侯維玲 喬云陽 吳小蕓 施會(huì)敏 曲高婷 張愛青

基金項(xiàng)目：江蘇省醫(yī)學(xué)會(huì)兒科醫(yī)學(xué)科研專項(xiàng)基金項(xiàng)目（SYH-32034-0073）；南京市衛(wèi)生科技發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YKK23209）

作者單位：1南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院兒科（郵編211100）；2南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科；3南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院兒科

作者簡(jiǎn)介：侯維玲（1983），女，碩士在讀，主要從事兒科學(xué)方面研究。E-mail：13770698345@163.com

△通信作者 E-mail：njaiqing@njmu.edu.cn

摘要：目的 探討鋅指蛋白281（ZNF281）在高糖（HG）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成中的作用及機(jī)制。方法 使用HG誘導(dǎo)RTECs以構(gòu)建糖尿病腎病模型，分為Control組、HG組和Mannitol組，使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。使用小干擾RNA（siRNA）在HG誘導(dǎo)的RTECs中敲低ZNF281的表達(dá)水平，分為Control組、HG組、HG+ZNF281 siRNA組和HG+ZNF281 vector組。使用腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMPK）激動(dòng)劑阿卡地新（AICAR）活化AMPK，分為Control組、HG組、HG+AICAR組和HG+二甲基亞砜組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)ZNF281、EMT和ECM合成相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平。結(jié)果 與Control組相比，HG組ZNF281、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（FN）和Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)水平降低；與HG組相比，HG+ZNF281 siRNA組和HG+AICAR組的EMT和ECM合成相關(guān)指標(biāo)的蛋白和mRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，同時(shí)HG+AICAR組ZNF281的蛋白和mRNA表達(dá)水平較HG組降低；在使用AICAR和轉(zhuǎn)染ZNF281過表達(dá)質(zhì)粒共處理的細(xì)胞中，AICAR+ZNF281組vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的表達(dá)水平較空載組升高，E-cadherin表達(dá)水平降低。結(jié)論 AMPK通過負(fù)向調(diào)控ZNF281的表達(dá)水平進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的RTECs中EMT和ECM合成。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎?。籘ristetraprolin蛋白；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細(xì)胞外基質(zhì)；AMP活化蛋白激酶類；腎小管間質(zhì)纖維化；鋅指蛋白281

中圖分類號(hào)：R587.24，R34文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20240031

Zinc finger protein 281 inhibits high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition and extracellular matrix synthesis in renal tubular epithelial cells

HOU Weiling1， QIAO Yunyang2， WU Xiaoyun2， SHI Huimin2， QU Gaoting2， ZHANG Aiqing3△

1 Department of Pediatrics， the Affiliated Jiangning Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 211100， China;

2 Department of Pediatrics， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University; 3 Department of Pediatrics，

the Fourth Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

△Corresponding Author E-mail： njaiqing@njmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the role and mechanism of zinc finger protein 281 （ZNF281） in high glucose （HG）-induced epithelial-mesenchymal transition （EMT） and extracellular matrix （ECM） synthesis in renal tubular epithelial cells （RTECs）. Methods HG induced RTECs were used to construct a diabetic kidney disease cell model， and cells were divided into the control group， the HG group and the mannitol group. Cell proliferation viability was detected by CCK-8. The expression of ZNF281 was knocked down in HG-treated RTECs using small interfering RNA （siRNA）. HG-induced RTECs after knockdown of ZNF281 were divided into the control group， the HG group， the HG+ZNF281 siRNA group and the HG+ZNF281 vector group. Adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK） was activated using AMPK agonist， acadexin （AICAR）， and then cells were divided into the control group， the HG group， the HG+AICAR group and the HG+dimethyl sulfoxide group. The expression levels of ZNF281， EMT and ECM synthesis-related indexes were detected by qPCR and Western blot assay. Results Compared with the control group， the protein and mRNA expression levels of vimentin， α-smooth muscle actin （α-SMA）， fibronectin （FN） and collagen Ⅰ （Col Ⅰ） were significantly higher， and the expression of E-cadherin was significantly lower in the HG group. Compared with the HG group， the protein and mRNA expression levels of EMT and ECM synthesis-related indexes were significantly changed in the HG+ZNF281 siRNA group and the HG+AICAR group. The protein and mRNA expression levels of ZNF281 were significantly reduced in the HG+AICAR group compared with the HG group. In cells co-treated with AICAR and transfected with ZNF281 plasmid， the expression levels of vimentin， α-SMA， FN and Col Ⅰ were significantly higher in the AICAR+ZNF281 group， and E-cadherin was significantly lower compared with that of the vector group. Conclusion AMPK inhibits EMT and ECM synthesis in HG-treated RTECs by negatively regulating the expression level of ZNF281.

