項(xiàng)鵬　楊樹(shù)　李寶華　李艷杰　李紅鵬　鹿文成　栗銘徽　張武

摘要：于2021年在黑龍江省黑河市從大豆根際土壤中分離獲得1株對(duì)大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)具有較高活性的放線(xiàn)菌 XFS-4，為了解該生防放線(xiàn)菌XFS-4對(duì)大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的作用機(jī)理，以黑河市主栽大豆品種黑河43為試材，用 XFS-4 發(fā)酵液做種子包衣處理，盆栽條件下人工接種大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)，以未接種作對(duì)照，接種后 4、7、11、14 d取樣，測(cè)定大豆葉內(nèi)抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性變化。同時(shí)，以抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)，分析該基因在菌株XFS-4包衣黑河43后抗大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)過(guò)程中的表達(dá)差異，從基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上對(duì)大豆抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因（Gm-Apx）進(jìn)行研究，以發(fā)現(xiàn)該基因與大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)（SCN）抗性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，XFS-4包衣黑河43接種大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)4、7 d后，APX活性明顯高于對(duì)照，接種條件下的黑河43 APX活性隨大豆生長(zhǎng)一直升高。在接種大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)后，其菌株XFS-4包衣黑河43處理組中，Gm-Apx相對(duì)表達(dá)量在接種后4、7 d表達(dá)上調(diào)，而在接種11、14 d表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明該基因參與了大豆早期防御胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的侵染過(guò)程，對(duì)植物抗性反應(yīng)及解除脅迫誘導(dǎo)的氧化損害起了很重要的作用。

關(guān)鍵詞：放線(xiàn)菌；大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)；抗壞血酸過(guò)氧化物酶；RT-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.651文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）09-0159-06

大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)（SCN）是大豆根部病害之一，被認(rèn)為是造成大豆減產(chǎn)的主要原因，可導(dǎo)致大面積減產(chǎn)，危害十分嚴(yán)重［1-2］。在我國(guó)可造成1.2億元的經(jīng)濟(jì)損失［3］，在全球范圍內(nèi)損失約為15億美元［4］。黑龍江省黑河市是我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)，2022年大豆播種面積達(dá)143.86萬(wàn)hm2［5］，大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)當(dāng)前大豆的安全生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，一般發(fā)病田減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%～50%，在開(kāi)花前后發(fā)生可引起死苗甚至造成絕產(chǎn)［6］。

為振興我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)，2019年3月，國(guó)家啟動(dòng)了“大豆振興計(jì)劃”，主要目標(biāo)是“一擴(kuò)兩提”，其中：“擴(kuò)”就是擴(kuò)大面積，力爭(zhēng)到2022年全國(guó)大豆種植面積達(dá)到933.33萬(wàn)hm2；“提”就是提高單位面積產(chǎn)量、提升品質(zhì)，力爭(zhēng)到2022年全國(guó)大豆平均產(chǎn)量達(dá)到135 kg/667 m2［7］。有效防控大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)危害，減少損失，提單位面積產(chǎn)量、提品質(zhì)是大豆振興計(jì)劃的重要環(huán)節(jié)。

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黑河分院植保室在前期工作中，從大豆根際土壤中分離獲得1株對(duì)大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)具有較高活性的放線(xiàn)菌XFS-4，包衣處理后對(duì)苗期大豆第一代大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)抑制率達(dá)到59.77%，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)測(cè)定及16S rDNA序列同源性分析，確定該菌株為沙阿霉素鏈霉菌［8］。為了解生防放線(xiàn)菌XFS-4對(duì)大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的作用機(jī)理，本研究以合成關(guān)鍵酶抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因序列設(shè)計(jì)引物，大豆黑河43和菌株 XFS-4 為試材，利用酶活測(cè)定和RT-PCR分析菌株XFS-4包衣黑河43后，在接種大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)前后抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性的變化和基因表達(dá)量的變化，初步明確菌株XFS-4對(duì)大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)抗性過(guò)程中抗壞血酸過(guò)氧化物酶的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大豆品種黑河43號(hào)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黑河分院提供；供試生防菌株XFS-4保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黑河分院植保室；供試大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)3號(hào)生理小種取自筆者研究室試驗(yàn)基地。

