摘要： 【目的】研究耕作系統(tǒng)對(duì)土壤微生物群落的調(diào)節(jié)能力，為合理布局耕作系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳择R鈴薯連作為對(duì)照種植系統(tǒng)，在4 種條件下（土壤滅菌加施肥、土壤滅菌不施肥、土壤不滅菌加施肥、土壤不滅菌不施肥） 設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn)。通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增并測(cè)序水稻—馬鈴薯輪作（以下簡稱“稻薯輪作”） 和馬鈴薯連作系統(tǒng)中每個(gè)種植季節(jié)作物根區(qū)土壤樣本的細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)域，并比較細(xì)菌群落的物種組成、多樣性、功能組成和生態(tài)網(wǎng)絡(luò)?！窘Y(jié)果】稻薯輪作可顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在未滅菌條件下，輪作施肥和未施肥土壤的細(xì)菌群落豐富度指數(shù)分別顯著提高15.62% 和9.05%，香農(nóng)多樣性指數(shù)分別顯著提高2.45% 和1.71%；而連作土壤細(xì)菌群落的物種多樣性和豐富度無顯著變化。在土壤滅菌后，稻薯輪作土壤細(xì)菌群落物種的豐富度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)可提高到滅菌前水平；而連作土壤細(xì)菌群落物種的香農(nóng)多樣性指數(shù)顯著降低，豐富度僅在施肥時(shí)恢復(fù)到土壤滅菌前水平。稻薯輪作和馬鈴薯連作土壤細(xì)菌群落功能組成差異分析表明：稻薯輪作可顯著提高13 類土壤功能菌群的豐度；而連作僅能提高4 類土壤功能菌群的豐度，其中包括幾丁質(zhì)分解菌和植物病原菌。與連作相比，輪作土壤細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的介數(shù)中心性、邊數(shù)、圖密度、節(jié)點(diǎn)數(shù)、平均度、圖徑、模塊性和平均路徑長度分別提高了10.00 倍、2.50 倍、2.40 倍、1.10 倍、0.64 倍、0.63 倍、0.55 倍和0.40 倍；而細(xì)菌病原菌屬群體生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的介數(shù)中心性、圖密度、邊數(shù)、平均度、節(jié)點(diǎn)數(shù)和度中心性分別降低了71.4%、67.7%、50.9%、36.1%、23.2% 和11.1%。此外，冬季馬鈴薯種植土壤的病原菌屬群體物種的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲄?shù)也較夏季耕作土壤顯著降低?！窘Y(jié)論】稻薯輪作可顯著提高土壤細(xì)菌群落的物種和功能多樣性及調(diào)控土壤細(xì)菌群落物種的相互作用，對(duì)土壤細(xì)菌群落具有顯著的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞： 水稻—馬鈴薯輪作；馬鈴薯連作；細(xì)菌物種多樣性；功能組成；生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S344.17 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 03?0001?16

中國冬季約有1.6×107 hm2 冬閑稻田[1]，合理利用冬閑稻田可為糧食安全作出巨大貢獻(xiàn)。由于馬鈴薯（Solanum tuberosum L.） 喜好冷涼生長環(huán)境，在冬閑稻田大力推廣水稻—馬鈴薯輪作（以下簡稱“稻薯輪作”） 種植模式具有良好的發(fā)展前景。然而，田間作物生長常受到土壤細(xì)菌群落的影響，評(píng)估和探明稻薯輪作模式對(duì)土壤細(xì)菌群落的調(diào)節(jié)效應(yīng)，可為土壤微生物群落的管理提供理論依據(jù)。

土壤細(xì)菌群落是抑制土傳病菌[2-5]、促進(jìn)土壤有機(jī)物和無機(jī)物生物地球化學(xué)循環(huán)[6-7]等生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能的資源庫。連作生產(chǎn)引起土傳病害暴發(fā)，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。土壤微生物群落中，病原菌屬中的有益菌群常常發(fā)揮病菌抑制的關(guān)鍵作用[5， 9-11]，且病原菌屬內(nèi)的有益菌可能與致病菌形成互作關(guān)系。因此，利用耕作系統(tǒng)調(diào)節(jié)土壤菌群結(jié)構(gòu)、防控土傳病害是重要的農(nóng)業(yè)措施[12]。前人對(duì)間作[13-15]和輪作系統(tǒng)[16-18]的研究與實(shí)踐，減輕了土傳病菌造成的損失[19-20]，表明較好的耕作系統(tǒng)中微生物群落物種多樣性較高，且病原菌的16S 基因拷貝數(shù)豐度較低。鑒于目前還無準(zhǔn)確鑒定土壤環(huán)境中作物致病菌的高通量方法，本研究結(jié)合細(xì)菌群落物種多樣性、功能多樣性、共生網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性等微生態(tài)指標(biāo)，深入分析了稻薯輪作較馬鈴薯連作的土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)，為定性稻薯輪作系統(tǒng)的生態(tài)效應(yīng)提供理論依據(jù)。