Key words： diabetic nephropathies; tristetraprolin; epithelial-mesenchymal transition; extracellular matrix; AMP-activated protein kinases; tubulointerstitial fibrosis; zinc finger protein 281

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，以大量蛋白尿和腎小球?yàn)V過率降低為特征，是終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題［1-2］。腎臟纖維化是公認(rèn)的DKD的病理路徑，也是進(jìn)展至ESRD的必經(jīng)階段，其病理基礎(chǔ)包括細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多并沉積［3］。腎小管上皮細(xì)胞（renal tubular epithelial cells，RTECs）作為腎臟纖維化主要的效應(yīng)細(xì)胞之一，在DKD發(fā)病早期可異?；罨驮鲋常龠M(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化（tubular interstitial fibrosis，TIF）及ECM合成，是DKD病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是TIF發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制［5］，確定DKD的發(fā)病機(jī)制并找尋新的治療靶點(diǎn)是目前亟待解決的問題［6］。EMT和ECM合成相關(guān)蛋白包括E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，ColⅠ）。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是一類轉(zhuǎn)錄因子，能與多種基因啟動(dòng)子中的GC區(qū)域結(jié)合，在基因調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7-8］。ZNF是組織發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤相關(guān)疾病中更多是以高水平表達(dá)［9-10］。ZNF281可能與EMT相關(guān)，在炎癥性腸病中沉默ZNF281可明顯減少炎性因子釋放，降低纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平，并緩解由炎癥引起的組織細(xì)胞形態(tài)變化［11］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在糖尿病和DKD患者血清測(cè)序表達(dá)譜中腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMPK）明顯富集［12］，通過激活A(yù)MPK可以保護(hù)細(xì)胞免受炎癥、凋亡、各類應(yīng)激及EMT的影響［13］。AMPK可進(jìn)一步磷酸化多種下游轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控糖代謝、脂代謝及細(xì)胞增殖等過程［14-15］。本研究從AMPK出發(fā)，通過高糖（high glucose，HG）誘導(dǎo)RTECs建立DKD細(xì)胞模型，探討ZNF281在DKD中的調(diào)控機(jī)制，為DKD的臨床診治提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 小鼠RTECs由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎臟病中心饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；AMPK激動(dòng)劑阿卡地新（AICAR）購(gòu)自MCE；細(xì)胞總蛋白提取及樣本制備所需的裂解液和蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白免疫印跡法（Western blot）所使用的凝膠、電泳緩沖液、快速轉(zhuǎn)膜液及電泳設(shè)備均購(gòu)自賽維爾生物科技有限公司，凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司，聚偏氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)密理博公司，ZNF281抗體購(gòu)自武漢bioswamp公司，F(xiàn)N、ColⅠ、AMPK及磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，E-cadherin、vimentin、α-SMA、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自Affinity公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）相關(guān)試劑盒、CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PCR儀為Roche LightCycler 480；ZNF281小干擾RNA（siRNA）及相應(yīng)的空載對(duì)照（vector）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，同時(shí)配合使用該公司提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒；ZNF281過表達(dá)質(zhì)粒由南京科瑞斯生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 為篩選構(gòu)建DKD細(xì)胞模型的最適干預(yù)方案，使用5.5、30、50、80 mmol/L葡萄糖干預(yù)細(xì)胞并設(shè)置12、24、36、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RTECs并接種于96孔板中，預(yù)留空白對(duì)照孔，每孔的終體積為100 μL，當(dāng)干預(yù)達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要后每孔加入10 μL CCK-8溶液并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處光密度（OD450）值，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 RTECs培養(yǎng)于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)接種于6孔板或12孔板中，并在適當(dāng)時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。對(duì)于DKD細(xì)胞模型的建立，將細(xì)胞分為3組：（1）對(duì)照（Control）組。使用低濃度（5.5 mmol/L）葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。（2）HG組。使用葡萄糖配置HG培養(yǎng)基（30 mmol/L）干預(yù)細(xì)胞作為DKD模型。（3）甘露醇（Mannitol）組。使用5.5 mmol/L葡萄糖和24.5 mmol/L甘露醇配置與HG組相同滲透壓的培養(yǎng)基，以排除HG的高滲透壓對(duì)細(xì)胞的影響。ZNF281的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中將RTECs分為以下4組：（1）Control組為5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞。（2）HG組為30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞。（3）HG+ZNF281 siRNA組為在HG誘導(dǎo)的RTECs中轉(zhuǎn)染ZNF281 siRNA。（4）HG+ZNF281 vector組為在HG誘導(dǎo)的RTECs中轉(zhuǎn)染ZNF281 siRNA相應(yīng)的陰性對(duì)照。AICAR對(duì)細(xì)胞的處理實(shí)驗(yàn)中將RTECs分為以下4組：（1）Control組為5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)。（2）HG組為30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞。（3）HG+AICAR組使用AICAR處理HG干預(yù)的RTECs。（4）HG+二甲基亞砜（DMSO）組在HG誘導(dǎo)的細(xì)胞中加入與配置AICAR所需的DMSO相應(yīng)濃度和劑量以排除AICAR配置液對(duì)細(xì)胞的影響。對(duì)于AICAR和轉(zhuǎn)染ZNF281過表達(dá)質(zhì)粒共處理實(shí)驗(yàn)中將RTECs分為2組：（1）AICAR+ZNF281 vector組為使用AICAR處理細(xì)胞并共轉(zhuǎn)染ZNF281過表達(dá)質(zhì)粒的相應(yīng)空載。（2）AICAR+ZNF281組為使用AICAR處理細(xì)胞并轉(zhuǎn)染ZNF281過表達(dá)質(zhì)粒。在干預(yù)24 h后收集細(xì)胞并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在6孔板或12孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)的密度達(dá)到約70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，使用銳博生物提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒并依據(jù)說明書進(jìn)行操作。使用緩沖液及siRNA、陰性參照或質(zhì)粒配制終濃度為20 nmol/L的轉(zhuǎn)染混合物，期間需輕柔震蕩并混勻，室溫孵育15 min后，依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過qPCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。用于轉(zhuǎn)染的ZNF281 siRNA的序列：5′-GTACTCTGGCAAATCAGAA-3′，其陰性參照序列為廣州銳博生物技術(shù)有限公司專利。

