并對基于CRISPR/Cas 的生物傳感器在病原菌檢測研究和應(yīng)用中未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類及作用機(jī)制

根據(jù)效應(yīng)蛋白數(shù)量的不同， CRISPR/Cas 系統(tǒng)可分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類是由多個(gè)亞基組成的效應(yīng)子模塊，Ⅱ類是具有多種功能的單個(gè)效應(yīng)蛋白[17]。Ⅱ類Cas 蛋白具有簡單和高效等特點(diǎn)，被廣泛用于分子診斷領(lǐng)域。目前，基于CRISPR/Cas 的生物傳感器常用的Cas 效應(yīng)蛋白包括Cas9、Cas12 和Cas13a等[18-21]，本文將分別介紹這3 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)的工作原理。

1.1 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是通過crRNA 與具有crRNA 互補(bǔ)序列的反式激活RNA（Trans-activatingcrRNA，tracrRNA）序列形成RNA 雙鏈體， Cas9 蛋白在2 個(gè)RNA 的引導(dǎo)下識別帶有原間隔臨近基序（Protospacer adjacent motif， PAM）的（5′-NGG-3′）靶雙鏈DNA（Double strand DNA， dsDNA），在PAM 位點(diǎn)上游3 個(gè)堿基處切割靶dsDNA，形成雙鏈切口[22]。此外， crRNA 和tracrRNA 可合并為單一導(dǎo)向的RNA（Single-guide RNA， sgRNA）[23]?；趬A基互補(bǔ)配對原則， Cas9 會在sgRNA 引導(dǎo)下與靶dsDNA 結(jié)合。Cas9蛋白具有2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH 和RuvC，其中， HNH 區(qū)域引導(dǎo)切割與sgRNA 互補(bǔ)的模板鏈，RuvC 區(qū)域引導(dǎo)切割與模板鏈互補(bǔ)的鏈[24-26]。除此之外，當(dāng)Cas9 的1 個(gè)核酸酶活性區(qū)域失活后，會形成Cas9nickase（Cas9n）[27]，可在dsDNA 上形成單鏈缺口[22]。當(dāng)HNH 和RuvC 都失活后，形成的DeactivatedCas9（dCas9）不具有核酸內(nèi)切酶活性，但仍可與靶DNA 結(jié)合[28-29]。

1.2 CRISPR/Cas12的作用機(jī)制

CRISPR/Cas12 系統(tǒng)在分子診斷領(lǐng)域中使用較廣泛的蛋白包括Cas12a 和Cas12b 蛋白。與SpCas9 相比， Cas12a 的分子量更?。s1274 個(gè)氨基酸）。此外， Cas12a 僅需crRNA 即可激活酶切活性，并且crRNA 結(jié)構(gòu)比sgRNA 更簡單[30]。Cas12a/crRNA 復(fù)合物可識別5′末端含有（5′-（T）TTN-3′、5′-TYCV-3′和5′-TATV-3′等）PAM 位點(diǎn)的靶dsDNA（不同來源的Cas12 對PAM 位點(diǎn)的偏好不同），切割dsDNA 并產(chǎn)生粘性末端[31-33]。此外， Cas12a 還可進(jìn)行反式切割（或被稱為“側(cè)切”），能夠在Cas12a/crRNA 復(fù)合物與靶dsDNA 結(jié)合后非特異性地切割游離的單鏈DNA（Single stranded DNA， ssDNA）[34]。與Cas12a 相比，Cas12b（約1129 個(gè)氨基酸）分子量更小，但Cas12b 需要雙RNA（crRNA 和tracrRNA）引導(dǎo)，進(jìn)而識別以5′-TTN-3′為代表的PAM 序列。Cas12b 也具備反式切割活性[35]。通常， Cas12a 的最佳工作溫度約為37 ℃， 而Cas12b 的最佳切割溫度為48 ℃， 具備一定的嗜高溫特性[36]。

1.3 CRISPR/Cas13a的作用機(jī)制

與上述兩種CRISPR 系統(tǒng)相比， CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)并不具備識別DNA 的能力，只能識別帶有由A、U 或G 堿基組成的原間隔側(cè)翼序列（Protospacer flanking sequence， PFS）的RNA 靶標(biāo)。Cas13a 可在crRNA 引導(dǎo)下結(jié)合帶有PFS 序列的RNA，并特異性切割靶RNA。Cas13a 也具備反式切割非特異性單鏈RNA（Single stranded RNA， ssRNA）的能力。crRNA 與靶標(biāo)之間的單堿基錯(cuò)配對Cas13a 的活性影響很低，但2 個(gè)或2 個(gè)以上的堿基錯(cuò)配會嚴(yán)重降低蛋白活性[37-39]。