利用擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，可分析微生物群落潛在的種間互作模式[7， 21-23]。宿主根系微生物菌群由有益菌群和有害菌群共同組成[24]，且用擴(kuò)增子技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在菌屬水平上檢測(cè)前人已報(bào)道的病原菌屬（包含致病菌和有益菌），再加上擴(kuò)增子技術(shù)以ASVs （擴(kuò)增序列變體） 代替OTUs 的方法提高了對(duì)微生物群落物種的分辨率[25]，可將耕作系統(tǒng)對(duì)土壤微生物群落的影響聚焦到病原菌屬群體，進(jìn)而利用網(wǎng)絡(luò)分析表征病原菌屬微生物群體內(nèi)的互作模式對(duì)耕作系統(tǒng)的響應(yīng)，可明確病原菌屬中微生物群體的種間互作模式在耕作系統(tǒng)間的差異特征，為在群體水平上分析不同耕作系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)差異提供新思路。然而，目前尚未有以此視角分析耕作系統(tǒng)間物種生態(tài)網(wǎng)絡(luò)差異的研究。

前人研究了稻薯輪作對(duì)土壤瘡痂病菌的抑制效果[26]，該研究利用平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法比較了基于稻薯輪作的不同耕作系統(tǒng)中土壤瘡痂病菌數(shù)量的差異，認(rèn)為在休閑期種植綠肥作物或采用休耕措施可抑制瘡痂病菌，但種植水稻對(duì)土壤瘡痂病菌群體的效應(yīng)還有待深入研究，且平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法對(duì)土壤微生物群體的調(diào)查不夠全面[27]。此外，施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要措施，干擾土壤原有菌群可影響作物生長，因此，本研究設(shè)置施肥、土壤滅菌等處理，深入分析滅菌、施肥、種植季節(jié)、耕作模式等因素對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示稻薯輪作模式對(duì)土壤細(xì)菌群落的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為從稻薯輪作處理和馬鈴薯連作處理中采集的作物根區(qū)土壤，具體處理見1.1.1 節(jié)。

1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究模擬稻薯輪作系統(tǒng)[1]， 在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類作物研究所試驗(yàn)地（25°8′15″N， 102°45′5″E）設(shè)計(jì)稻薯輪作和馬鈴薯連作模式的對(duì)比盆栽試驗(yàn)。在溫室內(nèi)采集0～20 cm 土層土壤，混勻后依次分裝土壤25 kg 至80 個(gè)盆（不漏水， 直徑30 cm×高45 cm） 內(nèi)作為后續(xù)作物種植的土壤基質(zhì)；采集3 份混勻土壤樣品作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析的對(duì)照土壤樣品（CK，3 個(gè)重復(fù)）。將80 盆土壤隨機(jī)平均分為2 份，其中40 盆土壤單獨(dú)裝入透明塑料袋中，用高壓滅菌鍋121 ℃ 滅菌45 min 后重新裝回盆內(nèi)。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)（耕作模式×土壤滅菌×土壤施肥×種植季節(jié)） 將80 盆土壤擺放于大棚內(nèi)（圖1），其中，施肥處理的施肥量為每盆有機(jī)肥（綜合肥力≥5%） 500 g，并按尿素（含純氮46.4%）2.320 g、過磷酸鈣（P2O5 含量16%） 5.874 g、馬鈴薯專用肥（N-P2O5-K2O 含量為10%-8%-18%）7.750 g 的施肥水平施用化學(xué)肥料。施肥水平與2011—2015 年間水稻和馬鈴薯的田間施肥量相當(dāng)。選擇由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻作物研究所育成的水稻品種滇雜36 和馬鈴薯品種青薯9 號(hào)為供試作物。以青薯9 號(hào)連作2 茬（包括夏作和冬作）、水稻滇雜36—青薯9 號(hào)輪作1 輪（2 茬，包括夏作和冬作） 進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。馬鈴薯和水稻夏作時(shí)間為2016 年4 月18 日，馬鈴薯冬作時(shí)間為2016年11 月20 日；其中，水稻育秧時(shí)間為2016 年4 月18 日—2016 年6 月10 日，插秧時(shí)間為2016年6 月10 日。連作土壤盆栽中，每盆土壤播種1 塊健康且大小一致的塊莖，輪作土壤中移栽1 株健康且大小一致的水稻三葉稻苗。馬鈴薯和水稻夏作作物分別于2016 年8 月7 日和2016 年10 月13 日收獲，冬作馬鈴薯于2017 年4 月3 日收獲。作物生長期間，及時(shí)拔除雜草并根據(jù)作物需水量澆水。

1.1.2 土壤樣品采集及保存

于每季作物（夏季水稻或馬鈴薯及冬季馬鈴薯） 收獲時(shí)，戴上手套和口罩，用不銹鋼鏟將作物根系取出，采用抖落法將非根區(qū)土壤抖回盆內(nèi)，用滅菌毛刷（每個(gè)處理單獨(dú)使用毛刷） 收集緊密結(jié)合在作物根系表面的土壤于滅菌保鮮膜上，再用滅菌的不銹鋼勺轉(zhuǎn)移至50 mL 無菌離心管中，用于提取土壤DNA。共采集了17 個(gè)處理的51份土壤樣品， 分別標(biāo)記為CK、 CCAFs、 CCAnFs、CCunAFs、CCunAnFs、RCAFs、RCAnFs、RCun-AFs、RCunAnFs、CCAFw、CCAnFw、CCunAFw、CCunAnFw、RCAFw、RCAnFw、RCAnFw 和RCunAnFw（CC 表示連作，RC 表示輪作，A 表示滅菌，unA 表示未滅菌，F(xiàn) 表示施肥，nF 表示未施肥，s 表示夏作，w 表示冬作），置于冰上送至實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)于?80 ℃ 冰箱備用。