1.2.4 qPCR檢測(cè)ZNF281、EMT和ECM合成相關(guān)基因表達(dá)水平 使用TRIzol裂解細(xì)胞并提取總RNA，測(cè)定RNA濃度后，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)試劑盒說明書將總RNA定量并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 10 s，69 ℃ 30 s，循環(huán)40次。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s以構(gòu)建熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司構(gòu)建并進(jìn)行了驗(yàn)證，引物序列見表1。[Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.5 Western blot檢測(cè)ZNF281、AMPK、EMT和ECM相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞總蛋白的提取全程于冰上進(jìn)行，使用加入蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，刮下細(xì)胞并收集細(xì)胞懸浮液，隨后在4 ℃下以12 500×g高速離心20 min，收集上清液，測(cè)定蛋白濃度。制備好蛋白樣品并保存于-80 ℃冰箱內(nèi)或加載至預(yù)制好的凝膠中，調(diào)節(jié)電壓為160 V進(jìn)行電泳分離蛋白，約40 min后，使用快速免冰浴轉(zhuǎn)膜液將凝膠上的蛋白在300 mA恒定電流下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用脫脂奶粉配置封閉液并在室溫下封閉1 h，封閉結(jié)束后洗膜并加入配置好的一抗（配置比例均為1∶1 000），在4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，復(fù)溫并洗膜后加入相應(yīng)二抗（配置比例為1∶10 000），于室溫下孵育1 h，再次洗膜，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液并置于Bio-Rad凝膠成像儀下，使用Image Lab 4.0曝光并記錄蛋白條帶。使用ImageJ 1.53t分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，將對(duì)照組歸一化后計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次并合并分析蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 9.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用Sidak法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF281在HG誘導(dǎo)的RTECs中高表達(dá) CCK-8結(jié)果顯示，當(dāng)葡萄糖濃度為30 mmol/L時(shí)，干預(yù)24 h的RTECs增殖活力高于其他干預(yù)方案，見圖1。HG組RTECs中ZNF281、vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)量較Control組升高，E-cadherin表達(dá)水平降低（均P＜0.05），Mannitol組相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平較Control組無明顯變化，見圖2、表2。