2 CRISPR/Cas 生物傳感的原理及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

常規(guī)的生物傳感過程可分為3 個(gè)環(huán)節(jié)，即生物信號的識別、放大和輸出。CRISPR/Cas 系統(tǒng)在生物傳感中可參與不同環(huán)節(jié)，可輔助生物信號識別、放大和輸出。以下分別闡述Cas9、Cas12 和Cas13a 系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用。

2.1 CRISPR/Cas9 生物傳感的原理及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

2.1.1 Cas9 輔助信號識別

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)參與生物傳感的信號識別環(huán)節(jié)，進(jìn)而觸發(fā)下一步的信號放大環(huán)節(jié)。Zhou 等[40]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9 觸發(fā)識別、切割內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增（Strand displacement amplification，SDA）方法（CRISDA）。首先，通過Cas9-sgRNA識別靶標(biāo)DNA 并在非靶標(biāo)鏈上形成一個(gè)切口，便于引物與切口附近的模板鏈結(jié)合；然后，在聚合酶和切刻內(nèi)切酶輔助下進(jìn)行SDA擴(kuò)增，生成大量dsDNA 產(chǎn)物；最后，使用熒光-淬滅基團(tuán)標(biāo)記的肽核酸（PNA）侵襲擴(kuò)增產(chǎn)物，利用終點(diǎn)熒光分析對靶核酸進(jìn)行定量分析。該方法以人類基因組9 號染色體為靶標(biāo)，檢出限可低至2.5 amol/L。

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對PAM序列存在高度依賴性，如何對無PAM 序列的核酸進(jìn)行檢測是較大的挑戰(zhàn)。PAM 遞呈寡核苷酸（PAM-mer）是一種含有PAM 區(qū)域的短單鏈DNA，可使Cas9 定向結(jié)合或切割無PAM 的靶標(biāo)。Wang 等[41]通過引入PAM-mer 序列“NGG”使Cas9 切割靶ssRNA/ssDNA，從而釋放特異性片段并觸發(fā)指數(shù)擴(kuò)增，生成大量富G擴(kuò)增產(chǎn)物，利用G-四鏈體與血紅素結(jié)合后具有類過氧化物酶活性的特性實(shí)現(xiàn)可視化檢測。該方法以單核細(xì)胞增生李斯特菌的ssDNA片段為靶標(biāo)，檢出限低至100 amol/L。

此外，單一的Cas9 系統(tǒng)也可直接檢測靶標(biāo)dsDNA。Zhang等[42]構(gòu)建了一種基于dCas9 檢測病原菌的檢測系統(tǒng)。如圖2A 所示，在靶標(biāo)DNA 上設(shè)計(jì)1 對PAM 位點(diǎn)，可被2 個(gè)不同的sgRNA 分別識別，并導(dǎo)致2個(gè)dCas9 同時(shí)結(jié)合在同一個(gè)靶標(biāo)上。由于這2 個(gè)dCas9 分別修飾了分裂的熒光素酶，二者同時(shí)結(jié)合靶標(biāo)使得熒光素酶結(jié)構(gòu)完整，因而可產(chǎn)生生物發(fā)光信號。該方法以結(jié)核分岐桿菌為檢測對象，在沒有核酸擴(kuò)增時(shí)靈敏度為0.01 amol/L，在35 次PCR 循環(huán)下靈敏度可達(dá)到30 amol/L。

盡管CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在信號識別環(huán)節(jié)中具有高特異性，但單一的CRISPR/Cas 系統(tǒng)檢測的靈敏度偏低[43]。利用Cas9 激活核酸擴(kuò)增提高靈敏度更適合低濃度的病原菌樣本檢測。