1.2 土壤細(xì)菌群落16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)測(cè)序

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

遵循E.Z.N.A?土壤DNA 試劑盒（Omega Biotek，Norcross，GA，USA） 的操作手冊(cè)提取土壤樣品總DNA。先用1% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 質(zhì)量，然后用NanoDrop 2000 UV-vis 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Wilmington，USA） 檢測(cè)樣品DNA 濃度和純度。以提取的DNA 為模板，采用PCR 技術(shù)以引物對(duì)338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） 在ABI GeneAmp?9700 PCR 儀（ABI，CA，USA） 上擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4 高變區(qū)。PCR 反應(yīng)體系為：5×TransStart Fast-Pfu 緩沖液4.0 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5 μmol/L 正、反向引物各0.8 μL，TransStart FastPfuDNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加ddH2O至20.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃ 預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)的95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，隨后72 ℃ 延伸10 min，并于4 ℃ 保存。每個(gè)樣品PCR 擴(kuò)增3 次；PCR 終產(chǎn)物按照AxyPrep DNA 膠提取試劑盒（AxygenBiosciences，Union City，CA，USA） 操作指南，先用2% 瓊脂糖凝膠提取純化，再用QuantusTMFluorometer （Promega，USA） 定量。

1.2.2 Illumina Miseq 測(cè)序

擴(kuò)增子（PCR 產(chǎn)物） 等摩爾混樣后，利用IlluminaMiseq PE300 平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）雙端測(cè)序。原始測(cè)序序列質(zhì)控后，用FLASH 軟件按如下規(guī)則拼接：（1） 過濾reads 尾部質(zhì)量值小于20 的堿基，設(shè)置50 bp 的窗口，平均質(zhì)量值低于20，則截去后端堿基，舍棄質(zhì)控后小于50 bp的reads 以及含N 堿基的reads；（2） 根據(jù)序列間的重疊關(guān)系，將序列拼接成1 條，最小重疊為10 bp；（3） 允許拼接序列重疊區(qū)的最大錯(cuò)配比率為0.2，剔除不滿足條件的序列；（4） 根據(jù)序列首尾兩端的條碼和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，條碼允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。從上海美吉生物科技有限公司獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，將樣本擴(kuò)增子純凈序列上傳至GSA 數(shù)據(jù)庫（Genome Sequence Archive-CNCB-NGDC） 中（登錄號(hào)為：CRA006528）。

1.2.3 序列數(shù)據(jù)處理

進(jìn)一步舍棄純凈序列中序列數(shù)少于10 條的序列，以99% 為閾值，利用USEARCH v10.0 軟件[28]中的unoise3 算法對(duì)序列變體進(jìn)行聚類。利用VEARCH v2.15.0 軟件[29]中Uchime 算法，基于參考數(shù)據(jù)庫的方法檢測(cè)并移除嵌合體序列。基于SILVA v123 數(shù)據(jù)庫，每種序列變體的代表性序列用USEARCH v10.0 軟件的SINTAX 模塊、以0.6 為閾值進(jìn)行分類注釋。利用pipeline[30]中的R 代碼將樣本序列等量重抽樣至與序列數(shù)最少的樣本一致（12 634 條序列），供后續(xù)細(xì)菌群落α 和β 多樣性分析。

1.3 細(xì)菌群落物種生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

1.3.1 細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其拓?fù)涮卣饔?jì)算

利用R 軟件包SpiecEasi v1.1.2[23]，以獲得的擴(kuò)增序列變體構(gòu)建細(xì)菌稀疏性生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。移除特征表中的對(duì)照樣本數(shù)據(jù)，將剩余樣本數(shù)據(jù)分別依據(jù)耕作系統(tǒng)（連作和輪作）、滅菌（滅菌和未滅菌）、施肥（施肥和未施肥）、季節(jié)（夏作和冬作）等處理進(jìn)行拆分，得到8 個(gè)子處理特征表；對(duì)每個(gè)子處理特征表進(jìn)行總豐度排序，先選出豐度排名前400 的ASV，隨后基于文獻(xiàn)報(bào)道的病原菌屬[10]再選出病原菌屬中豐度排名前400 的ASV，共得到16 個(gè)子處理特征表，用于構(gòu)建細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。利用R 包Phyloseq v1.36.0 合并16 個(gè)子處理特征表、樣本數(shù)據(jù)采集信息表及與子處理特征表對(duì)應(yīng)的物種分類注釋表，以滿足SpiecEasi 包網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的格式；利用SpiecEasi 包中的glasso模塊和StARS 參數(shù)，構(gòu)建不同處理細(xì)菌群落的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，StARS 變化閾值設(shè)定為0.01。利用R 包igraph v1.2.6 計(jì)算各生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鳌?/p>

