李超　楊寬　李孟芝　李丹霞　黃顯章

摘要：研究哈茨木霉對半夏莖腐病的防治效果，進(jìn)一步運(yùn)用高通量測序的方法檢測了哈茨木霉對半夏根際微生物群落的影響，以期揭示哈茨木霉防治半夏莖腐病的微生態(tài)機(jī)制。設(shè)置2個濃度的哈茨木霉菌液對半夏進(jìn)行灌根，處理3個月后檢測不同處理下半夏莖腐病的發(fā)病率，利用高通量測序技術(shù)研究不同處理下半夏根際微生物的群落多樣性、結(jié)構(gòu)和組成差異。經(jīng)哈茨木霉處理后的半夏莖腐病發(fā)病率明顯降低，其中HC-200處理的半夏莖腐病發(fā)病率較CK顯著降低54.55%（P<0.05）。成功分離并通過形態(tài)學(xué)和序列比對鑒定半夏莖腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。施加哈茨木霉后極顯著降低了細(xì)菌ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)（P<0.01），說明半夏根際細(xì)菌群落的多樣性極顯著降低。同時，施加哈茨木霉也降低了鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、小不整球殼菌屬（Plectosphaerella）和錐蓋傘菌屬（Conocybe）的相對豐度。鐮刀菌屬和木霉菌屬（Trichoderma）的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果在一定程度上揭示了哈茨木霉防治半夏莖腐病的機(jī)制是通過抑制半夏根際土壤中鐮刀菌屬真菌的增殖來實現(xiàn)的。結(jié)果可為哈茨木霉運(yùn)用到半夏莖腐病的田間防治上提供重要參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：哈茨木霉；半夏；莖腐?。簧谰?；根際微生物

中圖分類號：S567.23+9.06；S435.672文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0165-08

半夏［Pinellia ternata （Thunb.） Breit.］為天南星科半夏屬多年生草本植物，具有燥濕化痰、降逆止嘔等功效，廣泛分布于我國長江流域和黃淮流域等地區(qū)［1-2］。長期以來，中藥材半夏主要來源于野生資源，但由于市場需求的增加以及野生半夏自然生長環(huán)境被人為破壞，致使野生半夏資源十分匱乏，已經(jīng)無法滿足市場的需要。因此，我國科研工作者從20世紀(jì)70年代開始研究半夏的人工栽培技術(shù)，初獲成功后，半夏的人工栽培在各個適宜產(chǎn)區(qū)逐步展開［3］。

野生半夏常生長于草地、荒地、田邊、河邊及疏林下，適宜生長的溫度為15～25 ℃，喜歡溫暖潮濕的環(huán)境但懼怕高溫［3］。將野生半夏人工馴化栽培后，由于原始生境的改變，經(jīng)常會出現(xiàn)一些生長障礙或病害問題，特別在高溫高濕的環(huán)境中，半夏易受病原菌的侵染而導(dǎo)致葉部或莖部病害，其中比較典型且發(fā)病率較高的一種病害為半夏莖腐病，該病害會導(dǎo)致半夏塊莖部分或全部腐爛，危害嚴(yán)重且防治困難［4-6］。目前，半夏莖腐病的防治主要利用化學(xué)藥劑，然而使用農(nóng)藥灌根或土壤熏蒸等殺滅土壤中病原菌的措施未能取得良好的防治效果，反而引起環(huán)境污染、農(nóng)殘超標(biāo)等安全性問題［7-8］。因此，亟需尋找一條安全可靠的綠色防控措施。