2.1.2 Cas9 輔助信號輸出

在信號輸出環(huán)節(jié)， CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過對靶標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確識別將核酸靶標(biāo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為可讀取的化學(xué)信號，從而減少非特異性靶標(biāo)的干擾[44]。Wang 等[45]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9 的側(cè)流核酸測定（CASLFA）方法。如圖2B所示，首先設(shè)計(jì)了聚腺嘌呤標(biāo)記的金納米顆粒（Au nanoparticles， AuNPs）-DNA探針并預(yù)包埋在結(jié)合墊上，使用生物素化的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas9/sgRNA 共同短暫孵育后滴在樣品墊上。AuNP-DNA 探針的聚A 序列會雜交sgRNA 莖環(huán)，與Cas9/sgRNA-生物素化擴(kuò)增子形成復(fù)合物，在T 線被預(yù)包被的鏈霉親和素捕獲，多余的AuNP-DNA 探針則被雜交捕獲在C 線上。CASLFA 方法可有效區(qū)分核酸擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的非特異信號的干擾，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物信號準(zhǔn)確輸入。該方法可用于單增李斯特菌、轉(zhuǎn)基因35S 啟動子和非洲豬瘟病毒的鑒定，其中單增李斯特菌的裸眼檢出限低至150拷貝。

此外， dCas9介導(dǎo)的體系顏色變化也可作為輸出信號。Bengtson等[46]提出了一種CRISPR/dCas9介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增DNA 檢測策略。從血液/尿液中提取DNA 后，使用生物素化的引物進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification， RPA）。dCas9/sgRNA 與RPA 產(chǎn)物結(jié)合，被鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠固定。采用ssDNA 標(biāo)記dCas9蛋白， ssDNA 與環(huán)狀引物雜交，在連接酶和聚合酶作用下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification， RCA）。RCA 產(chǎn)物折疊形成G-四鏈體， G-四鏈體與血紅素基團(tuán)結(jié)合催化顯色反應(yīng)。該方法無需復(fù)雜的設(shè)備，室溫下即可檢測，在15 min 內(nèi)可檢測低至10 拷貝的DNA。

2.1.3 基于CRISPR/Cas9 的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

基于CRISPR/Cas9 的生物傳感器已初步應(yīng)用于食源性病原菌檢測。Wang 等[47]將Cas9 nickase 與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合開發(fā)了基于一鍋法的RNA 檢測方法，將其用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測，最低可在20 μL的反應(yīng)體系中檢測到0.99 pmol/L 鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA，并驗(yàn)證了該體系對靶標(biāo)序列具有單核苷酸特異性。Wang 等[48]將CRISPR/Cas9 和側(cè)流層析試紙條相結(jié)合，利用Cas9-gRNA 識別靶標(biāo)DNA 使試紙條發(fā)生的顏色變化，實(shí)現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌的檢測，檢出限為63 CFU/mL。

Cas9 的特異性識別可有效減少非特異性靶標(biāo)的干擾，從而提高方法的特異性，相比于利用Cas12 和Cas13a 的反式切割活性進(jìn)行信號輸出的方式，簡化了切割的步驟[49-51]。但是， CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在信號輸出過程中形成的復(fù)合物較復(fù)雜，檢測低濃度樣品時(shí)易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象[52]；此外， sgRNA 的合成步驟繁瑣，成本較高。

2.2 CRISPR/Cas12生物傳感原理及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

2.2.1 Cas12 輔助信號放大

Cas12a/crRNA 的反式切割活性是指Cas12a 與靶標(biāo)核酸特異性結(jié)合后具有非特異性切割ssDNA 的能力。由于Cas12a 具有高周轉(zhuǎn)活性，當(dāng)其與靶標(biāo)DNA 結(jié)合后可依次對熒光-淬滅基團(tuán)修飾的ssDNA 進(jìn)行多次切割[53]。

在靶標(biāo)基因上可以設(shè)計(jì)多個(gè)檢測位點(diǎn)，利用多crRNA共同識別同一基因的不同位點(diǎn)能進(jìn)一步提高識別靶標(biāo)的概率，放大生物信號。Zeng等[43]開發(fā)了一種無需擴(kuò)增的多crRNA聯(lián)用的CRISPR/Cas12a檢測方法。與傳統(tǒng)的單crRNA檢測系統(tǒng)相比，多位點(diǎn)同時(shí)識別方法的靈敏度提高了64倍，檢出限低至約1 pmol/L[43]。