1.3.2 模塊檢測(cè)及節(jié)點(diǎn)角色鑒定

分析不同子處理的細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的模塊和節(jié)點(diǎn)角色。1 個(gè)模塊由在組內(nèi)有較高連通度而在組外幾乎無連通度的1 組節(jié)點(diǎn)組成，其中快速貪婪模塊優(yōu)化算法（fast greedy modularity optimization）[22]被用于模塊檢測(cè)，依據(jù)文獻(xiàn)[31-32] 報(bào)道，以模塊系數(shù)gt;0.4 為模塊判定閾值。其中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的角色依據(jù)模塊內(nèi)連通度（Zi） 和模塊間連通度（Pi） 分類，可分為4 類：參與節(jié)點(diǎn)，即與模塊中節(jié)點(diǎn)彼此相連卻很少與模塊外節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)，其Zilt;2.5 且Pilt;0.62；模塊節(jié)點(diǎn)，即與模塊內(nèi)節(jié)點(diǎn)高度連接的節(jié)點(diǎn)，其Zigt;2.5 且Pilt;0.62；連接節(jié)點(diǎn)，即連接不同模塊的節(jié)點(diǎn)，其Zilt;2.5 且Pigt;0.62；網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，即在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中具有高連通度的節(jié)點(diǎn)，其Zigt;2.5 且Pigt;0.62。

1.4 土壤細(xì)菌群落物種功能組成注釋

將細(xì)菌群落物種組成分析流程生成的特征表進(jìn)行重抽樣，結(jié)合物種分類注釋表，依據(jù)FAPROTAXv1.2.5 數(shù)據(jù)庫[33]對(duì)物種功能組成進(jìn)行分類，用于比較不同處理間群落物種功能的差異。

1.5 數(shù)據(jù)處理

除細(xì)菌群落物種功能組成差異分析外，均采用R v4.0.2 軟件分析不同處理間菌群結(jié)構(gòu)差異，顯著性水平默認(rèn)為α=0.05，具體步驟為：先利用amplicon 包的單因素方差分析模塊分析不同處理土壤細(xì)菌群落α 物種多樣性（多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)） 差異，再用Tukey-HSD 算法進(jìn)行post-hoc檢驗(yàn)；利用vegan v2.5.6 包的adonis2 函數(shù)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行多元方差分析，以量化不同處理因素對(duì)細(xì)菌群落物種組成的獨(dú)立效應(yīng)；利用randomForestv4.7.1.1 包分析細(xì)菌群落物種功能組成在不同處理間的重要性，選取最重要的前20 類功能組成，用STAMP v2.1.3 軟件中的Welch’st檢驗(yàn)進(jìn)一步分析不同處理對(duì)土壤細(xì)菌群落物種功能組成的影響，并可視化分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品中細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)分類群

共檢測(cè)到12 727 個(gè)擴(kuò)增序列變體，隸屬于26 門51 綱84 目159 科218 屬。門水平上，變形菌門（Proteobacteria，31.9%）、放線菌門（Actinobacteria，15.3%）、綠彎菌門（Chloroflexi，14.0%）、酸桿菌門（Acidobacteria，12.7%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，11.2%） 和厚壁菌門（Firmicutes，5.3%）的平均豐度最高；屬水平上，10 個(gè)高豐度菌屬分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，2.4%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，1.6%）、溶桿菌屬（Lysobacter，1.6%）、Blastocatella （1.5%）、諾卡氏菌屬（Nocardia，1.5%）、Flavisolibacter （1.5%）、 Roseiflexus（1.4%）、布氏菌屬（Bryobacter，1.4%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，1.3%） 和芽單胞菌屬（Gemmatimonas，1.0%）。其中，種植馬鈴薯可提高放線菌門細(xì)菌的物種豐度；種植水稻可急劇提高擬桿菌門細(xì)菌的物種豐度、急劇降低放線菌門的物種豐度（圖2a）。

2.2 細(xì)菌α 和β 多樣性

經(jīng)馬鈴薯或水稻夏作后，與種植前對(duì)照土壤（CK） 相比，滅菌土壤細(xì)菌群落物種多樣性呈降低趨勢(shì)；在未滅菌土壤中，細(xì)菌群落物種多樣性較CK 無顯著變化，且連作土壤和輪作土壤之間細(xì)菌群落物種多樣性也無顯著差異（圖2b）。

馬鈴薯冬作后，在稻薯輪作土壤中，滅菌土壤細(xì)菌群落的物種多樣性恢復(fù)到與CK 相當(dāng)?shù)乃?；而在馬鈴薯連作土壤中，僅細(xì)菌群落物種豐富度在施肥條件下恢復(fù)到CK 水平，而未施肥條件下的細(xì)菌群落物種豐富度仍低于CK；無論施肥與否，細(xì)菌群落物種香農(nóng)多樣性指數(shù)均顯著低于CK。在未滅菌土壤中，輪作施肥土壤的細(xì)菌群落物種多樣性較CK 顯著提高，且輪作未施肥土壤細(xì)菌群落的物種豐富度也顯著高于CK；輪作施肥土壤細(xì)菌的群落豐富度顯著高于馬鈴薯連作施肥土壤（圖2b）。