半夏莖腐病是由植物病原菌侵染引起的一種侵染性病害［4］，這類病害具有很強(qiáng)的傳染性，導(dǎo)致發(fā)病的病原菌可能是細(xì)菌也可能是真菌，在條件適宜時萌發(fā)并侵染植物不同部位導(dǎo)致植物病害的發(fā)生［9］，為了抵御病原菌的侵染，研究人員利用生防菌來抑制病原菌的生長和繁殖，這種方法被稱為生物防治，由于該方法具有成本低、環(huán)保且無藥物殘留等優(yōu)點，一直是國內(nèi)外防治植物病害的研究熱點［10-13］。有研究者利用生物菌肥對半夏軟腐病和太子參白絹病進(jìn)行防治并取得了較好的防治效果［8，14］。另外，研究者發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉菌對辣椒根腐病、甜瓜枯萎病、黃芩立枯病等具有不錯的防治效果［15-17］。目前，利用生防細(xì)菌防治半夏根腐病的研究已有報道，而哈茨木霉對半夏根腐病的防治效果鮮有研究，因此本研究擬對哈茨木霉對半夏莖腐病的防治效果進(jìn)行研究，同時進(jìn)一步探究哈茨木霉對半夏根際微生物群落的影響，以期揭示哈茨木霉防治半夏莖腐病的微生態(tài)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試半夏球莖

供試半夏種球來自河南省南陽市唐河縣唐半夏種植示范基地（32°46′07″N，113°8′48″E）。

1.1.2 供試哈茨木霉菌劑

哈茨木霉菌劑（有效活菌數(shù)≥10億CFU/g）購自鄭州中科化工產(chǎn)品有限公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

半夏根腐病病原菌分離培養(yǎng)基［馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基］：稱取200 g去皮的馬鈴薯，切成小塊，加入1 000 mL水加熱煮沸，0.5 h后，將紗布對折6～8層后過濾汁水；在過濾后的汁水中加入20 g葡萄糖、15 g瓊脂粉，混合后放入鍋中邊攪邊煮，直至葡萄糖和瓊脂完全溶解后，將煮沸的液體倒入燒杯中，加水定容至 1 000 mL。然后使用高壓蒸汽滅菌鍋，在121 ℃下滅菌20 min后降壓冷卻至常溫，分裝至培養(yǎng)皿中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

盆栽試驗地點為南陽理工學(xué)院張仲景藥用植物園試驗基地，篩選大小一致的半夏球莖于2023年4月11日開始栽種到花盆中（上口直徑為15 cm），每個花盆栽種5株半夏，一共栽種60盆，分為3個處理：處理1施用稀釋200倍的哈茨木霉菌液（HC-200）；處理2施用稀釋400倍的菌液（HC-400）；處理3施用等量的無菌水（CK），每個處理分配20盆半夏。調(diào)查半夏根腐病發(fā)病率時按照30株半夏為1個重復(fù)，每個處理調(diào)查3個重復(fù)。半夏栽種完畢后每隔半個月進(jìn)行1次哈茨木霉菌液處理，CK施用等量的無菌水灌根。

1.2.2 半夏根腐病發(fā)病率的調(diào)查以及半夏根際土的取樣

不同哈茨木霉處理3個月后，調(diào)查不同處理下半夏根腐病發(fā)病率。在每個處理中調(diào)查90株半夏，并將其分為3個重復(fù)，每個重復(fù)包含30株半夏。半夏根腐病的發(fā)病率計算公式如下：

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)／調(diào)查總株數(shù)）×100%。

按照Wei等描述的方法［18］收集了每個處理組（來自健康植物）的土壤樣本。簡單地說，將從每6個花盆中取樣的土壤混合成1個重復(fù)，每個土壤水分處理收集3個重復(fù)的土壤樣本。用無菌刷收集緊密附著在半夏根上的土壤，分裝到無菌塑料袋中，用冰袋放在保存箱中，然后運(yùn)回實驗室。在實驗室中，土壤樣品用2 mm的網(wǎng)孔進(jìn)行篩分，以去除動植物殘留物、礫石和其他雜質(zhì)，處理完畢后收集到 5 mL 的無菌離心管中，然后放入-80 ℃低溫冰箱中保存以供接下來的DNA提取和進(jìn)一步分析。

