于愛(ài)清 施永海 徐嘉波 劉永士 鄧平平

摘 要 生長(zhǎng)激素釋放激素（ GHRH）是魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素合成和分泌的重要調(diào)控因子，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化極為重要?；陂L(zhǎng)江刀鱭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用基因克隆和PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲得其? GHRH基因的cDNA全長(zhǎng)和基因組DNA序列，并開(kāi)展基因遺傳多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性研究，為其分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支持。結(jié)果顯示：長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因cDNA全長(zhǎng)1 329 bp，由5′-UTR（300 bp）、ORF（465 bp）和3′-UTR（564 bp）組成，推導(dǎo)的蛋白序列由154個(gè)氨基酸組成，具有一個(gè)信號(hào)肽和GLUCA結(jié)構(gòu)域；該基因的DNA序列長(zhǎng)2 983 bp，由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成，經(jīng)篩選，在第1、2內(nèi)含子和第3外顯子上分別篩選到9、2和1個(gè)SNP位點(diǎn)；12個(gè)突變位點(diǎn)共36種基因型，分別與100尾長(zhǎng)江刀鱭的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得2個(gè)與其生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)（g.1636C>T和g.1882A>C）（P<0.05），CC基因型均是優(yōu)勢(shì)基因型；利用12個(gè)SNP位點(diǎn)分析刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，獲得的觀測(cè)雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.270～0.620、0.338～0.490和0.281～0.370；哈迪-溫伯格平衡（HWE）檢測(cè)結(jié)果顯示，12個(gè)SNP位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.05）。結(jié)果表明，長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上位點(diǎn)g.1636C>T和g.1882A>C可以作為優(yōu)選長(zhǎng)江刀鱭繁育親本的重要候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 長(zhǎng)江刀鱭；? GHRH；單核苷酸多態(tài)性；生長(zhǎng)性狀；關(guān)聯(lián)分析

刀鱭（Coilia ectenes）隸屬于鯡形目（Clupeiformes）、鳀科（Engraulidae）、鱭屬（Coilia），在中國(guó)各大水系均能發(fā)現(xiàn)其蹤跡，其中以長(zhǎng)江流域產(chǎn)量最高，最負(fù)盛名，因其魚(yú)體豐腴肥滿(mǎn)，肉鮮味美，曾與鰣魚(yú)、河豚并稱(chēng)“長(zhǎng)江三鮮”，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞［1］。近年來(lái)，由于酷捕濫漁，棲息環(huán)境的污染、水文條件的改變、生態(tài)環(huán)境的惡化及海岸工程建設(shè)等諸多因素，其自然種質(zhì)資源急劇衰退，每年的漁獲量波動(dòng)很大，有的年份甚至不能形成優(yōu)勢(shì)種群［2］，岌岌可危。隨著長(zhǎng)江“十年禁捕”政策的實(shí)施及長(zhǎng)江刀鱭人工繁育、養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟，其自然種質(zhì)資源衰退的現(xiàn)狀獲得了緩解，但是在其養(yǎng)殖群體中仍然存在個(gè)體表型差異大、生長(zhǎng)速度變慢、商品魚(yú)規(guī)格小以及新品種匱乏等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的推廣，亟需對(duì)長(zhǎng)江刀鱭生長(zhǎng)性狀進(jìn)行遺傳改良。

水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀是受多種環(huán)境因素和遺傳因素共同影響的，而遺傳因素往往能夠反應(yīng)出不同個(gè)體/群體種質(zhì)差異，這亦是本研究進(jìn)行分子標(biāo)記輔助長(zhǎng)江刀鱭生長(zhǎng)性狀遺傳改良的重要理論基礎(chǔ)。分子標(biāo)記輔助育種是利用分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的特點(diǎn)，對(duì)具有性狀優(yōu)勢(shì)的等位基因或基因型的個(gè)體進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，是將分子生物學(xué)和遺傳育種有機(jī)結(jié)合的新品種選育技術(shù)［3-5］，不僅提高了選擇的準(zhǔn)確性，降低了育種成本，而且加快了良種的選育進(jìn)程，特別適用于繁育周期比較長(zhǎng)的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的良種選育。鑒于目前長(zhǎng)江刀鱭分子標(biāo)記輔助育種尚處于初始階段，篩選更多與其生長(zhǎng)性狀相關(guān)的重要SNP標(biāo)記，對(duì)其新品系的選育研究極為重要。