2.2.2 Cas12 輔助信號輸出

通過對ssDNA 報(bào)告探針進(jìn)行不同的信號標(biāo)簽修飾，結(jié)合Cas12 的反式切割活性，可將待測物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為電信號[54]、熒光信號[55]和比色信號[56]等，實(shí)現(xiàn)信號的靈活輸出。例如，在ssDNA 上分別修飾熒光基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)，當(dāng)Cas12a 或Cas12b 在靶基因的存在下被激活并發(fā)生反式切割時(shí)，可將靶基因信號轉(zhuǎn)化為熒光信號輸出[57-59]。

通過切割熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)雙標(biāo)記的ssDNA 進(jìn)行信號輸出的成本較高。Wang 等[12]基于氧化石墨烯可吸附被FAM 修飾的長ssDNA（F-ssDNA）并淬滅其熒光的原理開發(fā)了一種單熒光基團(tuán)標(biāo)記信號探針的方法（圖3A）。Cas12a 反式切割F-ssDNA 使DNA 長度變短，導(dǎo)致氧化石墨烯對其的吸附能力降低，熒光淬滅效果變差。相比于雙標(biāo)記ssDNA，該方法可節(jié)約65%的成本。以沙門氏菌為檢測對象時(shí)，檢出限低至50 拷貝。

除了熒光和比色信號輸出的方式， CRISPR/Cas12系統(tǒng)還可將生物分子的信號轉(zhuǎn)化并輸出為電信號和表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）信號，在定性分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)定量檢測。Liu 等[60]提出了一種由CRISPR/Cas12a 介導(dǎo)的基于SERS 的生物傳感器的核酸現(xiàn)場檢測策略。利用LAMP 擴(kuò)增靶DNA，在電極上修飾ssDNA，其中ssDNA 一端帶有脂質(zhì)體包裹的信號分子。Cas12a 識別靶DNA 后利用反式切割活性切割電極上的ssDNA，使得ssDNA 濃度降低。加入表面活性劑后，脂質(zhì)體破裂釋放出信號分子，可用于SERS 的檢測信號。該方法已成功應(yīng)用于鴨肉摻假分析，肉眼檢出限低至10 pmol/L。Suea-Ngam 等[61]提出了一種耦聯(lián)銀金屬化的無擴(kuò)增電化學(xué)CRISPR/Cas 生物傳感器（E-Si-CRISPR）。此傳感器的電極修飾了ssDNA 和CRISPR/Cas12a，當(dāng)存在靶基因時(shí)， Cas12a 的反式切割活性被激活， ssDNA 報(bào)告子被裂解，ssDNA 表層電極被降解。在Cas12a 切割后對電極進(jìn)行銀金屬化，銀沉積的程度與剩余的ssDNA 報(bào)告子的量成正比。該方法以MRSA 基因?yàn)闄z測對象，檢出限為3.5 fmol/L，定量限為10 fmol/L。

2.2.3 基于CRISPR/Cas12的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

將CRISPR/Cas12 體系與等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)用，利用Cas12 的反式切割活性對ssDNA 進(jìn)行切割，結(jié)合熒光信號變化或免疫層析試紙條等信號讀取方式實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測，在食源性病原菌檢測領(lǐng)域中已有較多應(yīng)用[62-67]。Cas12a 除了對ssDNA 具有反式切割活性外，還可以切割具有高級結(jié)構(gòu)的DNA，如G-四鏈體DNA[68]。Wang 等[69]利用G-四鏈體增強(qiáng)特異性配體的熒光發(fā)射，而Cas12a 反式切割使G-四鏈體的高級結(jié)構(gòu)被破壞，從而無法增強(qiáng)熒光配體的發(fā)射信號，基于此構(gòu)建了免標(biāo)記的熒光檢測方法，對副溶血弧菌的檢出限低至136拷貝。除此以外， G-四鏈體DNA 與血紅素結(jié)合的復(fù)合物具有類過氧化物酶活性，可催化顯色底物發(fā)生氧化反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化。當(dāng)Cas12a 的反式切割造成G 四鏈體結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，該催化活性喪失，無法發(fā)生顏色變化（圖3B）[21]。該方法可以檢測每反應(yīng)9.8 CFU的副溶血性弧菌。

由于Cas12 對DNA 的靶向識別，使其能與大多數(shù)核酸擴(kuò)增方法結(jié)合，其反式切割活性可進(jìn)一步提高靈敏度，并實(shí)現(xiàn)信號的靈活轉(zhuǎn)換與輸出，因此已成為分子檢測領(lǐng)域中應(yīng)用最普遍的一種Cas 蛋白。