1.2.3 半夏莖腐病病原菌的分離和鑒定

半夏莖腐病病原菌分離的具體操作步驟如下：首先將發(fā)病半夏球莖用無菌水沖洗干凈，然后再用10%次氯酸溶液浸泡5 min，再用75%乙醇溶液泡30 s，接著用無菌水漂洗3次，然后用滅菌手術(shù)刀在病健交界處切取5 mm3大小的組織放到滅菌濾紙上面，吸取多余水分，之后放到PDA培養(yǎng)基上，每皿分4塊區(qū)域放置，用封口膜封存，最后放入20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)病組織塊邊緣長出菌絲后，用接種針對菌絲進(jìn)行分離，然后進(jìn)行2次轉(zhuǎn)皿純化。分離純化得到的菌株用斜面保存管保存，然后放到4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

半夏莖腐病病原菌的鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定：取純化好的病原菌，活化至新的PDA培養(yǎng)基上，分別放置在合適的溫度下靜置培養(yǎng)1星期，在菌絲生長期間觀察其菌落的大小、形態(tài)和顏色等。待菌絲長滿培養(yǎng)皿，用接種針挑取少量菌絲和分生孢子于載玻片上，觀察分生孢子的大小和形態(tài)。分子鑒定：使用試劑盒提取需要鑒定菌株的總基因組DNA，然后使用通用引物ITS1/ITS4、LR0R/LR5分別擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和28S nrDNA（LSU）的基因序列［19］。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。使用MEGA-X軟件和鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［20］。

1.2.4 半夏根際微生物的高通量測序和分析

使用Illumina Noveseq測序平臺對9個樣品的細(xì)菌16S rRNA的 V4～V5區(qū)和真菌 ITS1 rDNA的ITS1區(qū)進(jìn)行測序。細(xì)菌擴(kuò)增引物為515F/907R［21］，真菌引物為ITS1F/ITS2R［22］。樣品交由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。測序完畢后，對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，過濾低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量序列；將高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類，劃分OTU，并根據(jù)特征（Feature）的序列組成得到其物種分類；基于Feature分析結(jié)果，對樣品在各個分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析。進(jìn)一步使用mothur（http：//www.mothur.org/）軟件評估樣本的α多樣性指數(shù)，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)。使用QIIME（v1.8.0）軟件分析基于Bray-Curtis算法的β多樣性，并使用R軟件（v3.6.0）繪制主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果。在BMKCloud（www.biocloud.net）上進(jìn)行上述分析和圖形的繪制。。

1.2.5 統(tǒng)計分析

使用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey檢驗來評估半夏莖腐病發(fā)生率、α多樣性指數(shù)和微生物相對豐度在不同處理之間的顯著差異。使用 Spearman 相關(guān)系數(shù)用于分析半夏根際微生物群落中各物種之間的相關(guān)關(guān)系。所有統(tǒng)計分析均使用IBM-SPSS軟件進(jìn)行。運(yùn)用R軟件中的ggplot2包和GraphPad Prism 8.3.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉對半夏莖腐病的防治效果

試驗處理3個月后對不同處理組半夏莖腐病的發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見圖1。可以看出，經(jīng)哈茨木霉處理后的半夏莖腐病發(fā)病率明顯降低，其中 HC-200 處理的半夏莖腐病發(fā)病率顯著低于CK，較CK顯著降低54.55%（P<0.05），HC-400處理的發(fā)病率有所降低但與CK差異未達(dá)到顯著水平。

2.2 半夏莖腐病病原菌的分離和鑒定

采用組織分離法，從5個半夏莖腐病病樣中分離出5株菌落形態(tài)相近的菌株?；亟咏】档陌胂那蚯o后均能使半夏發(fā)生腐爛癥狀。分離菌株在培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，菌落呈現(xiàn)白色，菌絲密集旺盛，背面呈淡黃色，容易產(chǎn)孢。分生孢子多是大型孢子，形狀為鐮刀形或橢圓形，兩端尖鈍圓形。根據(jù)菌落和分生孢子形態(tài)初步鑒定分離的病原菌為鐮刀屬（Fusarium）真菌（圖2）。為進(jìn)一步鑒定該病原菌的種屬，隨機(jī)選取1株分離菌株（BXGF-01）對其ITS和LSU基因序列進(jìn)行測序，結(jié)果表明，BXGF-01的ITS序列與腐皮鐮刀菌的模式菌株CBS：140079的相應(yīng)序列具有99.83%的相似度，BXGF-01的LSU序列與菌株CBS：204.31的相應(yīng)序列具有99.65%的相似度。使用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，BXGF-01與腐皮鐮刀菌菌株聚集在同一分支上（圖3）。根據(jù)形態(tài)學(xué)和序列比較結(jié)果，可以確定半夏莖腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。