生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone-releasing hormone，GHRH），是由脊椎動(dòng)物下丘腦分泌的一種能夠刺激動(dòng)物腦垂體細(xì)胞分泌生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）的多肽類(lèi)物質(zhì)，具有免疫調(diào)控、睡眠調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及代謝調(diào)控等生物學(xué)功能［6-7］。禽畜類(lèi)? GHRH基因的啟動(dòng)子區(qū)域、編碼區(qū)域及非翻譯區(qū)均存在與其生長(zhǎng)速度、品質(zhì)及脂肪含量等性狀密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)，被作為禽畜類(lèi)良種選育的重要候選基因。水產(chǎn)動(dòng)物? GHRH基因多態(tài)性亦與其生長(zhǎng)性狀存在顯著相關(guān)性，如北極紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis）? GHRH基因第4內(nèi)含子區(qū)域［8］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）? GHRH基因第3內(nèi)含子區(qū)域［9］、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）? GHRH基因第2，3，4內(nèi)含子和第3外顯子區(qū)域［6］、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）? GHRH基因第4內(nèi)含子區(qū)域［7］及紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）? GHRH基因外顯子區(qū)域［10］上均鑒定到了與其生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記，并初步應(yīng)用于相應(yīng)水產(chǎn)動(dòng)物的分子標(biāo)記輔助育種實(shí)踐。而養(yǎng)殖長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，亟需進(jìn)行相關(guān)研究以加速其良種的培育進(jìn)程。本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因進(jìn)行克隆、擴(kuò)增和測(cè)序，開(kāi)展基因遺傳多態(tài)性SNP位點(diǎn)的篩選、檢測(cè)及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，以期能夠?yàn)殚L(zhǎng)江刀鱭的分子標(biāo)記輔助育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用長(zhǎng)江刀鱭均取自上海市水產(chǎn)研究所（上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站）奉賢科研基地于2017年獲得的長(zhǎng)江刀鱭核心選育群體（F3）。隨機(jī)選取3尾二齡刀鱭置于冰上放置1～2 min，迅速將腦組織解剖分離，并用無(wú)菌DEPC水沖洗后，迅速放入液氮速凍30 min，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，用于長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的cDNA全長(zhǎng)克隆。隨機(jī)選取100尾同批次同池塘飼養(yǎng)二齡長(zhǎng)江刀鱭，用游標(biāo)卡尺和電子天平測(cè)得其平均體長(zhǎng)為 （21.89 ± 4.51） cm、平均體高為（3.40±? 0.74） cm、平均體質(zhì)量為（39.83±22.73） g，剪取部分尾鰭置于盛有95%乙醇的? 1.5 mL離心管中，分別編號(hào)后，置于-20 ℃冰柜中保存，用于長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因DNA序列擴(kuò)增、SNP位點(diǎn)篩選及其遺傳多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析。隨機(jī)選取大規(guī)格雌性刀鱭（99.18 g±12.81 g）、小規(guī)格雌性刀鱭（16.10 g±0.26 g）、大規(guī)格雄性刀鱭（59.75 g±3.19 g）和小規(guī)格雄性刀鱭（18.90 g±0.44 g）各3尾，置于冰上放置1～2 min，迅速將腦組織解剖分離，并用無(wú)菌DEPC水沖洗后，置入液氮速凍30 min，再轉(zhuǎn)移至-80? ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，用于長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的相對(duì)表達(dá)量變化研究。

1.2 總RNA和DNA的提取

長(zhǎng)江刀鱭腦組織總RNA的提取均參照Trizol Reagent Kit（RNA Extraction Kit，Invitrogen）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。獲得的總RNA，溶解于DEPC水后，利用NanoVue Plus紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。將質(zhì)量較好的RNA（28S和18S條帶清晰，且28S和18S灰度比約為2∶1、無(wú)拖尾現(xiàn)象、點(diǎn)樣孔的附近無(wú)殘留，表明RNA無(wú)降解，質(zhì)量可靠）置于-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