由表1 和圖2c 可知：土壤滅菌、耕作模式和施肥均能顯著影響土壤細(xì)菌群落物種組成（Plt;0.05），且輪作和滅菌是兩大主要影響因素。

2.3 細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)對(duì)不同處理的響應(yīng)

2.3.1 細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征對(duì)不同處理的響應(yīng)

以土壤細(xì)菌群落中高豐度優(yōu)勢(shì)菌群表征生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)不同處理的響應(yīng)，結(jié)果顯示：連作土壤菌群網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度遠(yuǎn)低于輪作土壤（圖3a 和3b）；夏作土壤菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度略高于冬作土壤（圖4a 和4b）；滅菌土壤網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)略低于未滅菌土壤，但其邊數(shù)遠(yuǎn)高于未滅菌土壤（圖5a 和5b）；施肥土壤和未施肥土壤菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度相似（圖6a 和6b）。以病原菌屬群體中優(yōu)勢(shì)菌群表征生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)不同處理的響應(yīng)，結(jié)果表明：連作土壤形成了復(fù)雜度遠(yuǎn)高于輪作土壤的細(xì)菌菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖3c 和3d），這與整體菌群構(gòu)建的菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)果相反；冬作土壤菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度遠(yuǎn)低于夏作土壤（圖4c 和4d）；滅菌土壤形成了較未滅菌土壤邊數(shù)更多的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖5c 和5d）；而未施肥土壤菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度略高于施肥土壤（圖6c 和6d）。

2.3.2 細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)角色對(duì)不同處理的響應(yīng)

以土壤細(xì)菌群體中高豐度優(yōu)勢(shì)菌群表征生態(tài)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)角色對(duì)不同處理的響應(yīng)，結(jié)果顯示：馬鈴薯連作土壤網(wǎng)絡(luò)的參與節(jié)點(diǎn)數(shù)和相對(duì)豐度均明顯低于稻薯輪作土壤，且具有1 個(gè)模塊節(jié)點(diǎn)（圖3e和3f）；夏作土壤網(wǎng)絡(luò)的參與節(jié)點(diǎn)數(shù)和相對(duì)豐度略高于冬作土壤（圖4e 和4f）；滅菌土壤的網(wǎng)絡(luò)模塊節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接節(jié)點(diǎn)數(shù)和相對(duì)豐度明顯低于未滅菌土壤，而參與節(jié)點(diǎn)數(shù)及豐度明顯高于未滅菌處理（圖5e 和5f）；施肥和未施肥土壤網(wǎng)絡(luò)間的節(jié)點(diǎn)角色相似（圖6e 和6f）。

以病原菌屬中高豐度菌群生態(tài)網(wǎng)絡(luò)表征細(xì)菌生態(tài)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)角色對(duì)不同處理的響應(yīng)，結(jié)果顯示：馬鈴薯連作土壤的模塊節(jié)點(diǎn)和參與節(jié)點(diǎn)數(shù)量更多、豐度更高，而連接節(jié)點(diǎn)數(shù)量更少、豐度更低，其豐度排名前400 的ASV 群體中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和邊的數(shù)量及豐度遠(yuǎn)高于稻薯輪作土壤，其網(wǎng)絡(luò)模塊節(jié)點(diǎn)分別屬于芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）細(xì)菌，而輪作土壤網(wǎng)絡(luò)的模塊節(jié)點(diǎn)屬于梭菌屬（Clostridium sensu stricto） 細(xì)菌（圖3g 和3h），說明不同種植模式下土壤細(xì)菌群落中的功能菌群存在顯著差異。夏作土壤網(wǎng)絡(luò)的模塊節(jié)點(diǎn)、連接節(jié)點(diǎn)和參與節(jié)點(diǎn)的數(shù)量及豐度均遠(yuǎn)高于冬作土壤，但其唯一的模塊節(jié)點(diǎn)屬于鏈霉菌屬細(xì)菌（圖4g 和4h），是馬鈴薯瘡痂病的致病菌屬。未滅菌土壤較滅菌土壤網(wǎng)絡(luò)的組成節(jié)點(diǎn)分為4 類，不僅含有1 個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，且其模塊節(jié)點(diǎn)和連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)量更多且豐度更高，但參與節(jié)點(diǎn)的數(shù)量較少且豐度較低，其網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和模塊節(jié)點(diǎn)分別屬于節(jié)桿菌屬、諾卡氏菌屬和芽孢桿菌屬細(xì)菌；而滅菌土壤的模塊節(jié)點(diǎn)分別屬于諾卡氏菌屬和假單胞菌屬（Pseudomonas） 細(xì)菌（圖5g 和5h）。施肥和未施肥土壤菌群網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)角色相似，在施肥土壤中有2 個(gè)模塊節(jié)點(diǎn)，均屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌（圖6g和6h）。

此外，菌群生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征（圖3i 和3j、圖4i 和4j、圖5i 和5j、圖6i 和6j） 與菌群生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)一致，在各處理土壤的病原菌屬物種群體生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中，屬內(nèi)或?qū)匍g節(jié)點(diǎn)互作關(guān)系頻繁，且在處理間表現(xiàn)出明顯的差異特征。