2.3 哈茨木霉處理對半夏根際微生物群落的影響

2.3.1 哈茨木霉處理對半夏根際真菌和細(xì)菌群落多樣性的影響

由圖4和圖5可知，對于ACE指數(shù)，在真菌群落多樣性上3種處理均沒有顯著差異；在細(xì)菌群落多樣性上，CK的ACE指數(shù)極顯著高于2種哈茨木霉菌液處理（P<0.01）。Chao1指數(shù)表現(xiàn)出與ACE指數(shù)相似的趨勢，3種處理之間真菌群落的Chao1指數(shù)沒有顯著差異，而在細(xì)菌群落中CK的Chao1指數(shù)極顯著高于HC-200和HC-400處理。HC-400處理的真菌群落Shannon指數(shù)顯著高于CK，極顯著高于HC-200處理，同樣的，HC-400處理的真菌多樣性在Simpson指數(shù)上也為最高，其次是CK，這2個處理極顯著高于HC-200處理。對于細(xì)菌群落的Shannon和Simpson指數(shù)而言，CK極顯著高于HC-200和 HC-400 處理。綜上，低濃度的哈茨木霉（HC-400）處理能顯著提高半夏根際真菌群落的Shannon指數(shù)，高濃度（HC-200）處理極顯著降低真菌群落的Simpson指數(shù)。對于細(xì)菌群落而言，2種濃度的哈茨木霉菌液均會大幅降低半夏根際細(xì)菌群落的多樣性，具體表現(xiàn)在Shannon、Chao1、Simpson和ACE指數(shù)的極顯著降低。

2.3.2 哈茨木霉處理對半夏根際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

PCoA結(jié)果表明，在3種處理中，根際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均存在顯著差異（細(xì)菌，R2=0.888，P=0.005；真菌，R2=0.920，P=0.006）（圖 6-A、圖6-B）。在群落組成上，對相對豐度前10個真菌和細(xì)菌屬進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，哈茨木霉處理對半夏根際細(xì)菌群落有顯著影響。施加哈茨木霉后，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Allorhizobium_Neorhizobium_Pararhizobium_Rhizobium）和諾卡氏菌屬（Nocardioides）等屬的相對豐度顯著減低，而褚氏桿菌屬（Chujaibacter）和噬幾丁質(zhì)科未知屬（unclassified_Chitinophagaceae）的相對豐度顯著增加（圖6-C）?？傮w而言，哈茨木霉的施加顯著影響了半夏根際細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌屬類型和豐度。對于真菌群落而言，施加哈茨木霉后，鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、酵母菌未知屬（unclassified_Saccharomycetales）、Albifimbria、Pyxidiophora等屬的相對豐度顯著降低，青霉菌屬（Penicillium）和木霉菌屬（Trichoderma）的相對豐度則顯著增加（圖6-D）。其中，鐮刀菌屬真菌是半夏莖腐病發(fā)生的主要致病因子，并且在CK中相對豐度為最高的一類菌，施加哈茨木霉后顯著抑制了該類真菌的增殖。

2.3.3 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

選取相對豐度最高的前20個真菌屬進(jìn)行斯皮爾曼秩相關(guān)分析并篩選相關(guān)性大于0.1且P＜0.05的數(shù)據(jù)構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。從圖7可以看出，木霉菌屬的相對豐度與鐮刀菌屬（Gibellulopsis）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與白鬼傘屬（Leucocoprinus）呈顯著正相關(guān)關(guān)系。半夏莖腐病病原菌所在屬的鐮刀菌屬和木霉菌屬、Galactomyces、白鬼傘屬呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Gibellulopsis、Albifimbria呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