長(zhǎng)江刀鱭基因組DNA的提?。好總€(gè)樣品取25 mg左右的鰭條組織，經(jīng)滅菌ddH2O清洗后，剪碎并置于1.5 mL離心管中，參照天根生化科技（北京）有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（DP324-03）說(shuō)明書(shū)，提取樣品基因組DNA；利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue Plus紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)樣本DNA的質(zhì)量和濃度；經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示無(wú)拖尾降解現(xiàn)象、條帶清晰，且OD260 nm/OD280 nm的比值在1.8～2.0的DNA樣品，稀釋到50 ng/μL后，置于-20 ℃冰柜中保存，備用。

1.3 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因cDNA全長(zhǎng)克隆和表達(dá)分析

1.3.1 cDNA第一鏈的合成 長(zhǎng)江刀鱭腦組織所提取的總RNA經(jīng)測(cè)定質(zhì)量和濃度后，按照PrimeScriptTM Real-time PCR Kit試劑盒（Takara公司，北京）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得用于長(zhǎng)江刀鱭cDNA序列拼接所需的cDNA模板，利用NanoVue Plus紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板濃度，用RNase free water將終濃度同一調(diào)整為200 ng/μL后，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 5′-RACE和3′-RACE cDNA模板的合成 參照SMARTerTM? RACE cDNA Amplification Kit（Takara公司，北京）說(shuō)明書(shū)，獲得長(zhǎng)江刀鱭腦組織3′-和5′-末端的cDNA模板，然后利用NanoVue Plus紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板濃度，最后用Tricine-EDTA Bufffer將該模板稀釋至500 ng/μL，置于-20? ℃保存，備用。

1.3.3 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因cDNA全長(zhǎng)的克隆 基于上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地課題組長(zhǎng)江刀鱭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得CeGHRH的部分? cDNA序列，并利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)基因特異性引物（CeGHRH-QC）（表1），對(duì)CeGHRH的部分cDNA序列拼接質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證?；跍y(cè)序驗(yàn)證后的序列，設(shè)計(jì)特異性RACE引物（5′GSP-1～3和3′GSP-1～3），以反轉(zhuǎn)錄合成的長(zhǎng)江刀鱭腦組織5′-cDNA或3′-cDNA為模板，利用SAMRT-RACE技術(shù)獲得CeGHRH的cDNA全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的條帶割膠純化，并進(jìn)行T-A克隆測(cè)序，測(cè)序菌液經(jīng)菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，交由上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序（測(cè)序所用引物為23-Mer和24-Mer）。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以大規(guī)格/小規(guī)格的雌、雄長(zhǎng)江刀鱭腦組織cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的表達(dá)差異情況?；陂L(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1），利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Green）在StepOne Plus熒光定量PCR儀（ABI，美國(guó)）上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照該試劑盒說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣品做3次技術(shù)重復(fù)，以長(zhǎng)江刀鱭β-actin為內(nèi)參基因，利用 2-ΔΔCt法計(jì)算長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4? CeGHRH基因組DNA的擴(kuò)增和SNP位點(diǎn)篩選

基于長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性PCR擴(kuò)增引物（表1），其中CeGHRH-FL是參照大西洋鯡? GHRH基因內(nèi)含子和外顯子的相對(duì)位置設(shè)計(jì)而成，用于擴(kuò)增? CeGHRH基因的第1內(nèi)含子、第2內(nèi)含子和第3內(nèi)含子序列；CeGHRH-SC則以? CeGHRH基因的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)而成，然后以具有極端生長(zhǎng)表型的不同刀鱭（即體質(zhì)量最大的10尾魚(yú)和最小的10尾魚(yú)）的DNA樣本為模板，利用直接測(cè)序法篩選長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上的多態(tài)性SNP位點(diǎn)。

1.5?? CeGHRH基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

基于初步的多態(tài)性SNP位點(diǎn)篩選結(jié)果，前8個(gè)SNP位點(diǎn)由于間隔較近而不適合應(yīng)用SnaPshot方法進(jìn)行基因分型，因此采取直接測(cè)序的方法對(duì)100尾長(zhǎng)江刀鱭進(jìn)行基因分型；后面4個(gè)SNP位點(diǎn)則委托上海捷瑞生物工程有限公司利用SnaPshot基因分型技術(shù)對(duì)100尾長(zhǎng)江刀鱭進(jìn)行基因分型，基于基因分型結(jié)果，利用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型對(duì)不同SNP位點(diǎn)的不同基因型與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6 群體遺傳分析和連鎖不平衡分析