2.2 敲低ZNF281可抑制HG誘導(dǎo)RTECs的EMT和ECM合成 與HG組相比，HG+ZNF281 siRNA組細(xì)胞中ZNF281表達(dá)水平降低，vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高（均P＜0.05），HG+ZNF281 vector組相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平與HG組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表3。CCK-8結(jié)果顯示，Control組、HG組、HG+ZNF281 siRNA組、HG+ZNF281 vector組OD450分別為0.64±0.06、1.78±0.03、1.37±0.07、1.85±0.09（F=269.400，P＜0.01），與HG組比較，HG+ZNF281 siRNA組細(xì)胞增殖活力降低（P＜0.05）。

2.3 激活A(yù)MPK可抑制HG誘導(dǎo)RTECs的EMT和ECM合成 Control組、HG組、Mannitol組p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平分別為1.00±0.05、0.66±0.13、1.02±0.14（F=9.025，P＜0.05）；與Control組比較，HG組p-AMPK/AMPK明顯下調(diào)（P＜0.05），AMPK失活，見圖4。進(jìn)一步在HG誘導(dǎo)的RTECs中使用AMPK激動(dòng)劑AICAR干預(yù)細(xì)胞，CCK-8結(jié)果顯示，Control組、HG組、HG+AICAR組、HG+DMSO組細(xì)胞OD450分別為0.57±0.04、1.64±0.08、1.22±0.12、1.66±0.19，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=71.470，P＜0.05）；與HG組相比，HG+AICAR組細(xì)胞增殖活力明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+AICAR組p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），AMPK活化；與HG組相比，HG+AICAR組vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），E-cadherin表達(dá)水平升高（P＜0.05），HG+DMSO組相關(guān)指標(biāo)較HG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4、圖5。

2.4 AMPK通過調(diào)控ZNF281抑制HG誘導(dǎo)RTECs的EMT和ECM合成 HG+AICAR組ZNF281的mRNA和蛋白表達(dá)水平較HG組降低（P＜0.05），見圖6、表4。進(jìn)一步在AICAR處理的RTECs中共轉(zhuǎn)染ZNF281，結(jié)果顯示，共處理組ZNF281表達(dá)水平較AICAR+ZNF281 vector升高，vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，E-cadherin表達(dá)水平降低（均P＜0.05），見表5、圖7；

CCK-8結(jié)果顯示，AICAR+ZNF281 vector細(xì)胞OD450為1.34±0.07，而共處理組的OD450為2.19±0.12，細(xì)胞增殖活力顯著升高（t=12.050，P＜0.05）。

3 討論

目前DKD在全球糖尿病患者中的發(fā)病率逐年上升［2］。TIF是各類慢性腎臟病進(jìn)展到ESRD的共同階段，早期并有效地減輕炎癥反應(yīng)，抑制EMT和減少ECM過度沉積，對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。有關(guān)ZNF281在腎臟病理中作用的研究報(bào)道尚少，其與TIF的發(fā)生發(fā)展關(guān)系不明確，本研究評(píng)估并確定了ZNF281在DKD模型中的表達(dá)水平及其敲低對(duì)DKD的影響，并初步探討了調(diào)控機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZNF281表達(dá)受AMPK控制，AMPK激活導(dǎo)致ZNF281表達(dá)下調(diào)，抑制了HG誘導(dǎo)的RTECs中EMT的發(fā)生和ECM過度沉積，并與細(xì)胞增殖活力降低相關(guān)。