2.3 CRISPR/Cas13a生物傳感原理及在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

2.3.1 Cas13a輔助信號放大

與Cas12 類似，利用Cas13a 的反式切割活性可以放大生物信號，提高靈敏度。多個(gè)Cas13a/crRNA 共同識別可以增強(qiáng)信號放大能力，進(jìn)一步提高靈敏度，檢測到豐度更低的靶標(biāo)[70]。Li 等[71]在還原氧化石墨烯-場效應(yīng)晶體管（rGO-FET）芯片上通過ssRNA 修飾AuNPs，利用多組串聯(lián)的Cas13a/crRNA 同時(shí)識別靶標(biāo)RNA 并激發(fā)反式切割活性，使rGO-FET 芯片表面修飾的AuNPs-RNA 報(bào)告子被Cas13a 裂解，引起電流信號變化，實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)RNA 的檢測。該方法檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的檢出限為1.56 amol/L。SARS-CoV-2主要通過氣溶膠傳播，但新冠病毒疫情爆發(fā)時(shí)在食品中也檢出SARS-CoV-2。Lopez-Valls等[72]利用Cas13a-crRNA 識別靶標(biāo)RNA，觸發(fā)Cas13a 反式切割，裂解與AuNPs 偶聯(lián)的ssRNA，誘導(dǎo)膠體金聚集，實(shí)現(xiàn)可視化檢測（圖4A）；將其與等溫?cái)U(kuò)增級聯(lián)，可在30 min 內(nèi)完成SARS-CoV-2 的檢測。

2.3.2 Cas13a 輔助信號輸出

Cas13a 可以通過反式切割熒光-淬滅基團(tuán)修飾的ssRNA 輔助信號輸出，將生物信號轉(zhuǎn)化成易檢測的熒光信號。Gootenberg 等[7]開發(fā)了SHERLOCK 平臺，利用Cas13a 識別RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物，反式切割報(bào)告子釋放的熒光信號（圖4B），在1 h 內(nèi)即可完成檢測。該方法可用于寨卡病毒、登革熱病毒和大腸桿菌等目標(biāo)菌的檢測，以寨卡病毒為例，檢出限低至20 amol/L。此外， An 等[73]將RPA 與CRISPR/Cas13a 聯(lián)用，建立了針對沙門氏菌的檢測方法。將Cas13a 試劑與RPA 試劑混合， Cas13a 識別擴(kuò)增產(chǎn)物，反式切割熒光報(bào)告子，釋放熒光信號。單管RPA-Cas13a 法的檢測時(shí)間少于20 min， 檢出限為102 拷貝，與PCR 法相當(dāng)。為滿足現(xiàn)場檢測的需求，研究人員開發(fā)了一些自動化的檢測裝置。Chandrasekaran 等[74]研發(fā)了一種DISCoVER（一種無RNA 提取、CRISPR/Cas13a 介導(dǎo)的微流體檢測平臺）檢測平臺。樣品在裂解緩沖液中熱失活后，加入重力微流體盒中，在對靶標(biāo)LAMP 擴(kuò)增后進(jìn)行T7 轉(zhuǎn)錄， Cas13a 非特異性切割熒光報(bào)告子， DISCoVER 可在60 min 內(nèi)自動運(yùn)行測定和讀取熒光，對SARS-CoV-2 的靈敏度為40 copy/μL。

2.3.3 基于CRISPR/Cas13a的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

將CRISPR/Cas13a 與核酸擴(kuò)增聯(lián)用，利用T7 RNA 聚合酶將核酸擴(kuò)增生成的DNA 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，結(jié)合Cas13a 對RNA 的靶向識別功能，也可用于食源性病原菌的檢測。Liu 等[75]開發(fā)了基于PCR-Cas13a的生物傳感器，用于檢測食源性病原菌，對金黃色葡萄球菌的檢出限低至1.5 copy/μL。該傳感器被用于水樣和牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的檢測，準(zhǔn)確率分別為99.44%和99.00%，檢測成本（0.497 美元）低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法（0.670 美元）。與該傳感器類似， Zhou 等[76]設(shè)計(jì)的基于CRISPR/Cas13a 的細(xì)菌檢測平臺可在4 h 內(nèi)檢出低至1 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌。相比于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，該方法的靈敏度更高；與菌落平板計(jì)數(shù)法相比，檢測時(shí)間更短。