基于12個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，計(jì)算不同位點(diǎn)不同基因型的基因頻率和基因型頻率，利用GenAlEx 6.5軟件［11］計(jì)算長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的有效等位基因數(shù)（effective number of alles，NE）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，HO）和期望雜合度（expected heterozygosity，HE）等遺傳多樣性參數(shù)，并對(duì)12個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)；利用PIC_CALC軟件計(jì)算試驗(yàn)群體中每個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）；利用Haploview 4.2軟件［12］對(duì)12個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因序列特征分析

長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因cDNA全長(zhǎng)1 329 bp，開(kāi)放式閱讀框（Open Reading Frame，ORF）全長(zhǎng)465 bp，編碼154個(gè)氨基酸（主要由1個(gè)信號(hào)肽和GLUCA結(jié)構(gòu)域組成），其中5′-非編碼區(qū)主要由300個(gè)核苷酸組成，3′-非編碼區(qū)主要由564個(gè)核苷酸組成（圖1）。利用PCR擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)獲得? CeGHRH基因全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為2 983 bp，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成（圖2）。

2.2 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因表達(dá)分析

在雌性長(zhǎng)江刀鱭中，大規(guī)格長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的mRNA表達(dá)量是小規(guī)格的2.04倍；在雄性刀鱭中，大規(guī)格長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因的mRNA表達(dá)量是小規(guī)格長(zhǎng)江刀鱭的2.24倍（圖3），表明長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因?qū)τ陂L(zhǎng)江刀鱭雌雄群體的生長(zhǎng)表型均具有正向調(diào)控作用。

2.3 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

以20尾具有極端生長(zhǎng)表型長(zhǎng)江刀鱭的DNA為材料，利用直接測(cè)序法在長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上共檢測(cè)到12個(gè)SNP突變位點(diǎn)（具體位置見(jiàn)圖2），其中第1內(nèi)含子上9個(gè)（g.552A>G、g.562A>T、g.592C>G、g.711A>T、g.748C>T、g.865G>T、g.875C>G、g.966A>T和g.1636C>T）；第2內(nèi)含子上2個(gè)（g.1882A>C和g.1937C>T）；第3外顯子上1個(gè)（g.2092A>G）。

長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上的12個(gè)突變位點(diǎn)共36種基因型，分別與100尾長(zhǎng)江刀鱭的生長(zhǎng)性狀（體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定到2個(gè)與長(zhǎng)江刀鱭生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)（表2）。從中可以看出，位點(diǎn)g.1636C>T 3種基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高的比較結(jié)果一致，均是CC>CT>TT，其中CC型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高性狀高于CT型的，顯著高于TT型的（P<0.05）；位點(diǎn)g.1882A>C的3種基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高的比較結(jié)果基本一致，均是CC>AC>AA，CC型顯著高于其他兩種基因型（P<0.05）。

2.4 長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

基于長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上的12個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示（表3），有效等位基因數(shù)（NE）為? 1.510～1.962，觀測(cè)雜合度（HO）和期望雜合度（HE）分別為0.270～0.620和0.338～0.490，多態(tài)信息含量（PIC）為0.281～0.370，12個(gè)SNP位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)（0.25T、g.875C>G、g.966A>T和g.2092A>G）均顯著偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.05），其余位點(diǎn)則符合哈迪-溫伯格平衡（P>0.05）。

2.5 連鎖不平衡分析

利用Haploview 4.2軟件對(duì)長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上的12個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析（圖4），結(jié)果顯示，位點(diǎn)g.552A>G、g.562A>T、g.592C>G、g.711A>T和g.748C>T處于完全連鎖狀態(tài)，組成Block1，與其他位點(diǎn)處于彼此獨(dú)立的狀態(tài)；位點(diǎn)g.865G>T、g.875C>G和g.966A>T處于完全連鎖狀態(tài)，組成Block2，與位點(diǎn)g.1636C>T處于非完全連鎖狀態(tài)（D′0.33），與位點(diǎn)g.1882A>C處于非完全連鎖狀態(tài)（D′>0.8但r2<0.33），位點(diǎn)g.1636C>T和位點(diǎn)g.1882A>C處于非完全連鎖狀態(tài)（D′>0.8但r2<0.33），其他兩兩位點(diǎn)間處于彼此獨(dú)立的狀態(tài)。