1.2 菌株發(fā)酵液的制備

將保存好的菌株XFS-4接種在高氏一號(hào)平面培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。將平板上培養(yǎng)好的菌落接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 三角瓶振蕩培養(yǎng)7d后過(guò)濾，獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液置于4 ℃冰箱中備用［9］。

1.3 種子處理方法

用5% NaClO溶液對(duì)大豆種子進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗5次。用制備好的發(fā)酵液按1%的種子量進(jìn)行種子包衣處理，待干燥后裝袋、編號(hào)備用［10］。

1.4 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的制備

采用改良淘洗-過(guò)篩法從采取的土樣中分離胞囊，在體視鏡下挑取新鮮、飽滿(mǎn)、成熟、均一的胞囊。胞囊先用0.5%NaClO溶液進(jìn)行消毒，再用無(wú)菌水沖洗5次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行孵化，將孵化后得到的2齡幼蟲(chóng)制備成200條/mL的懸浮液［11］。

1.5 大豆材料的播種與接種

將XFS-4發(fā)酵液包衣好的黑河43種子播種在16 cm×16 cm的黑色塑料缽中，缽中裝有滅菌沙土（50%細(xì)沙，50%有機(jī)土壤），以未包衣的黑河43作對(duì)照。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出2張子葉時(shí)，將制備好的2齡幼蟲(chóng)懸浮液進(jìn)行接種，每株接種10 mL，以無(wú)菌水接種作對(duì)照。

1.6 取樣方法

分別在接種4、7、11、14 d后取樣，處理組和對(duì)照組分別取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗3株，用自來(lái)水快速?zèng)_洗葉部，再用蒸餾水洗凈，濾紙吸干后，記錄好處理、對(duì)照標(biāo)簽分別放入收集袋中，液氮冷凍，-80 ℃保存。每個(gè)處理3次獨(dú)立的重復(fù)。

1.7 酶粗提液的提取

提取緩沖液為50 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含2 mmol/L AsA和5 mmol/L EDTA）。參照沈文飚等的方法［12］提取。稱(chēng)取1.0 g大豆葉片樣品放入研缽中，加入2.0 mL提取緩沖液和少量石英砂充分研磨，用3.0 mL上述提取緩沖液沖洗研缽和研柞，將沖洗液和勻漿一起轉(zhuǎn)入離心管中。4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液即為酶粗提液。將酶粗提液放入冰箱中-20 ℃保存，待測(cè)定酶活。

1.8 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定

測(cè)定反應(yīng)液為50 mmol/L pH值7.0磷酸緩沖液（內(nèi)含0.5 mmol/L AsA、0.1 mmol/L H2O2和 0.1 mmol/L EDTA-Na2）。參照沈文飚等的方法［12］測(cè)定。室溫下1 min 1 g鮮質(zhì)量氧化1 μmol ASA的酶量作為1個(gè)酶活性單位（U），酶活力以D290 nm/（min·g） FW表示。

APX活性（U/g FW）=（（ΔD290 nm×提取液體積（mL））/（樣品質(zhì)量（g）×加酶體積（mL） ×t（min）））。

1.9 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）基因表達(dá)量分析

1.9.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取，RNA D260 nm/D280 nm 值在 2.0～2.2的范圍內(nèi)。將1 μg總RNA 加入微量離心管中并于70 ℃溫育10 min，短暫離心后置于冰上，加入試劑建立一個(gè)20 μL的反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系置于42 ℃溫育60 min、95 ℃加熱5 min、5 ℃放置 5 min。

1.9.2 引物設(shè)計(jì)

APX基因在GeneBank的登錄號(hào)為NM_001251432.2，根據(jù)該序列利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-GGTGCTGTAGGAGTTGTAG-3′，下游引物為5′-AAAGTCTGAATGGCTGTG-3′，基因片段為216 bp。內(nèi)參基因上游引物為5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′，下游引物為5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′，基因片段為126 bp。引物合成由哈爾濱生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.9.3 PCR反應(yīng)條件