2.4 細(xì)菌功能組成對(duì)不同處理的響應(yīng)

由圖7 可知：土壤滅菌處理顯著提高了土壤中參與需氧化能異養(yǎng)（C 化合物代謝）、發(fā)酵（C 化合物代謝）、甲基化（C 化合物代謝）、甲醇氧化（C 化合物代謝）、尿素分解（N 化合物代謝）、硝酸鹽氨化（N 化合物代謝）、砷酸鹽呼吸（As 化合物代謝）、砷酸鹽異化還原（As 化合物代謝） 等生化過程的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度；而未滅菌處理顯著提高了土壤中參與硝化（N 化合物代謝）、好氧氨氧化（N 化合物代謝）、好氧亞硝酸鹽氧化（N 化合物代謝）、捕食和體外寄生（C 化合物代謝）、硫呼吸（S 化合物代謝）、光能異養(yǎng)（C 化合物代謝） 等生化過程的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度（圖7a）。施肥顯著提高了土壤中參與硫化合物的暗氧化（S 化合物代謝）、硫酸鹽呼吸（S 化合物代謝）、暗硫氧化（S 化合物代謝）、碳?xì)浠衔锝到猓– 化合物代謝）、脂肪族非甲烷烴類降解（C 化合物代謝）、芳香烴降解（C 化合物代謝）、暗鐵氧化（Fe 化合物代謝） 等生化過程的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度；而未施肥土壤顯著提高了參與捕食和體外寄生（C 化合物代謝）、固氮（N 化合物代謝）、甲烷合成（C 化合物代謝） 等生化過程的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度（圖7b）。馬鈴薯連作顯著提高了土壤中參與需氧化能異養(yǎng)（C 化合物代謝）、化能異養(yǎng)（C 化合物代謝）、幾丁質(zhì)溶解（C 化合物代謝） 等生化過程以及植物病原菌（C 化合物代謝） 等細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度；而稻薯輪作顯著提高了土壤中參與暗硫化合物氧化（S 化合物代謝）、硫化合物呼吸（S 化合物代謝）、暗硫氧化（S 化合物代謝）、發(fā)酵（C 化合物代謝）、甲基化（C 化合物代謝）、甲烷合成（C 化合物代謝）、富馬酸鹽呼吸（C 化合物代謝）、鐵呼吸（Fe 化合物代謝）、暗鐵呼吸（Fe 化合物代謝）、胞內(nèi)寄生（C化合物代謝）、亞硝酸鹽呼吸（N 化合物代謝）、亞硝酸鹽反硝化（N 化合物代謝）、氫暗氧化（H 化合物代謝） 等生化過程的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度（圖7c）。夏作土壤中顯著提高了土壤中與動(dòng)物寄生或共生（C 化合物代謝） 的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度；而冬作土壤中顯著提高了參與芳香族化合物降解（C 化合物代謝）、木質(zhì)素分解（C 化合物代謝）、硫酸鹽呼吸（S 化合物代謝）、硝酸鹽氨化（N 化合物代謝）、亞硝酸鹽氨化（N 化合物代謝）、錳氧化（Mn 化合物代謝）、砷酸鹽呼吸（As 化合物代謝）、砷酸鹽異化還原（As 化合物代謝） 等生化過程的細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度（圖7d）。

3 討論

當(dāng)前是探尋提高糧食產(chǎn)量和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)的農(nóng)業(yè)措施以應(yīng)對(duì)2050 年糧食挑戰(zhàn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[34-35]。本研究的主要目的是探明與馬鈴薯連作相比，稻薯輪作能否調(diào)控土壤細(xì)菌群落中的病原菌群體，并解析其調(diào)控機(jī)制。由于馬鈴薯連作經(jīng)常造成土傳病害暴發(fā)[19， 36]，而稻薯輪作具有巨大的增產(chǎn)潛力[1]，因此，本研究以馬鈴薯連作模式為對(duì)照設(shè)計(jì)了溫室盆栽試驗(yàn)，以分析稻薯輪作模式對(duì)土壤土傳病原菌屬菌群的影響；利用已有文獻(xiàn)報(bào)道的植物病原菌屬[10]中的高豐度物種[37]構(gòu)建細(xì)菌群落物種生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，以表征病原菌群的種間互作關(guān)系對(duì)耕作模式、種植季節(jié)、滅菌和施肥的響應(yīng)，結(jié)合不同處理中細(xì)菌群落的物種多樣性、生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、潛在功能組成、作物細(xì)菌病原菌屬菌群的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等指標(biāo)，綜合分析稻薯輪作模式對(duì)土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響。