3 討? 論

GHRH作為GH/IGF生長(zhǎng)軸信號(hào)通路中的重要成員，能夠與生長(zhǎng)激素釋放激素受體結(jié)合，通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶/cAMP/蛋白激酶信號(hào)通路和NO/NO合成酶信號(hào)通路促進(jìn)生長(zhǎng)激素的合成和分泌［7］，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育。該基因上鑒定到的突變位點(diǎn)，往往與家養(yǎng)的產(chǎn)奶率［13］、屠宰率［14］、日增重和脂肪厚度［15］和生長(zhǎng)性狀［16］等經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)，而被用于相關(guān)經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良研究。魚(yú)類(lèi)? GHRH基因的研究從前期的基因克隆、表達(dá)模式研究［17-19］，逐漸擴(kuò)展到基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析研究［6-7，10］，并開(kāi)展了相關(guān)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性狀遺傳改良的育種實(shí)踐。在長(zhǎng)江刀鱭中，基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究報(bào)道相對(duì)較少，因此，本研究中首次發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。

3.1 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因多態(tài)性對(duì)其生長(zhǎng)性狀的影響

本研究從長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上總共鑒定到12個(gè)突變位點(diǎn)，其中2個(gè)位點(diǎn)（g.1636C>T和g.1882A>C）與其生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。位點(diǎn)g.1636C>T中CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)、體高和體質(zhì)量性狀均顯著高于TT基因型個(gè)體（PC中CC基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高性狀均顯著高于其他兩種基因型（P<0.05），可以作為長(zhǎng)江刀鱭分子標(biāo)記輔助育種的重要參考位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)SNP位點(diǎn)均位于長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因內(nèi)含子，雖然內(nèi)含子不具有編碼氨基酸的能力，但是發(fā)生在其他生長(zhǎng)相關(guān)基因內(nèi)含子上的突變位點(diǎn)亦導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)性狀發(fā)生顯著差異［20］，如斑點(diǎn)叉尾鮰（I.punctatus）MSTN基因第2內(nèi)含子上的1個(gè)突變位點(diǎn)與其體質(zhì)量、體長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)（P<0.05）［21］；長(zhǎng)江刀鱭（C.ectenes）MSTN基因第1內(nèi)含子上的1個(gè)突變位點(diǎn)與其體長(zhǎng)、體高和體質(zhì)量性狀顯著相關(guān)（P

3.2 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

連鎖不平衡是指同一染色體上等位基因間廣泛存在的非隨機(jī)組合現(xiàn)象［6，23］。連鎖不平衡的強(qiáng)度經(jīng)常用D′（表示重組程度）和r2（表示重組和突變的程度）來(lái)評(píng)估，當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)的D′>0.8時(shí)，表明兩個(gè)位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，r2>0.33，表明兩個(gè)位點(diǎn)緊密連鎖；當(dāng)同時(shí)滿(mǎn)足D′>0.8且r2>0.33時(shí)，表明兩位點(diǎn)處于完全連鎖狀態(tài)，經(jīng)常會(huì)作為一個(gè)整體進(jìn)行遺傳［6，24-25］。在本研究中，位點(diǎn)g.552A>G、g.562A>T、g.592C>G、? g.711A>T和g.748C>T處于完全連鎖狀態(tài)（D′>0.8且r2>0.33），組成Block1，這5個(gè)位點(diǎn)作為一個(gè)整體進(jìn)行遺傳，與其他位點(diǎn)屬于獨(dú)立遺傳關(guān)系；位點(diǎn)g.865G>T、g.875C>G和? g.966A>T處于完全連鎖狀態(tài)（D′>0.8且r2>0.33），組成Block2，這3個(gè)位點(diǎn)作為一個(gè)整體進(jìn)行遺傳，而與其它位點(diǎn)處于非完全連鎖狀態(tài)? （D′>0.8但r2<0.33）或彼此獨(dú)立狀態(tài)（D′T和? g.1882A>C）處于非完全連鎖狀態(tài)（D′>0.8但r2<0.33），因此綜合這2個(gè)位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，篩選出具有優(yōu)異基因型的繁育親本，對(duì)于長(zhǎng)江刀鱭良種的培育具有重要的參考價(jià)值。