APX基因：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃充分延伸10 min。

1.9.4 RT-PCR反應(yīng)條件

95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（熒光采集1次），95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)時(shí)，為了盡可能減少因加樣引起的處理間及重復(fù)間的誤差，根據(jù)試驗(yàn)要求盡可能先混合樣品再分裝。每個(gè)樣品的相對(duì)表達(dá)量的值等于目的基因的表達(dá)量均值減去內(nèi)參基因的表達(dá)量均值，應(yīng)用比較CT值法（2-ΔΔCT）進(jìn)行基因表達(dá)的相對(duì)定量計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XFS-4接種大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)后根內(nèi)抗壞血酸過(guò)氧化物酶的變化

從圖1可以看出，在接種SCN情況下，菌株XFS-4包衣黑河43的APX活性高于對(duì)照，隨大豆生長(zhǎng)呈先升高后下降趨勢(shì)。接種條件下的黑河43，其APX活性隨大豆生長(zhǎng)一直升高，說(shuō)明植株在線(xiàn)蟲(chóng)的侵染下，APX活性持續(xù)升高防御植物細(xì)胞外界氧化脅迫，而XFS-4包衣后的黑河43在7 d后開(kāi)始下降。所以，抗壞血酸過(guò)氧化物酶的活性變化在XFS-4處理大豆抗大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的過(guò)程中起重要作用。

2.2 樣品RNA的提取

取大豆樣品1 μL 總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可以清晰分辨28S rRNA和18S rRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)得濃度較好，符合進(jìn)一步RT-PCR的要求（圖2）。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的特異性（圖3至圖6），Gm-Apx基因和Gm-Actin基因的凝膠電泳結(jié)果都僅有1條電泳條帶，均得到特異性擴(kuò)增目的產(chǎn)物。其中A1-H3和I1-P3是指16個(gè)處理3次重復(fù)，共48個(gè)上樣樣品。

2.4 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到216 bp的片段，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)分析表明，與已報(bào)道序列NM_001251432具有高同源性，相似度100%。結(jié)果如下：5′-GGTGCTGTAGGAGTTGTAGTTACTGCCGCAGTGGTGATCATCAGTTACTTGTATGAAGTTCGCAAAAGAGGGAAGTAAACTGGACTTGTTCATTTCACTTGGCTGTTACGTTTGCGTGACCCTGACCCATAATGTGAAAACAGGGTTCATTTTTGCAGCTTCAGATTCTGTTTACTTAGTACCAATAAAGAATAATGCCACAGCCATTCAGACTTT

-3′。

2.5 Gm-Apx和Gm-Actin基因的熒光定量曲線(xiàn)分析

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)中涉及的主要參數(shù)分析，目的基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，熔解曲線(xiàn)的峰型單一（圖7、圖8），內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，溶解曲線(xiàn)的峰型單一（圖9、圖10），說(shuō)明樣品的質(zhì)量較高，引物的特異性較好，無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，內(nèi)參基因和目的基因的Tm值分別為84.5、83.5 ℃。

2.6 Gm-Apx基因的相對(duì)定量表達(dá)分析

綜合分析Real-time PCR的結(jié)果，大豆根內(nèi)Gm-Apx基因響應(yīng)SCN的侵染，在各處理中響應(yīng)的方式相似，接種前后的同期樣本中該基因的相對(duì)表達(dá)量差值整體上均出現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢(shì)，但表達(dá)效率不同。在接種無(wú)菌水4、7、11、14 d后，Gm-Apx基因在菌株XFS-4包衣黑河43處理組中的相對(duì)表達(dá)量分別為黑河43對(duì)照中表達(dá)量的0.79、0.85、0.51、0.97倍（圖11），即菌株XFS-4包衣的黑河43在未接種線(xiàn)蟲(chóng)的情況下，其Gm-Apx的表達(dá)下調(diào)。

Gm-Apx在接種大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)侵染后的4、7、11、14 d，其菌株XFS-4包衣黑河43處理組中相對(duì)表達(dá)量分別為黑河43對(duì)照中表達(dá)量的1.46、1.08、0.87、0.92倍（圖12），即在接種后4、7 d表達(dá)上調(diào)，而在接種11、14 d表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明該基因受到線(xiàn)蟲(chóng)侵染的誘導(dǎo)表達(dá)，參與了大豆早期防御胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的侵染過(guò)程。