3.1 稻薯輪作可顯著提高土壤細(xì)菌群落的物種多樣性

細(xì)菌群落物種多元方差分析表明： 耕作模式是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素（R2≥0.139 1%），這與已有研究中“輪作可改變土壤細(xì)菌群落物種多樣性”的觀點(diǎn)[18]一致；此外，滅菌土壤中輪作較連作可提高土壤細(xì)菌群落物種多樣性和豐富度，較高的香農(nóng)多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)表明稻薯輪作在維持或提升細(xì)菌群落物種多樣性方面較馬鈴薯連作模式有優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)果符合有關(guān)作物多樣化種植系統(tǒng)的觀點(diǎn)[38-39]；本研究還表明：連作土壤滅菌條件下，其細(xì)菌群落豐富度需要施肥才能提高到與對(duì)照水平相當(dāng)。以上結(jié)果表明：稻薯輪作及施肥措施在細(xì)菌群落物種多樣性的恢復(fù)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。然而，由于稻薯輪作模式屬于集約化耕作，故推薦在未來的研究和實(shí)踐中對(duì)該耕作模式進(jìn)行更為多樣化的設(shè)計(jì)[26]并優(yōu)化施肥方案，進(jìn)一步結(jié)合微生物宏基因組學(xué)技術(shù)，明確多樣化設(shè)計(jì)后稻薯輪作模式對(duì)土壤微生物群落物種多樣性的影響，提高該輪作模式的生產(chǎn)效益。

3.2 細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)是不同農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施的有效指標(biāo)

微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的主要效用是識(shí)別生態(tài)位中微生物群落物種的種間互作模式，并探索定向調(diào)控微生物群落的潛在有效手段或表征特定生態(tài)位中微生物群落物種的潛在種間互作關(guān)系[23， 40]。本研究利用SpeicEasi 包中的glasso 方法推斷不同處理下土壤中細(xì)菌群落的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征，該方法在構(gòu)建細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，相較于普遍采用基于相關(guān)性的方法，可在一定程度上消除網(wǎng)絡(luò)中虛假的種間互作關(guān)系。此外，研究中僅采用不同處理下土壤樣本中豐度排名前400 的ASV群體構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，其原因是網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建耗時(shí)，而生態(tài)位中高豐度物種可反映整個(gè)群落物種的互作趨勢(shì)[37， 40-42]，且核心微生物群體對(duì)作物產(chǎn)量[41]和耕作系統(tǒng)的可持續(xù)性[40]具有重要作用，故在構(gòu)建生態(tài)網(wǎng)絡(luò)時(shí)賦予高豐度物種更高的權(quán)重。

本研究顯示：稻薯輪作在高豐度菌群物種中形成了更為復(fù)雜和穩(wěn)健的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而馬鈴薯連作則在細(xì)菌病原菌群體中形成了更復(fù)雜和更穩(wěn)健的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即稻薯輪作對(duì)土壤細(xì)菌病原菌群有抑制作用[43]，表明在病原菌屬群體中構(gòu)建菌群物種的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)表征病原菌群對(duì)農(nóng)業(yè)措施的響應(yīng)、對(duì)采納合理的農(nóng)業(yè)措施具有重要的參考價(jià)值。本研究表明：冬作土壤菌群網(wǎng)絡(luò)受到抑制，這與前人研究結(jié)果[44]不盡一致，且本研究顯示：冬作極大地消除了細(xì)菌病原菌群體的物種生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，這一結(jié)果為在冬閑稻田推廣種植重要且適宜的細(xì)菌易感病作物時(shí)提供了重要的參考依據(jù)。此外，滅菌和未施肥土壤形成的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分別較未滅菌和施肥土壤形成了更高的網(wǎng)絡(luò)圖密度和更多的邊數(shù)，這可能與有益細(xì)菌群體對(duì)非生物逆境誘導(dǎo)的生物逆境（有益菌群對(duì)病菌入侵的防御）[45]和非生物逆境（未施肥） 響應(yīng)有關(guān)。滅菌打破了土壤細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的模塊節(jié)點(diǎn)和連接節(jié)點(diǎn)，卻促進(jìn)了參與節(jié)點(diǎn)的生成，表明參與節(jié)點(diǎn)在整個(gè)細(xì)菌群落中可能具有重要的生態(tài)功能；且滅菌土壤細(xì)菌群落的模塊節(jié)點(diǎn)由未滅菌土壤中的節(jié)桿菌屬和芽孢桿菌屬細(xì)菌變成了假單胞菌屬細(xì)菌，而已有研究表明假單胞菌屬中的許多物種具有馬鈴薯瘡痂病菌抑制效應(yīng)[5]，這種轉(zhuǎn)變表明滅菌土壤中發(fā)生了菌群的抗病響應(yīng)，這與土壤細(xì)菌群落的誘導(dǎo)抗性機(jī)制[45]較為吻合。本研究顯示：稻薯輪作土壤較馬鈴薯連作土壤的病原菌群網(wǎng)絡(luò)模塊節(jié)點(diǎn)和參與節(jié)點(diǎn)數(shù)量少、豐度低，而連接節(jié)點(diǎn)數(shù)量多，表明馬鈴薯連作對(duì)土壤病原菌群的調(diào)控效應(yīng)低于稻薯輪作[37]。值得注意的是，雖然施肥和未施肥土壤的細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的角色較相似，但兩者網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的物種組成極為不同，表明施肥也是有效調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的農(nóng)業(yè)措施[18]；但由于微生物群落中的物種間往往由于功能冗余的原因，導(dǎo)致施肥條件雖調(diào)節(jié)了土壤微生物的物種組成，但不一定影響微生物群體的網(wǎng)絡(luò)菌群互作結(jié)構(gòu)。與夏作相比，冬作可降低土壤細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的參與節(jié)點(diǎn)數(shù)及相對(duì)豐度，明顯降低病原菌群體生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的模塊節(jié)點(diǎn)、連接節(jié)點(diǎn)和參與節(jié)點(diǎn)的數(shù)量及相對(duì)豐度，且夏作土壤中唯一的模塊節(jié)點(diǎn)為鏈霉菌屬細(xì)菌，該屬致病菌可嚴(yán)重為害馬鈴薯塊莖，其中，馬鈴薯瘡痂致病菌基因組中的致病島基因可在屬內(nèi)物種間轉(zhuǎn)移[46]，使非致病菌可轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【??？梢?，冬作更有利于馬鈴薯生產(chǎn)。