ZNF281屬于Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，因含有指狀結(jié)構(gòu)域得名，廣泛分布于全身多個(gè)組織［16］。研究表明其與胚胎干細(xì)胞多能性、DNA損傷修復(fù)有關(guān)［9，17］。在DKD病理基礎(chǔ)中，上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征，運(yùn)動(dòng)性和侵襲性明顯增強(qiáng)，加速DKD進(jìn)展。目前為止轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug等被廣泛認(rèn)為是EMT調(diào)節(jié)的核心因子。研究證實(shí)原發(fā)性結(jié)直腸癌樣本中ZNF281的表達(dá)明顯上調(diào)，其失活可明顯抑制原癌基因誘導(dǎo)的EMT［18］。在小鼠纖維化結(jié)腸和經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的人源性結(jié)腸成纖維細(xì)胞中，ZNF281的表達(dá)明顯增加，且與成纖維細(xì)胞活化、分化相關(guān)途徑的基因表達(dá)存在關(guān)聯(lián)［19］。在炎癥性腸病中，ZNF281的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，沉默ZNF281可以明顯降低纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，并抑制炎癥因子釋放，緩解由炎癥引起的形態(tài)學(xué)改變［11］；而腎小管間質(zhì)炎癥是DKD病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［20］，因此筆者推測(cè)ZNF281可能是EMT調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要組成部分，在慢性腎臟病中同樣發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，具有成為DKD臨床診治新靶點(diǎn)的潛力。本研究結(jié)果顯示ZNF281在HG誘導(dǎo)的RTECs中表達(dá)水平明顯上調(diào)，進(jìn)一步探究ZNF281在HG誘導(dǎo)的RTECs中EMT和ECM合成的作用，在HG誘導(dǎo)的RTECs中敲低ZNF281可以明顯抑制EMT和ECM的合成，并與細(xì)胞增殖活力的降低密切相關(guān)。本研究為ZNF281在腎臟病領(lǐng)域作為EMT相關(guān)分子提供了新的證據(jù)。

高濃度的葡萄糖具有內(nèi)在毒性，可引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球系膜細(xì)胞增殖［21-22］。本研究使用HG誘導(dǎo)RTECs，通過CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，確定糖濃度為30 mmol/L并干預(yù)24 h作為DKD細(xì)胞模型誘導(dǎo)方案，成功建立了DKD細(xì)胞模型。AMPK作為代謝應(yīng)激中高度保守的能量平衡調(diào)節(jié)因子，在溶酶體表面感知葡萄糖，并進(jìn)一步磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控糖代謝、脂代謝及細(xì)胞增殖等過程［23］。AICAR是一種腺苷類似物，作為AMPK激動(dòng)劑可以調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧刺激和EMT的影響，并抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［24］。本研究結(jié)果顯示，在HG誘導(dǎo)的RTECs中，AICAR和ZNF281 siRNA的處理對(duì)于DKD細(xì)胞模型中的EMT和ECM合成存在類似的效應(yīng)。AMPK可以通過磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮效應(yīng)，因此筆者提出假設(shè)：AMPK通過調(diào)控ZNF281的表達(dá)進(jìn)而抑制EMT和ECM合成。在HG誘導(dǎo)的RTECs中使用AICAR處理后，ZNF281的表達(dá)水平明顯下調(diào)，確定AMPK對(duì)ZNF281的調(diào)控關(guān)系；在使用ZNF281過表達(dá)質(zhì)粒共處理后，AICAR對(duì)DKD細(xì)胞模型中EMT和ECM沉積的治療作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步表明AMPK通過ZNF281調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生和ECM合成。

綜上，本研究提供了ZNF281作為腎臟纖維化誘導(dǎo)因子的證據(jù)，確定AMPK與ZNF281的相互調(diào)控關(guān)系，AMPK通過負(fù)向調(diào)控ZNF281的表達(dá)來抑制HG誘導(dǎo)的RTECs中EMT的發(fā)生和ECM合成。上述結(jié)論加深了對(duì)TIF發(fā)展機(jī)制的理解，并為DKD臨床診治提供了理論依據(jù)。然而本研究仍存在一定不足，如ZNF281在DKD動(dòng)物模型中介導(dǎo)的效應(yīng)，以及ZNF281的下游作用靶點(diǎn)尚不清楚，期望能夠在后續(xù)的研究中有更多的發(fā)現(xiàn)。

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（2024-01-04收稿 2024-02-26修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）