3 討論與結(jié)論

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是降解過(guò)氧化氫的關(guān)鍵酶，能提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強(qiáng)抗氧化代謝的水平，是提高植物抗逆性的有效途徑之一。近年來(lái)，關(guān)于APX基因功能的研究主要集中在植物抗逆方面，目前多種植物的APX基因在誘導(dǎo)抗性方面的作用已有報(bào)道。在非生物脅迫條件下，水稻、白樺中APX基因表達(dá)上調(diào)［13-14］。Park等在甘薯中成功克隆到swAPX1基因，研究發(fā)現(xiàn)swAPX1基因在受到外界非生物脅迫時(shí)，其表達(dá)量均明顯升高，說(shuō)明了swAPX1基因在清除甘薯葉片中的過(guò)氧化氫方面發(fā)揮了重要作用，從而有利于植株克服非生物和生物脅迫造成的氧化損傷［15］。Shi等研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下，轉(zhuǎn)大麥APX基因的擬南芥葉片正常，而非轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片出現(xiàn)大量枯黃［16］。Kornyeyev等獲得了轉(zhuǎn)葉綠體APX基因的棉花植株，APX在植物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)，其葉片中APX活性比野生型的提高5倍［17］。Caldwell等研究大豆cAPXs中觀察到，APX的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后調(diào)控可增強(qiáng)大豆抵抗環(huán)境脅迫的能力［18］。Sarowar等將辣椒APX基因轉(zhuǎn)入煙草，同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫與抗真菌能力［19］。Li等向煙草中轉(zhuǎn)入過(guò)氧化物酶體APX基因，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱耐鹽能力［20］。Yabuta等研究表明，在轉(zhuǎn)基因煙草中，葉綠體APX在清除活性氧體系中發(fā)揮著很重要的作用，它保證了葉片的葉組織在水循環(huán)和光合作用中維持能量［21］。方濤等以O(shè)sApx7和OsApx8突變本為材料，證實(shí)了水稻葉綠體APX，特別是APX8，在水稻對(duì)抗干旱的逆境中發(fā)揮著重要的作用［22］。邵振啟等以水稻抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因OsApx2為轉(zhuǎn)化對(duì)象，獲得轉(zhuǎn)OsApx2大豆，抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性等干旱指標(biāo)及產(chǎn)量相關(guān)性狀測(cè)定表明OsApx2超表達(dá)能夠顯著提高大豆的耐旱性［23］。

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了Gm-Apx基因在菌株XFS-4包衣黑河43后抗大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)過(guò)程中的表達(dá)差異，從基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上對(duì)Gm-Apx進(jìn)行研究，以發(fā)現(xiàn)該基因與SCN抗性之間的關(guān)系。綜合分析Real-time PCR的結(jié)果，在接種線(xiàn)蟲(chóng)后，菌株XFS-4包衣的黑河43在4、7 d 時(shí)，Gm-Apx基因的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，分別為對(duì)照的1.46、1.08倍，這表明在接種后的前期，由于線(xiàn)蟲(chóng)的入侵，造成寄主細(xì)胞破壞，誘導(dǎo)了胞內(nèi) H2O2 的增加，繼而導(dǎo)致了Gm-Apx基因表達(dá)上調(diào)；接種后11、14 d，Gm-Apx表達(dá)下降，分別為對(duì)照的0.87、0.92倍。這可能一方面是 H2O2 濃度下降，另一方面由于活性氧對(duì)植物自身具有一定的損害作用，植物自身啟動(dòng)了限制活性氧生成的機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆在受到線(xiàn)蟲(chóng)侵染時(shí)，菌株XFS-4能夠誘導(dǎo)Gm-Apx的表達(dá)，對(duì)植物抗性反應(yīng)及解除脅迫誘導(dǎo)的氧化損害起了很重要的作用。

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收稿日期：2023-03-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CARS-04）；農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)性長(zhǎng)期性工作植保中心愛(ài)輝試驗(yàn)點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：NAES-PP-033）；黑龍江省第二批“揭榜掛帥”科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2021ZXJ05B011）。

作者簡(jiǎn)介：項(xiàng) 鵬（1986—），男，黑龍江肇州人，碩士，助理研究員，主要從事植物線(xiàn)蟲(chóng)學(xué)研究。E-mail：xp_303@126.com。

通信作者：張 武，碩士，副研究員，主要從事大豆病蟲(chóng)害研究。E-mail：guoguo_zw@163.com。