3.3? 長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因座的群體遺傳變異分析

雜合度（HO和HE）和多態(tài)性信息含量（PIC）是衡量群體遺傳變異程度的重要參考指標(biāo)［26］，對(duì)于長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評(píng)估具有重要作用。在本研究中，12個(gè)SNPs位點(diǎn)對(duì)于長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性評(píng)估結(jié)果顯示，觀測(cè)雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.270～0.620、0.338～? 0.490和0.281～0.370，表明長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體仍然具有豐富的遺傳變異和較好的種質(zhì)開(kāi)發(fā)潛力?；贐otstein等［27］提出的多態(tài)信息含量（PIC）的判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)PIC<0.25、0.250.5時(shí)，分別代表該位點(diǎn)具有低度、中度、高度多態(tài)性。在本研究中，12個(gè)SNP位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)? （0.25

4 結(jié)? 論

長(zhǎng)江刀鱭? GHRH基因上共檢測(cè)到12個(gè)SNP位點(diǎn)，具有較豐富的突變和遺傳多態(tài)性，在其第1、2內(nèi)含子上成功鑒定到2個(gè)與其生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)（g.1636C>T和g.1882A>C），對(duì)長(zhǎng)江刀鱭的體長(zhǎng)、體高和體質(zhì)量均有較為顯著的影響，且CC基因型均是優(yōu)勢(shì)基因型，可以用來(lái)輔助長(zhǎng)江刀鱭生長(zhǎng)性狀的遺傳改良；其他SNP位點(diǎn)雖然與長(zhǎng)江刀鱭的生長(zhǎng)性狀沒(méi)有顯著的相關(guān)性，但是可以用于長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評(píng)估。

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Growth Hormone Releasing Hormone （GHRH） Gene PolymorphismsAssociated with Growth Traits in Coilia ectenes

YU Aiqing，SHI Yonghai，XU Jiabo，LIU Yongshi and DENG Pingping

（Shanghai Fisheries Research Institute， Shanghai Fisheries Technology Extension Station， Shanghai 200433，China）

Abstract

To assess the association of polymorphisms of?? GHRH? gene with the growth-related traits in Coilia ectenes， we cloned the cDNA full-length sequence and DNA sequence of?? GHRH? gene， and further identified and validated single nucleotide polymorphisms （SNPs） in this gene . Based on the transcriptome data of C.ectenes， the cDNA full-length sequence and DNA sequence of?? GHRH? gene were obtained by gene cloning technology. SNPs in?? GHRH? gene were identified and genotyped in 100 individuals by DNA direct sequencing and SnaPshot method， respectively. Least squares method was used for association analysis between SNPs and growth traits in C.ectenes. Total cDNA length of?? GHRH? gene of C.ectenes was 1? 329 bp， containing a 5′-UTR of 300 bp， 3′-UTR of 564 bp and an open reading frame of 465 bp. The precursor peptide of GHRH contained 154 amino acids （aa），which included a signal peptide of 19 aa and a GLUCA domain of 27 aa. The genomic DNA of?? GHRH? gene was?? 2 983 bp in length and contained four introns and five exons. Twelve polymorphic sites （SNPs） were identified in intron 1 （9）， intron 2 （2） and exon 3 （1）. Two SNPs of g.1636C>T in intron 1 and g.1882A>C in intron 2 were significantly associated with the body length， body height and body? mass? traits （P<0.05）， while the other sites were not significantly associated with all three growth traits （P>0.05）. Population genetic analysis of cultured population of C.ectenes showed that， among these twelve SNPs， the observed heterozygosity （HO）， expected heterozygosity （HE） and polymorphism information content （PIC） were 0.270-0.620， 0.338-0.490 and 0.281-0.370， respectively. This study provides useful information for further studies on genetic evaluation of germplasm resources and marker assisted selection （MAS） in C.ectenes.

Key words Coilia ectenes；GHRH；Growth trait；Single nucleotide polymorphism；Association analysis

Received? 2022-06-28??? Returned 2022-09-11

Foundation item The Natural Science Foundation of Shanghai （No.19ZR1477900）；Shanghai Agriculture Applied Technology Development? Program，China[Grant No.G（2016）-6-2-2].

First author YU Aiqing， male， senior engineer. Research area：aquaculture， aquatic animal genetic and breeding. E-mail：aiqingyu0125@163.com

Corresponding?? author SHI Yonghai， male， research fellow. Research area：aquaculture， water environment monitoring and aquatic animal reproductive biology. E-mail：yonghais@163.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）