本研究主要分析了細(xì)菌群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)對(duì)不同處理的響應(yīng)，但生態(tài)網(wǎng)絡(luò)只能刻畫土壤中微生物群落的相關(guān)關(guān)系，表征群落中特定菌群的互作模式以及不同處理中菌群互作模式的動(dòng)態(tài)變化；而物種間的實(shí)際互作關(guān)系（競(jìng)爭(zhēng)、合作、拮抗和共生） 需要進(jìn)一步的共培養(yǎng)試驗(yàn)予以證明。由于群落中物種數(shù)量巨大，當(dāng)前研究只能采取網(wǎng)絡(luò)分析的方法探索微生物群落在土壤中的潛在互作關(guān)系，為后期驗(yàn)證重要的菌株互作模式提供參考[47]。利用細(xì)菌群落物種組成數(shù)據(jù)構(gòu)建生態(tài)網(wǎng)絡(luò)推斷土壤原位微生物群落中潛在的種間互作關(guān)系、分析耕作模式對(duì)土壤微生物群落的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而利用具有高重用性、基于ASV 的微生物群落表征技術(shù)，對(duì)大田農(nóng)業(yè)管理措施具有重要的指導(dǎo)意義。

3.3 細(xì)菌代謝功能組成證實(shí)稻薯輪作的病原菌群調(diào)控機(jī)制

基于FAPROTAX v1.2.5 數(shù)據(jù)庫[33]注釋土壤細(xì)菌群落的物種潛在功能組成，結(jié)果表明：馬鈴薯連作顯著促進(jìn)了土壤中C 化合物代謝相關(guān)菌群的豐度，與前人對(duì)連作系統(tǒng)的研究結(jié)論[48-49]一致。盡管連作土壤C 代謝活動(dòng)的幾丁質(zhì)溶解過程對(duì)植物病害具有抑制作用[50]，但馬鈴薯連作較稻薯輪作仍顯著提高了土壤中植物病原細(xì)菌的相對(duì)豐度。馬鈴薯連作土壤細(xì)菌群落的功能組成多樣性顯著低于稻薯輪作土壤，且馬鈴薯連作土壤的C 化合物代謝菌群豐度顯著高于輪作土壤，進(jìn)一步表明馬鈴薯連作極大地促進(jìn)了其耕作土壤中C 素的分解，惡化了土壤環(huán)境，顯著提高了植物細(xì)菌性病害群體的相對(duì)豐度，這可能是造成細(xì)菌病害暴發(fā)的重要原因。同時(shí)，夏作顯著提高了土壤動(dòng)物寄生或共生細(xì)菌的相對(duì)豐度，而冬作則顯著提高了細(xì)菌群落的功能組成多樣性，表明冬作可能為作物和微生物提供了生態(tài)功能良好的環(huán)境，限制了細(xì)菌的寄生或共生過程，促進(jìn)了土壤中C 化合物和N 化合物的代謝，這與氣溫不影響土壤細(xì)菌功能多樣性的結(jié)論[51]相反。

本研究通過細(xì)菌群落功能組成注釋分析了不同處理對(duì)土壤細(xì)菌功能組成的影響，未來可結(jié)合本研究使用的病原菌群生態(tài)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行代謝物指標(biāo)檢測(cè)[52]和宏基因組測(cè)序[53]，對(duì)稻薯輪作系統(tǒng)的土壤微生態(tài)效應(yīng)進(jìn)行全面且深入的研究，并基于本研究結(jié)論設(shè)計(jì)和優(yōu)化更合理的稻薯輪作種植模式。

4 結(jié)論

與馬鈴薯連作相比，稻薯輪作可通過提升土壤細(xì)菌群落物種多樣性和功能多樣性降低土壤細(xì)菌群體中植物致病菌的相對(duì)豐度，提高土壤細(xì)菌群落物種微生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度和穩(wěn)健性，進(jìn)而抑制土傳病原菌屬細(xì)菌群體的物種微生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，降低致病菌群的物種豐度，發(fā)揮對(duì)土壤細(xì)菌群落中病原菌群體的調(diào)控作用。相較于夏作，冬作可打破土壤致病菌屬中物種間的微生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提升稻薯輪作系統(tǒng)對(duì)土傳細(xì)菌病原菌群體的抑制作用，有利于防控冬閑稻田土壤中的土傳細(xì)菌病害。

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責(zé)任編輯：何謦成

基金項(xiàng)目：國家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)體系（CARS-09-15P）。