Cas13a 系統(tǒng)能直接識別RNA，在病毒檢測方面具有很大優(yōu)勢。但是，將Cas13a 用于DNA 檢測時(shí)需通過T7RNA 聚合酶將DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA，步驟更繁瑣，并且作為信號報(bào)告子的RNA 的合成和修飾成本遠(yuǎn)高于DNA，因而Cas13a 的使用相較于Cas12 更少。

3 基于CRISPR/Cas的多重生物傳感器及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

目前CRISPR/Cas 用于單個(gè)種類病原菌檢測的應(yīng)用較多，但食品中常存在多病原菌混合污染的情況，而單重檢測方法難以滿足多病原菌同時(shí)分析的需求。通過多重檢測的方案對食品中混合污染的病原菌進(jìn)行檢測，可有效提高檢測效率，節(jié)省人工和試劑成本。由于Cas12 和Cas13a 的反式切割活性不具有核酸序列選擇性，因此采用單一的Cas 蛋白在單一反應(yīng)管中進(jìn)行多目標(biāo)同時(shí)檢測面臨較大的困難。為了解決該難題，研究人員進(jìn)行了諸多嘗試，主要解決方案包括兩類。（1）利用不同Cas 蛋白對序列切割的選擇性偏好同時(shí)檢測不同靶標(biāo)Su 等[77]開發(fā)了基于RPA 和Cas12a、Cas13a 雙通道正交檢測的方法（圖5A）。利用Cas12a 和Cas13a 分別識別和切割DNA 和RNA 靶標(biāo)，通過對RNA 和DNA 報(bào)告探針進(jìn)行不同的抗體修飾使其被試紙條上相應(yīng)的抗體捕獲，從而實(shí)現(xiàn)雙靶標(biāo)同時(shí)檢測。利用該方法檢測SARS-CoV-2 基因組的ORF1ab 和N 基因，檢出限為10 拷貝。（2）單一的Cas 蛋白結(jié)合微流體、機(jī)器學(xué)習(xí)和空間編碼等技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同信號區(qū)分Bruch 等[78]開發(fā)了CRISPR/Cas13a 介導(dǎo)的微流體多重電化學(xué)傳感器。靶RNA 存在時(shí)會激活Cas13a/crRNA 的反式切割活性，裂解報(bào)告RNA 鏈。通過在微流體上設(shè)計(jì)多個(gè)通道實(shí)現(xiàn)不同靶標(biāo)的區(qū)分，從而實(shí)現(xiàn)多重檢測。該方法可用于檢測miR-19b 和miR-20a，檢出限均為10 nmol/L。Ackerman 等[79]開發(fā)了用于核酸多重評估的組合陣列反應(yīng)（CARMEN）。CARMEN 將針對不同靶標(biāo)的CRISPR 試劑分別包封在不同的納升液滴內(nèi)，然后分散在微孔陣列中。當(dāng)多重核酸擴(kuò)增產(chǎn)物加入到微陣列中時(shí)，對應(yīng)相同靶標(biāo)的CRISPR 試劑與擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生匹配，使Cas13a 切割報(bào)告子RNA，產(chǎn)生熒光信號。CARMEN 可同時(shí)區(qū)分169 種人類相關(guān)病毒，同時(shí)還能對甲型流感毒株全面分型。除此之外，利用空間編碼的水凝膠微粒（HMP）和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)也能構(gòu)建多重檢測系統(tǒng)（Cas-loaded annotated micro-particles，CLAMP）[80]。如圖5B 所示，首先將Cas 蛋白固定在空間編碼的HMP 中，將每個(gè)HMP 變成可用于核酸檢測的離散容器。每種帶有空間代碼的HMP 都對應(yīng)唯一的靶標(biāo)，在識別預(yù)期的核酸靶標(biāo)后， Cas12a/crRNA 復(fù)合物切割ssDNA-FQ 探針，釋放HMP 內(nèi)部的熒光信號，在單個(gè)反應(yīng)罐中實(shí)現(xiàn)多重核酸檢測。