利用生防菌防治植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中一種常見的病害防治方法，由于其安全無毒、無污染、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點已經(jīng)應(yīng)用到越來越多的作物種植過程中［23-24］。對于藥用植物半夏來說，桂穎等篩選出3種生防細(xì)菌的混合生防菌劑BBS（寧盾）并驗證了該菌劑對半夏軟腐病的防治效果，結(jié)果表明，寧盾對半夏具有明顯的防病效果［8］。唐晨等從健康的半夏根際土中分離篩選到2株對半夏軟腐病菌具有良好拮抗效果的生防菌，這2株菌均被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［25］。除了生防細(xì)菌，許多拮抗真菌已被廣泛用作生防菌劑來對抗各種植物病原真菌［26］，其中木霉菌是迄今為止研究最廣泛的真菌生防制劑［27］。本研究探究了哈茨木霉對半夏莖腐病的防治效果，結(jié)果表明，經(jīng)哈茨木霉處理后的半夏莖腐病發(fā)病率明顯降低，其中HC-200處理的半夏莖腐病發(fā)病率顯著低于CK。本研究初步證實了哈茨木霉對半夏莖腐病的防治效果。

為揭示哈茨木霉對半夏莖腐病的防治機(jī)制，本研究首先分離鑒定了半夏莖腐病的病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定以為半夏莖腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌（F. solani）。石建龍等對貴州半夏塊莖腐爛病病原菌的分離與鑒定結(jié)果表明，現(xiàn)半夏莖腐病的病原菌包括腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和一些病原細(xì)菌［28］，推測半夏莖腐病的發(fā)病是一種復(fù)合侵染，可以由單一真菌引起，也可由細(xì)菌和真菌2類病原菌復(fù)合侵染。為進(jìn)一步探究哈茨木霉對半夏根際微生物的影響，筆者對半夏根際土進(jìn)行了高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉處理顯著降低了半夏根際細(xì)菌群落的多樣性，高濃度的HC-200處理極顯著降低了真菌群落的Simpson指數(shù)（均勻度）。番華彩等比較了香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病植株的土壤細(xì)菌群落多樣性高于健康植株［29］，而對于半夏來說，其根際細(xì)菌多樣性的高低與半夏莖腐病發(fā)病率之間的相關(guān)關(guān)系則需要進(jìn)一步研究揭示。

哈茨木霉處理后可以顯著降低鐮刀菌屬真菌的相對豐度，鐮刀菌屬真菌為半夏莖腐病病原菌的直接來源，這在一定程度上可以揭示哈茨木霉防治半夏莖腐病的機(jī)制是通過抑制半夏根際土壤中鐮刀菌屬真菌的增殖來實現(xiàn)的。同時，哈茨木霉的施用也降低了小不整球殼菌屬（Plectosphaerella）真菌的相對豐度，有研究表明，小不整球殼菌屬中的某些真菌是番茄萎蔫病和三七根腐病的病原菌［30-31］。相反，施用哈茨木霉后增加了青霉屬（Penicillium）的相對豐度，青霉屬真菌也是一類植物病害潛在的生防菌［32］。通過相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，木霉菌屬的相對豐度和鐮刀菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，和白鬼傘屬呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明哈茨木霉的施用可以顯著抑制鐮刀菌屬真菌的增殖。本研究結(jié)果為哈茨木霉進(jìn)一步運(yùn)用到半夏莖腐病的田間防治上奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-11-11

基金項目：河南省科技攻關(guān)項目（編號：212102310349）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-21）。

作者簡介：李 超（1987—），男，河南南陽人，博士，副教授，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用。E-mail：lichaotcm@126.com。

通信作者：黃顯章，博士，教授，研究方向為中藥材品質(zhì)評價。E-mail：nylgxyhxz@126.com。