將CRISPR/Cas 用于多種食源性病原菌的同時(shí)檢測已經(jīng)有了初步的嘗試。Qian 等[81]研發(fā)了一種基于Cas12a 的滑閥輔助微流控芯片。將設(shè)計(jì)的Cas12a 檢測試劑分裝于兩個(gè)檢測室中，利用滑閥和注射器將雙重LAMP 擴(kuò)增子與CRISPR/Cas12a 檢測體系混合，在紫外燈照射下可肉眼觀察結(jié)果。該方法最低可檢出20 拷貝的沙門氏菌DNA 和30 拷貝的副溶血弧菌DNA。Xing 等[82]開發(fā)了一種手指驅(qū)動的微流體傳感器，在不同檢測室中置入針對不同病原菌的CRISPR/Cas12a 試劑，通過手指按壓使得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測室，靶標(biāo)存在時(shí)對應(yīng)的檢測室即可顯出熒光。該方法可同時(shí)檢測7 種食源性病原菌，檢出限低至500 CFU/mL?？傮w而言，由于CRISPR/Cas 多重傳感器的構(gòu)建具有較大困難，在多種食源性病原菌同時(shí)檢測中的應(yīng)用還不成熟，但是， CRISPR/Cas傳感器在其它靶標(biāo)中的應(yīng)用可為食源性病原菌多重檢測提供思路和參考。

4 總結(jié)與展望

基于CRISPR/Cas 的生物傳感器具有良好的通用性和可編程性，可用于檢測多種食源性病原菌。經(jīng)過巧妙的設(shè)計(jì)，許多CRISPR/Cas 耦聯(lián)核酸擴(kuò)增的方法可檢出低至amol/L 的靶標(biāo)核酸，具有極高的靈敏度。將CRISPR/Cas 與SERS、側(cè)流免疫層析、顯色和熒光等信號輸出方式結(jié)合，可在不使用專門儀器的條件下實(shí)現(xiàn)食源性病原菌的檢測，便于現(xiàn)場測定[83]。

然而，基于CRISPR/Cas 的檢測技術(shù)仍然存在一些挑戰(zhàn)。（1）Cas效應(yīng)子對PAM或PFS的識別要求使某些序列檢測受到限制[84]。盡管已開發(fā)了無需PAM 序列的檢測方法，但這些方法的靈敏度和特異性較差，需進(jìn)一步研究Cas 蛋白的作用機(jī)制，獲取一些人工改造的Cas 蛋白，增加Cas 蛋白的種類或其PAM 序列的選擇性，使其能用于非傳統(tǒng)PAM序列依賴的核酸序列檢測。（2）雖然優(yōu)化的crRNA可減少CRISPR/Cas測定中的脫靶效應(yīng)，但脫靶現(xiàn)象在實(shí)際測定中難以避免，并且可能導(dǎo)致結(jié)果誤判。因此，加強(qiáng)計(jì)算機(jī)算法對脫靶效應(yīng)的評估以及crRNA 序列設(shè)計(jì)，提高CRISPR/Cas 的靶向識別作用，將是一個(gè)重要的研究方向。（3）Cas蛋白的非特異性反式切割能力使得多重檢測中不同靶標(biāo)的信號難以區(qū)分，多重檢測仍面臨較大挑戰(zhàn)。開發(fā)并普及微流控芯片，降低芯片和儀器成本，將極大地促進(jìn)多重檢測方法的推廣應(yīng)用。（4）目前，核酸擴(kuò)增與CRISPR/Cas結(jié)合只可定性分析病原菌，定量檢測性能仍需提高。探究核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas切割反應(yīng)過程的動力學(xué)機(jī)理，研究二者的互作機(jī)制，減少CRISPR/Cas 與核酸擴(kuò)增的相互抑制，是實(shí)現(xiàn)定量檢測的重要途徑。（5）上述部分檢測方法還未拓展應(yīng)用于檢測食源性致病菌，但對開發(fā)食源性致病菌傳感器具有借鑒意義。

綜上， CRISPR/Cas檢測技術(shù)目前還不能取代熒光定量qPCR 在病原菌檢測領(lǐng)域的地位。另外，關(guān)于CRISPR/Cas傳感器的使用標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范仍需要大力完善。隨著各種相關(guān)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，基于CRISPR/Cas的生物傳感器在食源性病原菌現(xiàn)場檢測中將發(fā)揮越來越重要的作用。